大鼠觸須毛囊上段再生的體外培養(yǎng)

周玲聰，鄧 楊2#，陳 碾*，廖俊琳，曾 麗

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院美容整形外科，湖南 衡陽 421001；2.常德湘雅醫(yī)院整形美容科，湖南 常德 415000)

近年來，隨著工作壓力、環(huán)境改變和遺傳等因素的變化，脫發(fā)特別是雄激素性脫發(fā)的患者日漸增多。目前，對于脫發(fā)的治療有很多種方法，臨床上常用一些外用藥物和口服藥物治療脫發(fā)，但是其臨床效果欠佳，特別是對已脫發(fā)區(qū)域不能長出新的毛囊及毛發(fā)，且藥物的長期使用具有一定副作用。而對于治療毛發(fā)缺損的區(qū)域的主要方法是自體毛發(fā)移植術。毛發(fā)移植技術都是涉及重新分配病人現(xiàn)有的頭發(fā)。因為自體毛發(fā)數(shù)量是有限的，毛發(fā)移植過程中總數(shù)量并沒有發(fā)生變化，所以毛囊再生及其機制的研究成為目前迫切需要解決的問題。本實驗擬通過構建毛囊上段體外再生模型，為毛囊切割后再生研究提供一個良好的實驗平臺。通過對毛囊上段再生的深入研究，揭示毛囊上段再生的機制，提高毛囊上段移植成活率，從而達到“毛囊數(shù)量倍增”，對于解決臨床毛發(fā)移植術中毛囊供體不足或其他器官移植問題都有非常大的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周SD雄性大鼠20只由長沙天勤公司提供，體重250～400 g，晝夜節(jié)律規(guī)律，室溫為(22 ± 2)℃，自由進食和取水。適應環(huán)境1周。

1.1.2 主要試劑與儀器 MEM培養(yǎng)液(minimum Eagle’s medium)、Williams E培養(yǎng)液(wilLiam’s medium)、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)(Gibco，美國)，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)、胰島素生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)(甄準生物，上海)，青鏈霉素(碧云天生物，上海)，一抗α-SMA兔抗小鼠多克隆抗體(alpha smooth muscle actin，α-SMA)(Abcam 公司)，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱，倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)液配置(總量50 mL)Ⅰ號培養(yǎng)液：無血清Williams E培養(yǎng)液50 mL；Ⅱ號培養(yǎng)液：MEM培養(yǎng)液47.50 mL+2.50 mL胎牛血清；Ⅲ號培養(yǎng)液：無血清Williams E培養(yǎng)液49.85 mL+100 μL EGF+50 μL IGF-1；Ⅳ號培養(yǎng)液：MEM培養(yǎng)液47.35 mL+2.50 mL胎牛血清+100 μL EGF+50 μL IGF-1；Ⅴ號培養(yǎng)液：無血清Williams E培養(yǎng)液35.33 mL+100 μL EGF+50 μL IGF-1+14.52 mL DHT；Ⅵ號培養(yǎng)液：MEM培養(yǎng)液32.83 mL+2.50 mL胎牛血清+100 μL EGF+50 μL IGF-1+14.52 mL DHT。50 mLⅠ號～Ⅵ號培養(yǎng)液中均加入0.5 mL青/鏈霉素混合液，封口膜包裹，標記，4 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 毛囊上段組織模型構建 SD大鼠予以水合氯醛腹腔麻醉滿意后，斷頸處死。將大鼠放入裝有75%酒精的燒杯中消毒，移至超凈工作臺上的托盤中，沿著毛囊平行走向將大鼠的觸須部嘴唇組織切成細條狀，用顯微器械分離得到單個生長期毛囊組織，去除毛囊周圍組織(包括脂肪組織及其他真皮組織)，注意避免損傷到毛囊。緊貼毛球部上方用刀片將其橫向切除，并拔除毛囊的毛發(fā)，最終得到大鼠觸須毛囊上段標本。取6個培養(yǎng)皿，分別加入6種不同培養(yǎng)液，將得到的大鼠觸須毛囊上段隨機分成6組放入其中；裝入96孔培養(yǎng)板中，標記，再每孔分別加入Ⅰ號～Ⅵ號培養(yǎng)液2 mL，放入37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)2周并觀察。

