• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急性腎損傷相關(guān)性SIRT研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P头治?

    2019-12-05 05:11:32賈圣琪裴漢軍
    關(guān)鍵詞:造模線(xiàn)粒體腹腔

    賈圣琪, 裴漢軍

    (1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2016級(jí)碩士研究生,內(nèi)蒙古 包頭 014060;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

    AKI是一組常見(jiàn)的臨床綜合證,一般指突發(fā)(1~7 d內(nèi))和持續(xù)(>24 h)的腎功能突然下降[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),AKI可造成腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)失衡,從而導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂。同時(shí),在體和離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,AKI可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)膜的呼吸鏈相關(guān)酶活性異常,以及線(xiàn)粒體通透性改變[3]。另一方面,AKI可引起線(xiàn)粒體分裂蛋白Drp1大量激活,導(dǎo)致線(xiàn)粒體分裂、片斷化、腎小管上皮細(xì)胞凋亡[4-5]。

    SIRT是依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶的具有去乙酰化活性的一大類(lèi)進(jìn)化保守蛋白家族,可調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程,共有7種亞型(SIRT1~7)[6-7]。近期研究顯示,多種原因?qū)е碌哪I臟損傷會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體SIRT水平下降,其水平變化與腎功能損傷加重,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,能量代謝異常,線(xiàn)粒體的裂解融合失衡,以及細(xì)胞凋亡水平升高明顯相關(guān)。這些研究提示SIRT將成為線(xiàn)粒體靶向治療AKI的新思路[8-12]。

    目前,SIRT的研究趨于火熱,而各種研究對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷倪x擇又有所不同,選擇正確的動(dòng)物模型對(duì)于SIRT蛋白功能的研究至關(guān)重要。本文以上研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P妥龀鋈缦戮C述。

    1 AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究的模型動(dòng)物選擇

    如今,可用于AKI模型建立的試驗(yàn)動(dòng)物多種多樣,但實(shí)際選擇中,動(dòng)物經(jīng)濟(jì)成本、試驗(yàn)周期的控制,以及造模效果等因素都是制約試驗(yàn)動(dòng)物選擇的關(guān)鍵因素[13]。

    非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物十分稀缺,數(shù)量有限,模型建立后的數(shù)據(jù)難以構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且成本高昂,造模要求高,故目前鮮有選擇;貓、狗在生理學(xué)特性以及對(duì)藥物和毒物反應(yīng)上與人類(lèi)有相似之處,但其選擇往往受到動(dòng)物保護(hù)主義及倫理問(wèn)題限制,同時(shí)造模條件嚴(yán)格,經(jīng)濟(jì)成本高,故依然選擇較少;小型豬、兔、大鼠在造模選擇中雖然較少受到動(dòng)物保護(hù)及倫理的影響,但其對(duì)腎臟損傷耐受較強(qiáng),故試驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致造模周期延長(zhǎng),同時(shí)實(shí)驗(yàn)個(gè)體的生長(zhǎng)周期久,難以在較短時(shí)間大量繁殖培育,故大量選擇會(huì)較高提升實(shí)驗(yàn)成本,因此以上三者的選擇同樣存在較多顧慮。

    在眾多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,小鼠是目前世界上品種、品系最多,使用量最大且研究最為詳盡、用途最廣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其在遺傳、腫瘤、免疫等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。同時(shí),在生理特點(diǎn)方面具有較多優(yōu)勢(shì)。首先,小鼠生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)周期短、成熟早,有利于繁殖生產(chǎn);其次,個(gè)體體型較小,便于試驗(yàn)操作,模型建立要求較低;再有,小鼠的生理數(shù)據(jù)使用較為普遍,已有大量研究支持,受到長(zhǎng)期討論證實(shí);最后,小鼠對(duì)外界刺激耐受較差,對(duì)試驗(yàn)干預(yù)更為敏感,造模效果較其他動(dòng)物有明顯優(yōu)勢(shì)。綜合考慮,小鼠飼養(yǎng)管理方便,容易達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化,造模成本低、效果好,在急性腎損傷相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT改變的研究中脫穎而出,經(jīng)過(guò)多重因素的篩選,小鼠成為目前較受歡迎的試驗(yàn)動(dòng)物[14-15]。

