MKRN3基因與兒童中樞性性早熟

石玉蘭12，貴子豪1，郭冰冰1，徐高生1，莫中成

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，南華大學(xué) 岳陽市婦幼保健院基礎(chǔ)與臨床協(xié)同研究生培養(yǎng)創(chuàng)新實(shí)踐基地，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.邵陽學(xué)院附屬第二醫(yī)院兒科，湖南 邵陽 422000)

中樞性性早熟(central precocious puberty，CPP)是指女性在8歲前，男性在9歲前內(nèi)、外生殖器官提前快速發(fā)育，并出現(xiàn)第二性征的一種常見兒科內(nèi)分泌疾病。CPP發(fā)生的機(jī)制可能與下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)提前被激活有關(guān)。近年來，環(huán)指蛋白3(makorin ring finger protein 3,MKRN3)基因已被確定為CPP的易感基因，MKRN3基因缺失突變導(dǎo)致HPG軸過早激活。Bo Ram Yi研究了103名女孩和70名男孩MKRN3的多態(tài)性，確定其與男孩的性早熟有關(guān)，但與女孩無關(guān)[1]。Erina Suzuk等人對(duì)24名患者(22名日本患者和2名中國患者)的核苷酸取代進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在19名日本患者中發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化缺陷和拷貝數(shù)改變，但僅有一名女性發(fā)生MKRN3核苷酸取代[2]。同時(shí)，研究報(bào)告表明，MKRN3缺陷在亞洲人群中很少見，故推測這種罕見突變可能存在種族差異。本文將綜述MKRN3基因與中樞性性早熟之間關(guān)系。

1 MKRN3基因結(jié)構(gòu)和功能

MKRN3 基因位于Prader-Willi綜合征關(guān)鍵區(qū)域的染色體15q11.2 上，僅有外顯子，不含內(nèi)含子，是一種母系印記基因。MKRN基因家族用特定的鋅指基序陣列編碼核糖核蛋白[3-4]。MKRN3 蛋白具有2個(gè)N末端C3H 鋅指模體，1個(gè)MKRN 特異性Cys-His 結(jié)構(gòu)域，1個(gè)C3H4 RING 鋅指模體和1個(gè)C 末端C3H 鋅指模體[5](圖1)。該蛋白參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及蛋白質(zhì)的泛素化過程，但目前關(guān)于它的具體功能以及突變是如何導(dǎo)致中樞性性早熟的研究還不明確。

圖1 MKRN3蛋白三維結(jié)構(gòu)模式圖[5]

2 MKRN3基因的突變

在MKRN3基因的研究中共發(fā)現(xiàn)了33個(gè)突變，其中14個(gè)是移碼突變，17個(gè)錯(cuò)義突變和2個(gè)無義突變[6-7]。最近，劉璐等人在2個(gè)散發(fā)病例和5個(gè)家系病例中發(fā)現(xiàn)4種新的基因突變，分別為：c.1138G>A(p.Glu380Lys )、c.1420T>A (p.Leu474Met)、c.673C>G (p.Leu225Val)、c.1071C>G(p.Ile357Met)[5](詳見表二)Macedo D對(duì)健康和中樞性早熟女孩進(jìn)行甲基質(zhì)譜分析，也發(fā)現(xiàn)在CPP患者啟動(dòng)子區(qū)域的4個(gè)罕見突變4-nt deletion (c.-150_-147delTCAG;-38 to -41nt)，這些突變會(huì)使MKRN3啟動(dòng)子活性顯著降低，并認(rèn)為其是導(dǎo)致CPP[8]的重要原因。

表1 已證實(shí)的MKRN3基因突變

續(xù)表

突變位點(diǎn)氨基酸改變突變類型c.766-767delAp.Glu256Gly移碼突變c.637delCp.Arg213Gly移碼突變c. 1171-1172insAp.Tyr391 ?移碼突變c.441-44ldeJGp.Hisl48Thr移碼突變c.331G>Tp.Glull l ?移碼突變c.1095G>Tp.Arg365Ser錯(cuò)義突變c.1018T>Gp.Cys340Gly錯(cuò)義突變c.1249T>Ap.Phe4171Je錯(cuò)義突變c.1260T>Gp.His420Gln錯(cuò)義突變c.1188C>Ap.Ser396Arg錯(cuò)義突變c.699G>Cp.Lys233Asn錯(cuò)義突變c.677A>Cp.Gln226Pro錯(cuò)義突變c.611T>Cp.Ile204Thr錯(cuò)義突變c.298A>Tp.Ile100Phe錯(cuò)義突變c.587G>Tp.Gly l 96V al錯(cuò)義突變c.1034G>Ap.Arg345His錯(cuò)義突變c.737A>Gp.Tyr246Cys錯(cuò)義突變c.1118C>Tp.Pro373Leu錯(cuò)義突變c.89C>Tp.Pro30Leu錯(cuò)義突變c.982C>Tp.Arg328Cys錯(cuò)義突變c.943A>Gp.Met 315Yal錯(cuò)義突變c.935G>Ag.Gly312Asp錯(cuò)義突變c.1071C>Gp.11e357Met錯(cuò)義突變c.1138G>Ap.Glu380Lys錯(cuò)義突變c. l420T>Ap.Leu474Met錯(cuò)義突變c.673C>Gp.Leu225Val錯(cuò)義突變E298?p.Glu298Ter無義突變c.841C>Tp.Gln281?無義突變