1.2.3 主要檢測指標 在光學顯微鏡下觀察其生長情況，并統(tǒng)計毛囊再生個數(shù)。相關標本制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察。標本酶標免疫組化檢測，觀察α-SMA在毛囊新生組織中的表達情況。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計學方法采用多個樣本率的卡方檢驗及各實驗組與同一個對照組的比較，分析各實驗組與對照組的再生率差異是否有統(tǒng)計學意義。由于樣本量不足，即期望計數(shù)小于5，采取Fisher精確檢驗，以檢驗水準P′<0.005為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 毛囊上段大體形態(tài)結構

將生長期的單個毛囊組織去除周圍脂肪組織及其他真皮組織，鑷子輕輕夾住毛囊上端并擠壓，可見紅色的含毛乳頭的毛球部突出于膠原外殼(圖1A)，緊貼毛球部上方用刀片將其橫向切除，下端的切緣平整光滑(圖1B)。拔除毛囊上段的毛發(fā)后，可見毛囊含有兩根毛發(fā)，粗長的是杵狀毛，細短的為毛干(圖1C)。觀察得到的毛囊上段組織，可見其組織稍微軟化，但形態(tài)完好，下端切緣平整。

2.2 再生毛囊上段倒置顯微鏡下形態(tài)結構

6組不同培養(yǎng)液中的大鼠觸須毛囊上段組織在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，隔日換液，并在倒置顯微鏡下觀察毛囊上段大體結構，未再生的毛囊上段組織下端在倒置顯微鏡下觀察可見切緣光滑平整(圖2A-B)，具有再生狀態(tài)的毛囊上段組織可見切緣不再平整，并向外凸出，切斷痕跡并不明顯(圖2C-D)。

2.3 毛囊上段與再生毛囊上段組織HE染色

毛囊上段組織底部的切緣平整，虛線所示的為毛囊底部切除的部位，該部位緊貼毛球部上方(圖3A)，毛囊中間形成空腔間隙(圖3B)。毛囊上段組織體外培養(yǎng)后第4天，外根鞘細胞增殖并填充拔除毛發(fā)后留下的空腔，部分外根鞘細胞突出到玻璃膜底部切緣之外(圖3C)。培養(yǎng)第9天，外根鞘細胞和真皮鞘細胞繼續(xù)增殖，部分真皮鞘細胞移動到底部外根鞘中，毛囊斷端被新生的結締組織包裹形成鞘狀，結締組織鞘基本規(guī)則，但新生成的結締組織鞘細胞數(shù)較少，沒有形成新的毛乳頭(圖3D)。

圖2 毛囊上段組織在倒置顯微鏡下形態(tài)結構觀察A-B：未再生組織；C-D：再生組織

圖3 再生毛囊上段組織HE染色A：完整毛囊組織；B：毛囊上段組織；C：第4天毛囊上段組織；D：第9天毛囊上段組織

2.4 α-SMA在再生毛囊上段中的表達模式

α-SMA一般表達在毛囊底部臨近玻璃膜的真皮鞘細胞和小部分毛乳頭細胞中。體外培養(yǎng)后的毛囊上段組織，再生增殖的部分由真皮鞘細胞移動到底部外根鞘中，α-SMA在毛囊下段的再生的真皮鞘細胞中有表達，陽性顆粒分布于胞漿中，呈棕黃色，如圖中箭頭所示(圖4)。

圖4 α-SMA在再生毛囊上段中的表達模式

2.5 大鼠觸須毛囊上段再生情況統(tǒng)計

將6組不同培養(yǎng)液中的大鼠觸須毛囊上段在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4天后，在普通光學顯微鏡下觀察并統(tǒng)計具有再生狀態(tài)的毛囊上段個數(shù)。每組16個毛囊上段組織，共重復實驗6次。以第Ⅵ組為對照組，第Ⅰ組～第Ⅴ組為室驗組，采用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，第Ⅰ組～第Ⅴ組與第Ⅵ組相比差異具有統(tǒng)計學意義。即在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后的毛囊上段組織顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在6種不同培養(yǎng)液中，5%FCS MEM+10-7mmol/LDHT+10 ng/mL IGF-1+20 ng/mL EGF的培養(yǎng)液條件下毛囊上段的再生率最高。因此，5%FCS MEM+10-7mmol/LDHT+10 ng/mL IGF-1+20 ng/mL EGF培養(yǎng)液為本研究中最適合大鼠觸須毛囊上段再生的體外培養(yǎng)液。

