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    急性腎損傷相關(guān)性SIRT研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P头治?

    2019-12-05 05:11:32賈圣琪裴漢軍
    關(guān)鍵詞:造模線(xiàn)粒體腹腔

    賈圣琪, 裴漢軍

    (1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2016級(jí)碩士研究生,內(nèi)蒙古 包頭 014060;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

    AKI是一組常見(jiàn)的臨床綜合證,一般指突發(fā)(1~7 d內(nèi))和持續(xù)(>24 h)的腎功能突然下降[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),AKI可造成腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)失衡,從而導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂。同時(shí),在體和離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,AKI可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)膜的呼吸鏈相關(guān)酶活性異常,以及線(xiàn)粒體通透性改變[3]。另一方面,AKI可引起線(xiàn)粒體分裂蛋白Drp1大量激活,導(dǎo)致線(xiàn)粒體分裂、片斷化、腎小管上皮細(xì)胞凋亡[4-5]。

    SIRT是依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶的具有去乙酰化活性的一大類(lèi)進(jìn)化保守蛋白家族,可調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程,共有7種亞型(SIRT1~7)[6-7]。近期研究顯示,多種原因?qū)е碌哪I臟損傷會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體SIRT水平下降,其水平變化與腎功能損傷加重,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,能量代謝異常,線(xiàn)粒體的裂解融合失衡,以及細(xì)胞凋亡水平升高明顯相關(guān)。這些研究提示SIRT將成為線(xiàn)粒體靶向治療AKI的新思路[8-12]。

    目前,SIRT的研究趨于火熱,而各種研究對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷倪x擇又有所不同,選擇正確的動(dòng)物模型對(duì)于SIRT蛋白功能的研究至關(guān)重要。本文以上研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P妥龀鋈缦戮C述。

    1 AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究的模型動(dòng)物選擇

    如今,可用于AKI模型建立的試驗(yàn)動(dòng)物多種多樣,但實(shí)際選擇中,動(dòng)物經(jīng)濟(jì)成本、試驗(yàn)周期的控制,以及造模效果等因素都是制約試驗(yàn)動(dòng)物選擇的關(guān)鍵因素[13]。

    非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物十分稀缺,數(shù)量有限,模型建立后的數(shù)據(jù)難以構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且成本高昂,造模要求高,故目前鮮有選擇;貓、狗在生理學(xué)特性以及對(duì)藥物和毒物反應(yīng)上與人類(lèi)有相似之處,但其選擇往往受到動(dòng)物保護(hù)主義及倫理問(wèn)題限制,同時(shí)造模條件嚴(yán)格,經(jīng)濟(jì)成本高,故依然選擇較少;小型豬、兔、大鼠在造模選擇中雖然較少受到動(dòng)物保護(hù)及倫理的影響,但其對(duì)腎臟損傷耐受較強(qiáng),故試驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致造模周期延長(zhǎng),同時(shí)實(shí)驗(yàn)個(gè)體的生長(zhǎng)周期久,難以在較短時(shí)間大量繁殖培育,故大量選擇會(huì)較高提升實(shí)驗(yàn)成本,因此以上三者的選擇同樣存在較多顧慮。

    在眾多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,小鼠是目前世界上品種、品系最多,使用量最大且研究最為詳盡、用途最廣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其在遺傳、腫瘤、免疫等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。同時(shí),在生理特點(diǎn)方面具有較多優(yōu)勢(shì)。首先,小鼠生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)周期短、成熟早,有利于繁殖生產(chǎn);其次,個(gè)體體型較小,便于試驗(yàn)操作,模型建立要求較低;再有,小鼠的生理數(shù)據(jù)使用較為普遍,已有大量研究支持,受到長(zhǎng)期討論證實(shí);最后,小鼠對(duì)外界刺激耐受較差,對(duì)試驗(yàn)干預(yù)更為敏感,造模效果較其他動(dòng)物有明顯優(yōu)勢(shì)。綜合考慮,小鼠飼養(yǎng)管理方便,容易達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化,造模成本低、效果好,在急性腎損傷相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT改變的研究中脫穎而出,經(jīng)過(guò)多重因素的篩選,小鼠成為目前較受歡迎的試驗(yàn)動(dòng)物[14-15]。