    然而,小鼠品種、品系繁多,各自的生理特點(diǎn)有所不同,選擇合適的品種、品系是試驗(yàn)?zāi)P徒⒌年P(guān)鍵問(wèn)題。近些年來(lái),急性腎損傷相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT改變的研究中,C57BL/6小鼠被廣泛使用。該小鼠被認(rèn)作“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系,并且已經(jīng)完成其基因序列的測(cè)定,在遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)研究中均為常用品系。在該研究的試驗(yàn)?zāi)P椭校渖飳W(xué)特征有以下優(yōu)勢(shì):第一,乳腺腫瘤的自然發(fā)生率低,致癌劑使用難以誘發(fā)腫瘤,故試驗(yàn)干預(yù)造成小鼠癌變可能較小,病理標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定;第二,對(duì)放射線(xiàn)耐受力中等,造模中如涉及放射干預(yù),動(dòng)物反應(yīng)更為敏感;第三,補(bǔ)體活性高,較易誘發(fā)免疫耐受性,試驗(yàn)操作受到動(dòng)物免疫因素干擾較??;第四,因常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系,故為許多突變基因提供遺傳背景,同時(shí)在試驗(yàn)?zāi)P偷慕⒅?,為培育SIRT基因剔除小鼠提供了試驗(yàn)基礎(chǔ),使試驗(yàn)?zāi)P偷姆纸M對(duì)比上升到了基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)層面,嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性進(jìn)一步得到提升。綜上可知,C57BL/6小鼠的選擇對(duì)此研究更具說(shuō)服力[16-18]。

    2 小鼠AKI模型的建立

    AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究的基礎(chǔ)是在試驗(yàn)動(dòng)物水平建立起AKI模型,該模型的可行性、科學(xué)性缺一不可,同時(shí)又需要對(duì)研究方向做出針對(duì)性的調(diào)整。目前AKI的造模方式多種多樣,針對(duì)SIRT的研究卻很有限,因此選擇合適AKI模型就顯得至關(guān)重要。以下列舉近些年相關(guān)研究的常用AKI模型思路,以便進(jìn)一步分析思考。

    2.1模型一 雙側(cè)夾閉小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型[19-20]選用C57BL/6雄性小鼠,6~8周齡,體重20~25 g,用隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組(Control Group,C組),假手術(shù)組(sham operated group,S組)、缺血再灌注組(Ischemia reperfusion injury Group,IR組),其中C組4只、S組32只、IR組32只。C組:不予手術(shù)處理。S組:用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通過(guò)腹腔注射的方式麻醉小鼠,隨后取腹部正中切口切開(kāi)腹壁,暴露、游離雙側(cè)腎蒂,不進(jìn)行腎蒂夾閉操作,其余同IR組。IR組:用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通過(guò)腹腔注射的方式麻醉小鼠,隨后取腹部正中切口切開(kāi)腹壁,暴露、游離雙側(cè)腎蒂,進(jìn)而用無(wú)損傷止血夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂,腎臟由紅色變?yōu)樽仙醋C明已造成腎臟缺血,夾閉成功,進(jìn)一步夾閉持續(xù)30 min;夾閉時(shí)間結(jié)束后,打開(kāi)微動(dòng)脈止血夾恢復(fù)腎臟供血,若腎臟顏色變化為由紫黑色逐漸恢復(fù)紅色,證明再灌注成功;再灌注完成后,逐層縫合腹部創(chuàng)口。操作全程注意無(wú)菌原則,同時(shí)術(shù)中如有重要器官或大血管損傷,應(yīng)及時(shí)剔除。待S組、IR組小鼠術(shù)后清醒后,將其放回籠中,密切關(guān)注其生命體征。S組和IR組小鼠分別于再灌注0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h,5 d、7 d處死采樣(4只/時(shí)間點(diǎn))。