表1 各實驗組與對照組毛囊上段體外培養(yǎng)再生比率的比較 (個，%)

按P′=0.005(P′=P/2(k-1)，k為樣本率的個數(shù))檢驗水準，第Ⅰ組～第Ⅴ組P′<0.005與第Ⅵ組相比

3 討 論

毛囊是哺乳動物的特有結構，是重要的皮膚附屬器官，主要的作用是維持毛發(fā)的生長，其次對動物的外形及熱量的維持也具有重要作用。目前關于毛囊生長變化的調控機理尚不十分明確，但已明確某些細胞因子參與了毛發(fā)的生長調控[1]，其中包括EGF和IGF-1。相關研究表明，IGF-1能夠刺激毛囊的生長，可通過反轉錄-聚合酶鏈式反應發(fā)現(xiàn)真皮乳頭細胞有IGF-1mRNA的表達[2]。IGF-1對毛囊生長的調節(jié)主要體現(xiàn)在它能調控不同生長周期上皮角化細胞的增殖和分化，從而減少毛囊細胞的凋亡，延長毛囊體外生長時間[3]。EGF是細胞生長周期的外源性調節(jié)因子，可誘導體外培養(yǎng)的毛囊的生長發(fā)生變化，從而促進外根鞘細胞增殖[4]，國內研究發(fā)現(xiàn)，利用毛囊體外培養(yǎng)技術，分析不同濃度IGF-1、EGF及二者合用對毛囊體外生長的影響，結果表明基礎培養(yǎng)液中聯(lián)合添加10 ng/mL IGF-1和20 ng/mL EGF與基礎培養(yǎng)液及其它濃度梯度相比更能刺激體外毛囊培養(yǎng)的生長。EGF還可誘導IGF-1的表達，從而使IGF-1在正常細胞和轉化細胞中表達增加[5-6]。

毛發(fā)的生長及更新受到多種激素的調節(jié)，雄激素在其中扮演了一個非常重要的角色。雄激素主要包括睪酮、雄烯二酮和脫氫表雄酮，睪酮是雄激素最主要的形式，毛囊主要通過5α還原酶將睪酮轉化為DHT來參與毛發(fā)的生長調節(jié)[7]。根據(jù)人體不同部位，雄激素對人類毛囊生長發(fā)育有不同的影響，雄激素能刺激胡須、腋窩和陰毛等部位的毛發(fā)生長，抑制人體前額頭發(fā)的生長[8]。雄激素受體在胡須、腋窩和額葉頭皮中均有表達，而在枕部頭皮毛囊中未檢測到雄激素受體[9]，不同部位的毛囊可能通過改變雄激素的活性水平從而調控毛發(fā)的生長。相關研究表明，雄激素性脫發(fā)患者血DHT濃度高于正常對照組，通過降低血DHT濃度后，脫發(fā)現(xiàn)象得到改善。但在2型5α還原酶缺失的男性假兩性畸形患者中，因無法產生有活性的雄激素，這些患者雖不會產生雄激素性脫發(fā)改變，但也僅有極少量的胡須生長[10]。這說明了一定水平有活性的雄激素對于維持正常的毛囊周期和毛發(fā)生長是十分必要的[11]。相關實驗通過體外毛囊培養(yǎng)探究不同濃度DHT對毛發(fā)生長的影響，最終得出DHT濃度降低到10-7mol/L時可促進毛囊生長，毛囊毛母質細胞增殖活性強，毛囊生長期延長[12]。