3 MKRN3基因突變與性別的關(guān)系

有研究發(fā)現(xiàn)，女孩的CPP發(fā)病率高于男孩[9-11]，但最近Lee HS等人報(bào)道韓國女孩中樞性性早熟的MKRN3突變率較低[12]。與先前報(bào)道的女性數(shù)據(jù)相比，男性中MKRN3突變的頻率較高[13]。然而，當(dāng)僅考慮CPP患者時(shí)，男性患者(17.6%)中MKRN3突變的患病率高于女性患者(5.0%)(P=0.05)[14]。女孩的青春期年齡比男孩小，但男孩的發(fā)病率較高[14]，有可能表明兒童期GnRH的抑制作用弱于女孩，使女孩對(duì)青春期發(fā)病的紊亂更敏感。MKRN3基因在小鼠下丘腦弓狀核中的表達(dá)沒有性別差異，這表明在青春期前，MKRN3在兩性中都有抑制作用[15-16]，但不排除有性別特異性作用的可能。

4 MKRN3基因?qū)η啻浩跁r(shí)間的影響

4.1 MKRN3基因和LIN28B可能協(xié)同調(diào)節(jié)青春期的時(shí)間而影響性早熟

目前發(fā)現(xiàn)MKRN3與青春期定時(shí)相關(guān)基因編碼的20種蛋白質(zhì)相互作用，其中LIN28B是研究最成熟的青春期相關(guān)基因之一[17-18]。LIN28B與月經(jīng)初潮年齡、成年身高和兒童期生長有關(guān)[19-20]，并且現(xiàn)已知該基因是let-7 microRNA的負(fù)調(diào)節(jié)因子[21]，其調(diào)節(jié)青春期時(shí)間的機(jī)制尚不清楚[22-24]。在大鼠和非人類靈長類動(dòng)物中，在青春期時(shí)LIN28B的表達(dá)在下丘腦中下降[25]，并且在小鼠中，LIN28B和MKRN3的表達(dá)在青春期前降低[26-27]。

然而，Yi等分析了LIN28B中的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)(rs314276和rs314280)，發(fā)現(xiàn)它們與男孩和女孩的性早熟均沒有明顯的相關(guān)性[1]。但對(duì)患者進(jìn)行基因檢測發(fā)現(xiàn)rs314280和rs314276與性早熟顯著相關(guān)[28-29]，不過這種相關(guān)性并不能在SNPs中顯示出來[30-31]，推測造成這一結(jié)果的原因可能是樣本數(shù)較少或存在種族差異。

以小鼠為研究對(duì)象，通過過表達(dá)LIN28B對(duì)LIN28-Let-7途徑進(jìn)行遺傳修飾可增加小鼠體重并延緩青春期的開始[32]，但LIN28B對(duì)于人類青春期時(shí)間的調(diào)控方式仍待進(jìn)一步研究。Venkatram Yellapragada通過質(zhì)譜分析(Mass spectrometry ，MS)發(fā)現(xiàn)人類LIN28B和MKRN3存在相互作用，并且推測它們很有可能協(xié)同調(diào)節(jié)青春期的時(shí)間[33]。

4.2 MKRN3基因不能通過抑制促性腺激素釋放激素而調(diào)節(jié)青春期時(shí)間

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘腦弓狀核分泌的一種十肽激素，由十種氨基酸組成。GnRH可與垂體促性腺激素細(xì)胞膜表面的GnRH受體(GnRHR)結(jié)合，形成配體-受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。垂體收到復(fù)合物刺激會(huì)周期性分泌促性腺激素如黃體生成素(luteinizing hormone，LH)，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)。黃體生成素和卵泡刺激素會(huì)促進(jìn)性腺分泌性激素，進(jìn)而對(duì)骨骼，腎上腺皮質(zhì)，乳腺和甲狀腺的生長有重要作用。在嬰兒期，GnRH的分泌較活躍，但在兒童期停止，進(jìn)入青春期后，脈沖式GnRH的分泌被重新激活導(dǎo)致促性腺激素的分泌增加，從而刺激性腺。而MKRN3可以抑制GnRH的分泌，而MKRN3的功能缺失性突變會(huì)導(dǎo)致其失去對(duì)于GnRH分泌的抑制作用，使兒童提前進(jìn)入青春期。