    2.2模型二 單側(cè)夾閉、對(duì)側(cè)腎切除小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型[21-22]選用24只C57BL/6小鼠,雄性,體重25~28 g,隨機(jī)將小鼠分為三個(gè)組(8只/組):S組、IR組、干預(yù)處理+IR組。每只小鼠均通過(guò)吸入異氟烷的方式麻醉。IR組:腹部皮膚中央?yún)^(qū)域碘伏消毒,腹部正中切口剖腹,游離雙側(cè)腎蒂,左側(cè)腎門(mén)部結(jié)扎腎動(dòng)脈和輸尿管,切除左側(cè)腎臟,留取腎臟組織標(biāo)本;右側(cè)腎蒂用無(wú)損傷微動(dòng)脈止血夾夾閉(腎臟顏色由櫻桃紅轉(zhuǎn)為深紫色即為夾閉成功),持續(xù)夾閉30 min,夾閉時(shí)間結(jié)束后,松開(kāi)止血夾恢復(fù)腎臟灌注(腎臟由深紫色恢復(fù)櫻桃紅色);操作結(jié)束后,縫合腹部創(chuàng)口,將術(shù)后小鼠放置于保溫加熱板上,直至小鼠清醒。S組:同樣進(jìn)行麻醉、消毒、腹部切開(kāi)操作,術(shù)后保溫自然蘇醒,但不進(jìn)行左側(cè)腎切除,右側(cè)腎蒂夾閉操作。干預(yù)處理+IR組:于術(shù)前或術(shù)后對(duì)小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)操作,其余處理同IR組。各組小鼠均于腎臟再灌注后24 h處死取材(經(jīng)眼球靜脈叢取血,開(kāi)腹取腎臟組織),進(jìn)一步送檢分析。

    2.3模型三 甘油注射小鼠急性腎損傷模型[23]選用18只C57BL/6清潔級(jí)小鼠,雄性,6~8 周齡,體重18~22 g,隨機(jī)分為3組(6只/組):C組,AKI組,干預(yù)處理+AKI組。各組小鼠均在操作前禁水12 h。C組:在小鼠雙側(cè)股肌內(nèi)側(cè)注射生理鹽水(8 ml/kg)。AKI組:將用PBS稀釋后的50 %甘油,于小鼠雙側(cè)股肌內(nèi)側(cè)注射,劑量為8 ml/kg。干預(yù)處理+AKI組:甘油注射同AKI組,造模6 h后,進(jìn)行干預(yù)處理,于小鼠尾靜脈注射藥物或生物制劑200 μL。實(shí)驗(yàn)階段全程對(duì)小鼠進(jìn)行分籠清潔級(jí)動(dòng)物喂養(yǎng),室溫保持在20℃左右,相對(duì)濕度為40 %~60 %。操作結(jié)束3 d后,處死全部小鼠,并取血及雙側(cè)腎臟進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)分析。

