大鼠胸腺內(nèi)注射MBP誘導(dǎo)免疫耐受對手術(shù)SBI引起的腦神經(jīng)功能缺陷和腦水腫作用研究

姚 斌，洪曉雅2*，尚福泰2，惠亮亮，安旭生

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)科,2.麻醉科,江蘇 淮安 223300)

手術(shù)腦受損(SBI)是指在實施神經(jīng)外科手術(shù)過程中導(dǎo)致非疾病本身引成的神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)[1]。人們的正常機體內(nèi)存在一些微量的抗腦抗體，但是當(dāng)SBI破壞血腦屏障時，會釋放出大量的腦抗原進入血液，刺激機體產(chǎn)生大量的腦抗體，激活免疫系統(tǒng)引起繼發(fā)反應(yīng)導(dǎo)致腦水腫、血腦屏障破壞及神經(jīng)元死亡，進一步加重腦損傷[2]。目前臨床上治療繼發(fā)性炎癥反應(yīng)比較新穎的方式是針對抗原特異性的誘導(dǎo)免疫耐受治療方法[3]。胸腺是一個對于T淋巴細胞非常重要的場所。T淋巴細胞在其經(jīng)歷分化、發(fā)育和成熟階段，它可以經(jīng)過陰性選擇獲得自身免疫耐受特性，而胸腺表達的內(nèi)源性蛋白質(zhì)也會經(jīng)過抗原提呈細胞提呈給淋巴細胞，誘導(dǎo)中樞免疫耐受[4]。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中僅次于蛋白脂蛋白之后含量第二豐富的蛋白質(zhì)，但是在胸腺中并不表達[5]。所以本文擬在大鼠胸腺內(nèi)注射MBP誘導(dǎo)免疫耐受，觀察其能否減輕SBI引起的腦神經(jīng)功能缺陷和腦水腫。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SD大鼠30只，體重260～300 g，雌雄各半，購自蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司，許可證號：SDK(蘇)2009-0001；飼養(yǎng)室溫22～25 ℃，濕度35%～50%，自由攝食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行試驗，隨機分為假手術(shù)組、模型組和MBP處理組，每組10只。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠SBI模型制備 經(jīng)腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后備皮，安裝立體定向儀，頭部消毒。無菌條件下，正中矢狀位切開頭皮，暴露顱骨，于矢狀縫右側(cè)2 mm、冠狀縫后1 mm處開直徑4 mm骨窗，尖刀切開硬腦膜后銳性切除大小2 mm×3 mm ×3 mm腦組織，止血后逐層縫合，隨后，大鼠取仰臥位，無菌條件下沿頸部正中切開皮膚和皮下組織，仔細分離肌肉，沿胸部正中剪開胸骨柄，暴露胸腺。在直視下，模型組和MBP處理組分別每側(cè)胸腺注射50 μL等滲鹽水和MBP(1 mg/mL)。止血后逐層縫合皮下組織和皮膚[6]。

假手術(shù)組：照同樣方法開骨窗，但保持硬腦膜完整，暴露胸腺只進行空針穿刺，未注射任何物質(zhì)。

1.2.2 大鼠神經(jīng)系統(tǒng)行為評價 造模后的1天、7天和14天,對大鼠進行神經(jīng)系統(tǒng)行為評價(MNSS)，評分包括5個方面：提尾反射(0～3分)、行走測試(0～3分)、感覺測試(0～2分)、平衡測試(0～6分)、反射缺失和反常運動(0～4分)，大鼠缺失1項反射或不能完成測試即計相應(yīng)分數(shù)，分數(shù)越高，損傷越重。

1.2.3 大鼠腦水腫體積檢測 造模后的1、7和14天，對大鼠行頭部MRI掃描，并利用交互式分割算法分割每個斷面，獲得每個斷層圖像的邊緣，計算每個截面的面積并乘以該斷層厚度即可獲得水腫部分體積。

1.2.4 血清炎性因子檢測 造模術(shù)后1、3、7、14、21天心臟穿刺取血800 μL，分離血清-80 ℃保存，ELISA法檢測IL-1、IL-2和TGF-β濃度。

1.2.5 PCR檢測 (1)組織總RNA提?。河肨RIzol試劑盒提取勻漿后的腦組織的RNA(按照說明步驟進行)，然后用紫外分光光度計進行定量，并保存在-70℃冰箱備用；(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：以O(shè)ligo(dT)18為引物，反應(yīng)體積2 μL，補DEPC處理的水至終體積25 μL，按說明操作。-20 ℃凍存；(3)PCR擴增，上游引物為5′-GGAATGGGAAGACACATATGGAACTGC-3′，下游引物5′-CATATCTGGCCAGTAGTGCAGTAATTC-3′，25 u12xSYBR GREEN MIX和cDNA2 μL，200 μmol上下游引物,補ddH20至50 μL，然后以50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min的反應(yīng)條件，進行50個循環(huán)(95 ℃ 15 s，退火溫度30 s，72 ℃ 30 s)進行PCR擴增。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MNSS評分比較

三組隨時間延長，MNSS評分有所降低；模型組和MBP處理組處理后7d、14d MNSS評分明顯高于假手術(shù)組，其中MBP處理組處理后7天、14天 MNSS評分明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠MNSS評分比較

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

2.2 各組大鼠腦水腫體積比較

模型組和MBP處理組處理后7天腦水腫體積達到高峰；模型組和MBP處理組處理后1、7、14天腦水腫體積明顯高于假手術(shù)組，其中MBP處理組處理后1、7、14天腦水腫體積明顯低于模型組。見表2。

2.3 各組血清IL-1、IL-2和TGF-β水平

模型組和MBP處理組隨時間延長，IL-1、IL-2和TGF-β水平有所降低；模型組和MBP處理組處理后1、7、14天，IL-1、IL-2和TGF-β水平明顯高于假手術(shù)組，其中MBP處理組處理后1、7、14天，IL-1、IL-2和TGF-β水平明顯低于模型組。見表3～5。

表2 各組大鼠腦水腫體積比較 (mm2)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05.

表3 各組血清IL-1水平比較 (pg/mL)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

表4 血清TGF-β水平 (pg/mL)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

表5 血清IL-2水平 (pg/mL)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

2.4 各組腦組織FasL mRNA表達

MBP處理組腦組織FasL mRNA相對表達量為(0.876±0.112)，明顯高于假手術(shù)組和模型組。見表6。

表6 各組腦組織FasL mRNA表達

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

3 討 論

開顱手術(shù)一般都會有較大的創(chuàng)口，由此會導(dǎo)致免疫細胞攻擊一些暴露出的具有免疫耐受的神經(jīng)組織，繼而激活小膠質(zhì)細胞，并釋放一些炎性因子[7]。此外腦組織中的部分蛋白和血液中的淋巴細胞會由于血腦屏障的破壞而互相交換地方，調(diào)節(jié)性T細胞在抗原與免疫細胞的接觸誘導(dǎo)下會向TH1細胞轉(zhuǎn)化[8]。巨噬細胞會被炎癥因子誘導(dǎo)游動到損傷組織周圍釋放炎癥因子，進一步造成機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，加重腦損傷。MBP是一種強堿性膜蛋白，由脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)(CNS和PNS)的細胞合成的[9]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害，血腦屏障遭到破壞時，血清中的MBP含量就會明顯增高，有研究[10]證明，MBP可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自身免疫疾病，還能自主免疫保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以MBP能減輕腦損傷帶來的危害。

MNSS評分是評價神經(jīng)功能的重要方式，其分數(shù)越高，說明神經(jīng)功能損害越嚴重，實驗通過對各組大鼠進行MNSS評分，我們發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，各組的MNSS評分都明顯的下降，且三組MNSS評分由高到低依次為模型組、MBP處理組和假手術(shù)組，說明三組大鼠都有一定的神經(jīng)缺陷，但是對于腦損傷的大鼠來說，注射MBP可以改善神經(jīng)缺陷。MRI檢測腦水腫體積可以反映SBI后神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度及恢復(fù)程度，由實驗結(jié)果我們可以看出，模型組和MBP處理組處理后7天腦水腫體積達到高峰，且三組腦水腫的程度由高到低依次是模型組、MBP處理組和假手術(shù)組，也進一步說明了MBP具有降低神經(jīng)損傷、利于恢復(fù)的作用[11]。IL-1是一種細胞因子，是當(dāng)機體發(fā)生感染時由單核細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等細胞產(chǎn)生的，集落刺激因子、血小板生長因子等細胞因子可以在IL-1的刺激下分泌增加，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)[12]。IL-2主要是由活化的T細胞產(chǎn)生的一種重要的促炎因子，它可以趨化CD4+T細胞和CD8+T細胞到達損傷部位建立器官特異性的免疫反應(yīng)。TGF-β即轉(zhuǎn)化生長因子，它屬于調(diào)節(jié)細胞生長和分化的TGF-β超家族，對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，可以在同種異體移植耐受或自身免疫耐受中起到作用[13]。本實驗結(jié)果顯示，隨時間延長，MBP處理組較模型組IL-1、IL-2和TGF-β水平有所降低，說明向胸腺注射MBI可以減輕炎癥反應(yīng)。介導(dǎo)哺乳動物細胞調(diào)亡的途徑有多種，而Fas/Fasl的相互作用介導(dǎo)途徑就是其中之一[14]。它在胸腺選擇、免疫豁免等許多重要的生理過程發(fā)揮著重要的作用。其主要在CD4+CD8+早期階段介導(dǎo)細胞凋亡，經(jīng)過陰性選擇后的胸腺細胞可以清除自身反應(yīng)性細胞來獲得中樞免疫耐受，并經(jīng)自分泌方式誘導(dǎo)T細胞自身凋亡維持外周細胞免疫耐受。實驗結(jié)果顯示MBP處理組的FaslmRNA明顯的高于模型組和假手術(shù)組，說明胸腺注射MBP可以術(shù)后Fasl的表達，促進T細胞的凋亡，誘導(dǎo)免疫耐受[15]。

綜上所述，大鼠胸腺內(nèi)注射MBP誘導(dǎo)免疫耐受可以減輕SBI引起的腦神經(jīng)功能缺陷和腦水腫，并且降低炎癥反應(yīng)發(fā)生的概率。