彭旭紅 李佳 王玉,3 張健 羅偉濠 朱樂攀 胡政 吳海燕 李艷蘭 段麗麗
作者單位:423000 郴州 1郴州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)中心;2郴州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所;065201 廊坊 3燕達醫(yī)院研究院中心實驗室;423000 郴州 4郴州市第一人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心;5郴州市第一人民醫(yī)院病理診斷中心;421001 衡陽 6南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室
甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1],而甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見的病理類型,占TC的85%~90%[2-3]。甲狀腺癌原發(fā)灶的解剖位置位于頸部皮下,有利于超聲引導(dǎo)下穿刺活檢,手術(shù)和131碘治療是主要的治療方法,10年生存率可達90%以上[4-5]。盡管多數(shù)甲狀腺癌患者預(yù)后較好,但仍有部分患者因轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)死亡[6]。尋找特異性的腫瘤標志物對甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的早期診斷、預(yù)后評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測均具有重要意義[7-8]。醛酮還原酶1B10(aldo-keto reductase family 1B10,AKR1B10)屬于醛酮還原酶(aldo-keto reductase,AKR)超家族,研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌[9]、肝癌[10-12]、肺癌[13]、口腔癌[14]等腫瘤組織中高表達,且與肝癌和乳腺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),但其與PTC的關(guān)系未見報道。本研究檢測AKR1B10在PTC中的表達,并分析其臨床病理特征的關(guān)系,為臨床診療提供參考依據(jù)。
收集2013年1月至2015年7月于郴州市第一人民醫(yī)院經(jīng)超聲診斷的237例甲狀腺結(jié)節(jié)患者的病理標本,其中甲狀腺乳頭狀癌117例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40例、甲狀腺濾泡性腺瘤40例、橋本甲狀腺炎40例。同時選取本院病理科法醫(yī)尸檢福爾馬林浸泡的甲狀腺正常組織13例作為對照。納入標準:⑴術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療;⑵經(jīng)常規(guī)石蠟病理確診;⑶臨床資料齊全。排除標準:合并其他腫瘤或治療后復(fù)發(fā)患者。收集患者性別、年齡、發(fā)病部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍浸潤情況、腫瘤大小、腫瘤TNM分期等臨床資料。本研究經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:2015002),患者知情同意。
AKR1B10抗體為自制兔抗,β-tubublin抗體購于上海碧云天生物有限公司;山羊血清,磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.2~7.4),枸櫞酸抗原修復(fù)液(pH 6.0),濃縮型DAB試劑盒,HRP標記山羊抗兔IgG和HRP標記山羊抗鼠IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司;聚丙烯凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜裝置購于美國Bio-Rad公司。
在超聲引導(dǎo)下或外科手術(shù)中切取甲狀腺癌新鮮組織30例和甲狀腺癌患者正常甲狀腺新鮮組織6例用于蛋白免疫印跡實驗。甲狀腺組織剪碎后,加入蛋白裂解液提取總蛋白,測定蛋白濃度;以每個樣品50 μg蛋白進行聚丙烯凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉;一抗(孵育的一抗分別為 AKR1B10 和 β-tubulin,稀釋比例 1∶1 000)孵育,4℃冰箱過夜,用PBST洗滌液洗滌3次,每次5 min。加入二抗(按 1∶5 000 稀釋),室溫孵育 2 h,用PBST洗滌液洗滌3次,每次5 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,以β-tubulin作為內(nèi)參,掃描AKR1B10和β-tubulin條帶灰度值,以 AKR1B10/β-tubulin的灰度值表示AKR1B10的表達水平。
從病理科收集石蠟包埋甲狀腺組織樣本,包括甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺濾泡性腺瘤、橋本甲狀腺炎,采用SP法,連續(xù)4 μm切片,常規(guī)脫蠟、脫水;阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶(3%H2O2孵育后PBS沖洗);抗原修復(fù)(標本置于pH為6.0的枸櫞酸緩沖液中);血清工作液封閉30 min;滴加AKR1B10抗體,4℃孵育過夜;滴加通用型二抗,置于37℃溫箱孵育1 h;DAB顯色,蘇木素復(fù)染;脫水、干燥、封片。每張切片于高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野,采用染色強度(無色為0分,淡黃色1分,深黃色2分,黃褐色3分)和染色面積(0~5%計0分,6%~10%計1分,11%~50%計2分,50%以上計3分)雙重指標綜合判斷陽性表達情況,兩項指標評分相乘,結(jié)果<2分計為“-”,2~3分計為“+”,4~5分計為“++”,6分以上計為“+++”[15-16],++~+++視為 AKR1B10 陽性表達,-~++為AKR1B10陰性表達。為降低人為誤差,由2名醫(yī)師分別在鏡下評分,結(jié)果取平均值,評分差異較大的結(jié)果請病理科專家會診。