    2.4模型四 結(jié)扎盲腸小鼠急性腎損傷模型[24]選用30只C57BL/6小鼠,雄性,6~8 周齡,體重20~25 g。用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為3個(gè)組(10只/組):膿毒癥組(cecum ligation and puncture,CLP組)、膿毒癥+干預(yù)組、S組。首先對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,采用2 %戊巴比妥鈉(80mg/kg),腹腔內(nèi)注射,待小鼠麻醉至合適的麻醉深度后,取仰臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái),進(jìn)一步備皮消毒腹正中部手術(shù)區(qū)域,隨后進(jìn)行各組操作。CLP組:于小鼠腹正中線(xiàn)剖腹切開(kāi),切口約1.5 cm,用鑷子游離小鼠的盲腸和腸系膜,進(jìn)而于回盲部一下位置用無(wú)菌絲線(xiàn)(4號(hào))環(huán)形結(jié)扎盲腸,然后用針頭(20號(hào))于盲腸末端部位進(jìn)行穿刺,嘗試可以擠出糞便即可,接著將盲腸及腹腔內(nèi)組織還納腹腔,逐層進(jìn)行縫合關(guān)腹;術(shù)后將1 ml生理鹽水注入小鼠背部皮下,行體液復(fù)蘇,術(shù)后自由進(jìn)食水。膿毒癥+干預(yù)組:盲腸結(jié)扎及穿刺等造模步驟同CLP組,于造模1 h后,對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射,行藥物或生物制劑干預(yù)處理。S組:余操作同膿毒癥+干預(yù)組,但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔,操作后腹腔內(nèi)注射藥物替換為等量生理鹽水。三組小鼠均于操作完成后24 h進(jìn)行適量麻醉(方法同前),隨后處死取材:經(jīng)一側(cè)眼球取全血,量約7 00~1 000 μL,隨后進(jìn)一步送檢;沿小鼠腹正中線(xiàn)切開(kāi)腹腔,分離暴露主動(dòng)脈以及雙側(cè)腎蒂,采取腎切除術(shù),取雙側(cè)腎組織進(jìn)一步檢驗(yàn)。

    2.5模型五 順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型[25]選用18只C57BL/6清潔級(jí)小鼠,雄性,周齡8周左右,體重22~25 g。隨機(jī)將小鼠分為3組,每組各6只:順鉑10 mg/kg組,順鉑20 mg/kg組,C組。操作前,將順鉑以1 g/L溶于生理鹽水中。順鉑10 mg/kg組:將順鉑以10 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。順鉑20 mg/kg組:將順鉑以20 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。C組:將生理鹽水替代順鉑進(jìn)行注射,劑量為每10g體重單次腹腔注射0.9 %生理鹽水0.2 mL。三組小鼠均于注射藥物72 h后處死,留取血液、尿液標(biāo)本,同時(shí)切開(kāi)腹腔游離腎臟,留取腎組織標(biāo)本,進(jìn)一步送檢。

    3 小鼠AKI模型的分析與選擇

    以上5種模型為近些年來(lái)AKI相關(guān)研究的常用模型,每組模型都有各自的優(yōu)勢(shì)與不足。其中雙側(cè)夾閉缺血再灌注模型省去了單側(cè)腎切除術(shù),降低了術(shù)中意外損傷、出血的風(fēng)險(xiǎn),術(shù)后小鼠恢復(fù)好,存活率高,相對(duì)于其他侵入性操作模型更為簡(jiǎn)單且成功率高,從而降低了模型成本,但是該模型小鼠的代償能力較強(qiáng),術(shù)后腎功能恢復(fù)較快,腎功能損傷相關(guān)生化指標(biāo)變化趨勢(shì)欠明顯;單側(cè)夾閉、對(duì)側(cè)腎切除小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型,降低了小鼠的腎功能代償能力,術(shù)后腎功能損傷較明顯,相關(guān)生化指標(biāo)損傷趨勢(shì)明顯,但對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作要求更高,小鼠容易在造模過(guò)程中意外死亡,術(shù)后存活率較低,故在一定程度上降低了造模成功率,增加了試驗(yàn)成本;甘油注射小鼠急性腎損傷模型,利用了甘油注射后橫紋肌溶解進(jìn)而導(dǎo)致AKI的原理,操作簡(jiǎn)單,小鼠對(duì)操作反應(yīng)較小,且避免了麻醉死亡的風(fēng)險(xiǎn),但該操作對(duì)藥物準(zhǔn)備要求相對(duì)較高,須保證藥物濃度調(diào)配無(wú)誤,劑量精確,同時(shí)應(yīng)熟練掌握操作中的注射方法,如研究?jī)?nèi)容受甘油注射干擾需選擇其他模型;結(jié)扎盲腸小鼠急性腎損傷模型,針對(duì)膿毒癥造成的AKI研究有針對(duì)性意義,由于解剖結(jié)構(gòu)原因,造模中導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p傷的可能性較小,術(shù)后恢復(fù)較好,但該模型的對(duì)操作者解剖基礎(chǔ)要求較高,操作相對(duì)繁瑣,且術(shù)后由于小鼠個(gè)體差異,以及對(duì)感染的耐受不同,模型效果相對(duì)不穩(wěn)定,如研究?jī)?nèi)容受感染因素干擾,應(yīng)考慮選擇其他模型方法;順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型,操作簡(jiǎn)單,操作后AKI效果明顯,避免了麻醉,侵入性操作的風(fēng)險(xiǎn),但該模型的藥物成本更高,同時(shí)要求操作者對(duì)化療藥物的特點(diǎn)及計(jì)量調(diào)整熟練掌握,如化療藥物的使用對(duì)研究?jī)?nèi)容存在干擾應(yīng)考慮其他模型方法。