Jeong發(fā)現(xiàn)一些CPP患者表現(xiàn)出較高的MKRN3水平，高水平的MKRN3抑制GnRH脈沖分泌通路，但并不直接抑制GnRH分泌[34]。相反，GnRH脈沖分泌增加也不能負(fù)反饋調(diào)節(jié)MKRN3的水平，這些結(jié)果表明，MKRN3不是調(diào)節(jié)GnRH分泌的唯一因子。Venkatram使用CRISPR /Cas9技術(shù)生成的兩個(gè)雙等位基因MKRN3 KO克隆細(xì)胞系(Del 1和Del 2)檢查了MKRN3對(duì)GNRH1表達(dá)的作用，并將這些細(xì)胞系分化成表達(dá)GNRH1的神經(jīng)元。結(jié)果顯示，Del 1和Del 2細(xì)胞系都可以成功地分化為表達(dá)GNRH1的神經(jīng)元，這表明MKRN3對(duì)于分化并不是必要的。有趣的是，Del 1和Del 2細(xì)胞系的GNRH1表達(dá)與對(duì)照組沒有差異，這表明MKRN3不直接改變GNRH1表達(dá)。雖然MKRN3在他們的模型中不影響GnRH神經(jīng)元分化或它們表達(dá)GNRH1的能力，但MKRN3可能通過其他機(jī)制調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元功能。例如，GnRH神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)主要是通過下丘腦中的Kisspeptin和KNDy神經(jīng)元進(jìn)行的，而MKRN3對(duì)這些神經(jīng)元的作用尚不清楚。不能排除其他MKRN補(bǔ)償Del 1和Del 2細(xì)胞系中MKRN3缺失的可能性。基于人類多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells ，hPSC)的疾病模型是模擬人類神經(jīng)元疾病的最接近的方法[35]，但并沒有關(guān)于MKRN3的小鼠模型的相關(guān)報(bào)道?？傊?，結(jié)果表明MKRN3并不是GnRH神經(jīng)元分化過程和人多能干細(xì)胞分化期間的GNRH1表達(dá)的必要因素。此外，GnRHa治療并不會(huì)改變女性CPP患者M(jìn)KRN3水平[34]。

5 MKRN3基因可抑制Nptx1神經(jīng)元的活性影響性早熟

Nptx1是神經(jīng)元發(fā)育的重要分泌蛋白，雖然目前并沒有直接證據(jù)表明Nptx1在GnRH神經(jīng)元活動(dòng)中發(fā)揮作用，但在研究中發(fā)現(xiàn)在GnRH神經(jīng)元的誘導(dǎo)下Nptx1是最早激活的細(xì)胞外信號(hào)之一[36]。MKRN3 基因編碼E3泛素-蛋白連接酶 makorin 3 (E3 ubiquitin-protein ligase makorin-3)，有研究發(fā)現(xiàn)Nptx1需要該酶進(jìn)行泛素化修飾。

有研究結(jié)果表明，在青春期之前和青春期時(shí)，小鼠下丘腦MKRN3和Nptx1呈負(fù)相關(guān)，MKRN3可抑制Nptx1的活性。MKRN3通過Ring finger結(jié)構(gòu)域與Nptx1相互作用，Ring finger結(jié)構(gòu)域是E3泛素連接酶域，可抑制Nptx1表達(dá)。由于到目前為止從未報(bào)道過Nptx1的泛素化，有研究推測Nptx1作為一種分泌蛋白，不僅可以通過MKRN3進(jìn)行泛素化，而且可以在青春期開始時(shí)和其他E3泛素連接酶進(jìn)行泛素化修飾[36]。MKRN3在幼年期通過泛素化對(duì)Nptx1發(fā)揮抑制作用。當(dāng)青春期開始時(shí)，MKRN3沉默，導(dǎo)致GnRH神經(jīng)元開始激活Nptx1等信號(hào)分子。

6 總結(jié)與展望

MKRN3因突變而功能喪失導(dǎo)致幼年期的對(duì)GnRH的抑制作用缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致CPP，但具體機(jī)制及其與其他青春期發(fā)病相關(guān)鋅指基因的相互作用尚不清楚[37]。高水平的MKRN3會(huì)抑制GnRH脈沖分泌通路，但并不直接抑制GnRH分泌，表明MKRN3不直接改變GNRH1表達(dá)，可能存在調(diào)節(jié)MKRN3和GnRH分泌的上游因子。此外，MKRN3還可以作用于神經(jīng)系統(tǒng)，通過抑制Nptx1 的活性而抑制神經(jīng)元發(fā)育，但其確切的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。鑒于MKRN3在兒童青春期中的作用，補(bǔ)償MKRN3可能是治療CPP的潛在方法，但具體療效及可能機(jī)制尚需要更深入的研究和考證。