α-SMA是毛囊真皮結構的標志性分子，主要表達在毛乳頭及真皮鞘。作為毛乳頭及真皮鞘細胞的特異性標志分子，一般表達在毛囊底部靠近玻璃膜的真皮鞘細胞和小部分毛乳頭細胞中[13]。當毛囊由休止期進入到生長期時，毛乳頭細胞并不進行分裂，而是由與之相鄰的真皮鞘細胞運動到毛乳頭中對其進行補充[14]。在毛乳頭和真皮鞘中均可檢測到α-SMA，表明這兩者之間有一定的同源性。

目前很多研究者關于毛囊的體外保存培養(yǎng)液的選擇及溫度的設定做了相當多的研究[15]。他們通過對比在0 ℃、4 ℃以及26 ℃的溫度下，林格氏液、DMEM等培養(yǎng)液保存離體毛囊不同時間后的毛囊活性，結果得出，0 ℃為體外保存毛囊的合適溫度，且林格氏液優(yōu)于DMEM培養(yǎng)液，但體外保存時間最遲不能超過48 h，最好是在24 h之內，毛囊活性在24 h后隨著時間的延長不斷降低。國外學者Thajeb等[16]通過實驗證明了離體的器官組織發(fā)生細胞凋亡的原因主要是生長因子的缺乏以及氧自由基的產生。吳磊等[17]通過實驗證明了體外培養(yǎng)毛囊Williams E培養(yǎng)液優(yōu)于林格氏液。唐建兵等[18]通過比較毛囊體外保存培養(yǎng)液Williams E培養(yǎng)液及含血清的DMEM培養(yǎng)液，結果表明Williams E培養(yǎng)液優(yōu)于含血清的DMEM培養(yǎng)液。所以，無血清Williams E培養(yǎng)液是適合離體毛囊體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液。唐瑤等[19]通過實驗來比較不含血清、含5%FCS以及含10%FCS的DMEM、MEM培養(yǎng)液中最適合小鼠觸須毛囊外根鞘體外再生的培養(yǎng)液，結果表明，含5%FCS的MEM培養(yǎng)液是最適合小鼠觸須毛囊外根鞘體外再生的培養(yǎng)液?；谏鲜鰧嶒灒狙芯繉o血清Williams E培養(yǎng)液及含5%FCS的MEM培養(yǎng)液作為基礎培養(yǎng)液。

一般來說，切除毛囊球部后的毛囊上段再生過程可以分為四個時期:(1)急性損傷反應期；(2)細胞內和細胞外結構的重組和改建；(3)毛囊新結構的再生；(4)新的毛發(fā)纖維的生長。在本次實驗中，毛囊上段組織體外培養(yǎng)后第4天，外根鞘細胞增殖并填充拔除毛發(fā)后留下的空腔，部分外根鞘細胞突出到玻璃膜底部切緣之外。培養(yǎng)第9天，外根鞘細胞和真皮鞘細胞繼續(xù)增殖，部分真皮鞘細胞移動到底部外根鞘中，毛囊斷端被結締組織包裹，結締組織鞘基本規(guī)則，毛囊組織切緣痕跡并不明顯。培養(yǎng)第12天，部分細胞開始出現(xiàn)萎縮或者開始死亡，沒有新的毛乳頭形成。本課題的缺陷在于毛囊上段體外培養(yǎng)最終無完整的毛乳頭形成，但是能夠收獲大量單個再生毛囊上段體外培養(yǎng)的標本，對課題組下一步深入研究毛乳頭再生的機制至關重要。

本次實驗選擇大鼠觸須毛囊作為研究對象，是因為：(1)大鼠觸須毛囊的取材便捷，毛囊分離等操作相對簡單，容易上手；(2)大鼠觸須毛囊體積大，不同周期的毛囊容易辨別；(3)大鼠觸須毛囊上段組織的形態(tài)結構明顯，形態(tài)結構變化容易觀察。影響大鼠觸須毛囊生長的因素有很多，除了培養(yǎng)基種類、生長因子(IGF-1、EGF等)、雙氫睪酮，還包括血管生成素、富含血小板血漿[20]、雌激素等等。本實驗成功構建了毛囊上段體外再生模型，為毛囊切割后再生研究提供一個良好的實驗平臺。課題組相信對毛囊上段的深入研究有助于揭示毛囊再生的真正秘密，為毛發(fā)再生和移植的研究奠定基礎。