    4 AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究中動(dòng)物模型的思考與展望

    SIRT作為一種對(duì)于細(xì)胞應(yīng)激、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程具有保護(hù)及調(diào)節(jié)作用的蛋白,以每種模型作為基礎(chǔ)進(jìn)行研究均有其價(jià)值所在。造影劑腎病(Contrast-induced acute kidney injury, CI-AKI)、糖尿病腎病、橫紋肌溶解癥相關(guān)性急性腎損傷、膿毒癥急性腎損傷以及順鉑急性腎損傷均是臨床中棘手的難題,以上模型可在一定程度上模擬相關(guān)臨床疾病的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)而在此模型基礎(chǔ)上的SIRT的研究將進(jìn)一步明確SIRT在各類(lèi)疾病中的影響與相關(guān)機(jī)制,對(duì)各類(lèi)疾病導(dǎo)致的AKI提供線(xiàn)粒體靶向治療的可能性。

    近些年來(lái),隨著冠心病患者從冠脈介入中的臨床獲益程度日益增加,介入治療的相關(guān)并發(fā)癥也逐漸凸顯,其中CI-AKI是臨床中較為常見(jiàn)的問(wèn)題。CI-AKI的基本病理生理過(guò)程是急性腎小管上皮細(xì)胞缺血,以缺血再灌注損傷為基礎(chǔ)的小鼠的AKI模型可較好的模擬CI-AKI,這使得與CI-AKI密切相關(guān)的“腎臟缺血對(duì)線(xiàn)粒體特異性SIRT 的影響及機(jī)制研究”更為可行。該研究具有深刻的現(xiàn)實(shí)意義,對(duì)今后臨床中CI-AKI的防治思路提供了新的契機(jī),值得我們?cè)诮窈蟮膶W(xué)習(xí)中進(jìn)一步關(guān)注。