采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。AKR1B10在不同甲狀腺組織中的表達差異比較采用χ2檢驗,當理論頻數(shù)小于1時,采用Fisher確切概率法。AKR1B10在甲狀腺正常組織和PTC組織中的差異性表達比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
采用Western Blot檢測結(jié)果顯示AKR1B10蛋白在PTC組織中的表達水平高于甲狀腺正常組織(0.82±0.10vs0.22±0.07,t=2.702,P=0.011)。見圖 1。
圖1 AKR1B10在甲狀腺正常組織和PTC組織中的表達Fig.1 Expression of AKR1B10 in normal thyroid tissues and PTC tissues
免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示,AKR1B10在PTC組織中呈高表達,主要表達于細胞質(zhì)內(nèi),不均勻分布,細胞染色深淺不一。見圖2。
圖2 PTC組織中AKR1B10的表達(×400)Fig.2 Evaluation standard of AKR1B10 expression in PTC tissues(×400)
AKR1B10在PTC組織中陽性表達率最高(79.5%),在橋本甲狀腺炎組織的陽性表達率次之(75.0%)。PTC組織中AKR1B10陽性表達率與橋本甲狀腺炎組織的比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.346,P>0.05),但與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、甲狀腺濾泡性腺瘤組織、PTC癌旁組織、甲狀腺正常組織比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表 1。
表1 AKR1B10在PTC癌組織和甲狀腺良性組織中的表達Tab.1 Expression of AKR1B10 in PTC and in benign lesions of thyroid tissues
共收集106例PTC患者完整的臨床病理資料,其中94例可準確分期,AKR1B10表達與癌組織周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=8.059,P=0.007),男性患者 AKR1B10的陽性表達率高于女性(91.0%vs60.7%,χ2=8.509,P=0.010)。見表 2。
近年來,甲狀腺癌發(fā)病率持續(xù)快速增長,臨床診斷甲狀腺結(jié)節(jié)性病變的方法較多,對疑似患者先進行影像學(xué)診斷,如CT檢查、超聲檢查等,再行超聲引導(dǎo)下穿刺病理活檢。以外科手術(shù)為主的綜合治療是甲狀腺癌患者目前的主要治療手段,治療效果較好,但仍有患者發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[6],面臨二次手術(shù)風(fēng)險。目前應(yīng)用于臨床的甲狀腺癌標志物較少[17-18],沒有理想的診斷及標志物。AKR1B10是醛酮還原酶家族成員之一,主要還原內(nèi)源性代謝產(chǎn)生的和外源性攝入的醛酮類物質(zhì),以保護細胞免受羰基毒性損傷,減少DNA損傷和突變。AKR1B10還可與乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)結(jié)合,保護后者泛素化途徑降解,從而促進脂質(zhì)合成,促進腫瘤細胞生長。AKR1B10主要在正常胃上皮和腸道上皮組織中高表達,在其他組織中不表達或低表達[19]。
本研究發(fā)現(xiàn),AKR1B10在PTC組織中陽性表達較率高,乳頭狀細胞起源于甲狀腺濾泡上皮細胞,因此AKR1B10可能在濾泡上皮細胞癌變進展過程中發(fā)揮一定作用。前期研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中AKR1B10可通過激活ERK信號通路,上調(diào)MMP2,從而促進乳腺癌細胞遷移和侵襲[20]。本研究進一步分析AKR1B10表達與PTC臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),可能與AKR1B10在乳腺癌中的作用類似,但仍有待進一步驗證。本研究中男性患者的AKR1B10陽性表達率高于女性患者,原因不明。甲狀腺癌好發(fā)于女性,男女比例約為1∶3[21],而本研究中男性患者較少,因此后期需增加男性患者例數(shù)驗證此結(jié)果。
表2 AKR1B10表達水平與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Correlation analysis between AKR1B10 expression levels and clinicopathological parameters of PTC
本研究還發(fā)現(xiàn),AKR1B10在40例橋本甲狀腺炎組織中表達較強,陽性表達率為75.0%,明顯高于甲狀腺正常組織及其他甲狀腺良性組織,但其與PTC組織中AKR1B10的陽性表達率(79.5%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。文獻報道[22],橋本甲狀腺炎患者較非橋本甲狀腺炎患者存在更高的甲狀腺癌發(fā)生風(fēng)險。說明橋本甲狀腺炎具有惡變成甲狀腺癌的可能,AKR1B10可能是評估橋本甲狀腺炎惡變的標志物。
綜上所述,AKR1B10在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈高表達,且與甲狀腺癌周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),有望作為評估轉(zhuǎn)移的標志物,為臨床診療提供參考依據(jù)。