    猜你喜歡
    造模線(xiàn)粒體腹腔
    傷寒桿菌致感染性腹主動(dòng)脈瘤合并腹腔膿腫1例
    傳染病信息(2022年6期)2023-01-12 08:59:04
    腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型建立方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展
    棘皮動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組研究進(jìn)展
    脾腎陽(yáng)虛型骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型造模方法及模型評(píng)價(jià)
    濕熱證動(dòng)物模型造模方法及評(píng)價(jià)研究
    線(xiàn)粒體自噬與帕金森病的研究進(jìn)展
    胎兒腹腔囊性占位的產(chǎn)前診斷及產(chǎn)后隨訪
    褪黑素通過(guò)抑制p38通路減少腹腔巨噬細(xì)胞NO和ROS的產(chǎn)生
    NF-κB介導(dǎo)線(xiàn)粒體依賴(lài)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑
    潤(rùn)腸通便功能試驗(yàn)中造模劑的選擇
    人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费在线观看完整版高清| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲成人国产一区在线观看| 美国免费a级毛片| av网站在线播放免费| 99国产精品一区二区蜜桃av | 免费在线观看影片大全网站| 人妻久久中文字幕网| 一级片免费观看大全| 国产真人三级小视频在线观看| 秋霞在线观看毛片| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美日韩一级在线毛片| 久久狼人影院| 中文字幕精品免费在线观看视频| 成人三级做爰电影| 超色免费av| 免费在线观看完整版高清| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av男天堂| 午夜福利在线免费观看网站| 国产成人系列免费观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 搡老乐熟女国产| 国产色视频综合| 天堂中文最新版在线下载| 国产日韩欧美亚洲二区| 曰老女人黄片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 三级毛片av免费| 捣出白浆h1v1| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 成人影院久久| 一区在线观看完整版| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 最近中文字幕2019免费版| 国产淫语在线视频| 黄色 视频免费看| 一本大道久久a久久精品| 欧美另类一区| 国产精品偷伦视频观看了| 大陆偷拍与自拍| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲精品在线美女| 国产成人欧美| 五月天丁香电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| av片东京热男人的天堂| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲国产精品999| 中文字幕制服av| 久久精品国产a三级三级三级| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜影院在线不卡| 亚洲三区欧美一区| av不卡在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| tocl精华| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 另类亚洲欧美激情| 丝瓜视频免费看黄片| 老汉色∧v一级毛片| 美女福利国产在线| 欧美大码av| 大片电影免费在线观看免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久精品成人免费网站| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| a级毛片在线看网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 男人舔女人的私密视频| 秋霞在线观看毛片| 无限看片的www在线观看| 两个人看的免费小视频| 人妻久久中文字幕网| 国产熟女午夜一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美日韩av久久| 一级毛片女人18水好多| 亚洲成国产人片在线观看| 男人操女人黄网站| 在线天堂中文资源库| 1024香蕉在线观看| 精品人妻1区二区| 亚洲精品在线美女| 色老头精品视频在线观看| 美女福利国产在线| 最新的欧美精品一区二区| 91成年电影在线观看| avwww免费| 国产成人系列免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产日韩欧美视频二区| 99国产精品一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产中文字幕在线视频| 夜夜夜夜夜久久久久| a在线观看视频网站| 久久99一区二区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩视频在线欧美| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99热国产这里只有精品6| 男女床上黄色一级片免费看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品高清国产在线一区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 视频区图区小说| 亚洲人成电影免费在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩三级视频一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 妹子高潮喷水视频| 又紧又爽又黄一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 大片免费播放器 马上看| 黄色怎么调成土黄色| 免费在线观看黄色视频的| 黄片大片在线免费观看| 亚洲精华国产精华精| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产成人精品久久二区二区91| 国产91精品成人一区二区三区 | 免费不卡黄色视频| 99re6热这里在线精品视频| 乱人伦中国视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 热99re8久久精品国产| 国产黄频视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久免费观看电影| 久久99一区二区三区| 91成年电影在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲第一青青草原| kizo精华| 国产欧美日韩一区二区三 | av线在线观看网站| 涩涩av久久男人的天堂| 纯流量卡能插随身wifi吗| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产精品成人久久小说| 一级毛片女人18水好多| 亚洲综合色网址| 国产麻豆69| 女人精品久久久久毛片| 免费在线观看黄色视频的| 桃红色精品国产亚洲av| 国产黄频视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 黄色a级毛片大全视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人国语在线视频| 精品国产国语对白av| 亚洲全国av大片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久国内视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲九九香蕉| 最近最新中文字幕大全免费视频| 免费观看av网站的网址| 天天操日日干夜夜撸| 狠狠狠狠99中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 午夜福利在线免费观看网站| 天天添夜夜摸| 91成年电影在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| kizo精华| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 女人久久www免费人成看片| 女人久久www免费人成看片| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 日韩人妻精品一区2区三区| 免费在线观看完整版高清| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 啦啦啦免费观看视频1| 精品一区二区三卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲精品一二三| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品九九99| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产三级黄色录像| 成人免费观看视频高清| 男女之事视频高清在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 母亲3免费完整高清在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 丝袜人妻中文字幕| tocl精华| bbb黄色大片| 国产97色在线日韩免费| av片东京热男人的天堂| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲综合色网址| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 中文字幕av电影在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲国产av新网站| 久久 成人 亚洲| 午夜两性在线视频| 亚洲视频免费观看视频| 51午夜福利影视在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 男女国产视频网站| 国产亚洲精品一区二区www | 中文字幕人妻丝袜制服| 国产黄频视频在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲avbb在线观看| 天堂8中文在线网| 美女福利国产在线| 国产在视频线精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产看品久久| 亚洲熟女毛片儿| 欧美成人午夜精品| 黄色 视频免费看| 自线自在国产av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久热这里只有精品99| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产欧美亚洲国产| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产男人的电影天堂91| 国产一区二区 视频在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 午夜福利免费观看在线| 99久久精品国产亚洲精品| 制服人妻中文乱码| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久毛片免费看一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 美国免费a级毛片| 国产又爽黄色视频| 麻豆av在线久日| 国产精品一区二区免费欧美 | 黄频高清免费视频| 精品欧美一区二区三区在线| 岛国在线观看网站| 欧美黑人精品巨大| 日韩大码丰满熟妇| 国产人伦9x9x在线观看| a级毛片黄视频| 久久亚洲精品不卡| 国产成人影院久久av| 午夜免费鲁丝| 啦啦啦啦在线视频资源| av有码第一页| 国产亚洲欧美精品永久| 韩国高清视频一区二区三区| 天天添夜夜摸| 午夜成年电影在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 免费高清在线观看日韩| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| av免费在线观看网站| 精品一品国产午夜福利视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av男天堂| 美国免费a级毛片| avwww免费| 亚洲五月婷婷丁香| 久久热在线av| 亚洲中文字幕日韩| 十八禁网站免费在线| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色怎么调成土黄色| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 十八禁网站网址无遮挡| 香蕉国产在线看| 国精品久久久久久国模美| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 在线精品无人区一区二区三| 波多野结衣一区麻豆| 久久综合国产亚洲精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲成国产人片在线观看| 一级毛片精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 99国产精品免费福利视频| 欧美在线一区亚洲| 伦理电影免费视频| 悠悠久久av| 国产精品.久久久| 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 十八禁网站免费在线| 人人妻人人澡人人看| 一本大道久久a久久精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成年人黄色毛片网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲国产精品一区三区| 久久久精品区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲av国产av综合av卡| 91老司机精品| 涩涩av久久男人的天堂| cao死你这个sao货| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久狼人影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲av成人一区二区三| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久国产精品人妻蜜桃| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人精品在线电影| 国产男女内射视频| 99久久综合免费| 国产欧美日韩一区二区三 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产av又大| 成人国产av品久久久| 国产av精品麻豆| 日本wwww免费看| 一级毛片精品| 午夜福利视频在线观看免费| 国产一区二区三区av在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线永久观看黄色视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 一本久久精品| 热99久久久久精品小说推荐| 麻豆国产av国片精品| 欧美乱码精品一区二区三区| avwww免费| 欧美日韩视频精品一区| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品久久久av美女十八| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 在线观看免费视频网站a站| 国产av又大| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久精品94久久精品| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲av电影在线进入| 91大片在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产在线视频一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品视频人人做人人爽| 午夜福利在线观看吧| 中文字幕高清在线视频| avwww免费| 青草久久国产| 国产成人a∨麻豆精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 99香蕉大伊视频| 丰满少妇做爰视频| 搡老岳熟女国产| 制服诱惑二区| 天堂8中文在线网| 婷婷成人精品国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品一二三| 久9热在线精品视频| 超碰成人久久| 天天影视国产精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 制服人妻中文乱码| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜福利在线观看吧| 真人做人爱边吃奶动态| 久久久精品免费免费高清| 99香蕉大伊视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日本中文国产一区发布| 首页视频小说图片口味搜索| 老司机在亚洲福利影院| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 免费不卡黄色视频| 中文字幕制服av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 最新在线观看一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 精品国产乱码久久久久久男人| 我的亚洲天堂| 久久狼人影院| 久久久久国内视频| 国产精品久久久久成人av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲一区二区精品| 满18在线观看网站| 91精品国产国语对白视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 午夜福利在线观看吧| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美97在线视频| 香蕉国产在线看| av电影中文网址| a级片在线免费高清观看视频| 国产国语露脸激情在线看| 日韩免费高清中文字幕av| avwww免费| 久久性视频一级片| av在线播放精品| 国产成人系列免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久精品区二区三区| 天天添夜夜摸| 国产精品欧美亚洲77777| 激情视频va一区二区三区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久国产一区二区| 激情视频va一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 男人操女人黄网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 婷婷成人精品国产| 美女午夜性视频免费| 久久人妻熟女aⅴ| 窝窝影院91人妻| 在线观看一区二区三区激情| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 中文字幕最新亚洲高清| 男人舔女人的私密视频| 成年人黄色毛片网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄色视频,在线免费观看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲第一青青草原| 色综合欧美亚洲国产小说| 少妇精品久久久久久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产一级毛片在线| 男女之事视频高清在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产一卡二卡三卡精品| 伦理电影免费视频| 国产主播在线观看一区二区| 成人国产av品久久久| 日本av免费视频播放| www日本在线高清视频| 成年人免费黄色播放视频| 日本一区二区免费在线视频| 免费av中文字幕在线| 新久久久久国产一级毛片| 欧美日韩视频精品一区| 欧美成人午夜精品| 69av精品久久久久久 | 99久久99久久久精品蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 两个人免费观看高清视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成年人黄色毛片网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 三上悠亚av全集在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产免费现黄频在线看| 久久99热这里只频精品6学生| 男女床上黄色一级片免费看| 国产片内射在线| 精品人妻在线不人妻| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产av一区二区精品久久| 黄色视频,在线免费观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 大香蕉久久网| 男男h啪啪无遮挡| 1024香蕉在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 91精品三级在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲国产精品一区三区| 18禁国产床啪视频网站| 人妻久久中文字幕网| 亚洲国产看品久久| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产伦人伦偷精品视频| 久久精品国产综合久久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久久久久免费视频了| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品国产乱子伦一区二区三区 | 丰满迷人的少妇在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 多毛熟女@视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 99久久精品国产亚洲精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 一进一出抽搐动态| 成人av一区二区三区在线看 | 又紧又爽又黄一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品人妻在线不人妻| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| h视频一区二区三区| 成人国语在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 天天操日日干夜夜撸| 高清欧美精品videossex| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品乱久久久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看人妻少妇| av又黄又爽大尺度在线免费看| 少妇精品久久久久久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 美女午夜性视频免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 两个人免费观看高清视频| 久久久精品94久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 正在播放国产对白刺激| 国产欧美日韩一区二区三 | 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利在线观看吧| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精华国产精华精| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲中文字幕日韩| 最新的欧美精品一区二区| 日韩一区二区三区影片| 久久久国产成人免费| 自线自在国产av| 一本色道久久久久久精品综合| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产成人免费观看mmmm| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线观看免费高清a一片| 51午夜福利影视在线观看| 午夜两性在线视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 丁香六月天网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人影院久久| 国产又色又爽无遮挡免| 久久影院123| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品.久久久| 中国国产av一级| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 自线自在国产av| 日本wwww免费看| 国产成人欧美在线观看 | 电影成人av| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久人人爽人人片av| 欧美日韩成人在线一区二区| 动漫黄色视频在线观看| 香蕉国产在线看| 欧美日韩亚洲高清精品| 99久久国产精品久久久| 亚洲少妇的诱惑av|