    然而,小鼠品種、品系繁多,各自的生理特點(diǎn)有所不同,選擇合適的品種、品系是試驗(yàn)?zāi)P徒⒌年P(guān)鍵問(wèn)題。近些年來(lái),急性腎損傷相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT改變的研究中,C57BL/6小鼠被廣泛使用。該小鼠被認(rèn)作“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系,并且已經(jīng)完成其基因序列的測(cè)定,在遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)研究中均為常用品系。在該研究的試驗(yàn)?zāi)P椭校渖飳W(xué)特征有以下優(yōu)勢(shì):第一,乳腺腫瘤的自然發(fā)生率低,致癌劑使用難以誘發(fā)腫瘤,故試驗(yàn)干預(yù)造成小鼠癌變可能較小,病理標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定;第二,對(duì)放射線(xiàn)耐受力中等,造模中如涉及放射干預(yù),動(dòng)物反應(yīng)更為敏感;第三,補(bǔ)體活性高,較易誘發(fā)免疫耐受性,試驗(yàn)操作受到動(dòng)物免疫因素干擾較??;第四,因常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系,故為許多突變基因提供遺傳背景,同時(shí)在試驗(yàn)?zāi)P偷慕⒅?,為培育SIRT基因剔除小鼠提供了試驗(yàn)基礎(chǔ),使試驗(yàn)?zāi)P偷姆纸M對(duì)比上升到了基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)層面,嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性進(jìn)一步得到提升。綜上可知,C57BL/6小鼠的選擇對(duì)此研究更具說(shuō)服力[16-18]。

    2 小鼠AKI模型的建立

    AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究的基礎(chǔ)是在試驗(yàn)動(dòng)物水平建立起AKI模型,該模型的可行性、科學(xué)性缺一不可,同時(shí)又需要對(duì)研究方向做出針對(duì)性的調(diào)整。目前AKI的造模方式多種多樣,針對(duì)SIRT的研究卻很有限,因此選擇合適AKI模型就顯得至關(guān)重要。以下列舉近些年相關(guān)研究的常用AKI模型思路,以便進(jìn)一步分析思考。

    2.1模型一 雙側(cè)夾閉小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型[19-20]選用C57BL/6雄性小鼠,6~8周齡,體重20~25 g,用隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組(Control Group,C組),假手術(shù)組(sham operated group,S組)、缺血再灌注組(Ischemia reperfusion injury Group,IR組),其中C組4只、S組32只、IR組32只。C組:不予手術(shù)處理。S組:用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通過(guò)腹腔注射的方式麻醉小鼠,隨后取腹部正中切口切開(kāi)腹壁,暴露、游離雙側(cè)腎蒂,不進(jìn)行腎蒂夾閉操作,其余同IR組。IR組:用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通過(guò)腹腔注射的方式麻醉小鼠,隨后取腹部正中切口切開(kāi)腹壁,暴露、游離雙側(cè)腎蒂,進(jìn)而用無(wú)損傷止血夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂,腎臟由紅色變?yōu)樽仙醋C明已造成腎臟缺血,夾閉成功,進(jìn)一步夾閉持續(xù)30 min;夾閉時(shí)間結(jié)束后,打開(kāi)微動(dòng)脈止血夾恢復(fù)腎臟供血,若腎臟顏色變化為由紫黑色逐漸恢復(fù)紅色,證明再灌注成功;再灌注完成后,逐層縫合腹部創(chuàng)口。操作全程注意無(wú)菌原則,同時(shí)術(shù)中如有重要器官或大血管損傷,應(yīng)及時(shí)剔除。待S組、IR組小鼠術(shù)后清醒后,將其放回籠中,密切關(guān)注其生命體征。S組和IR組小鼠分別于再灌注0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h,5 d、7 d處死采樣(4只/時(shí)間點(diǎn))。

    2.2模型二 單側(cè)夾閉、對(duì)側(cè)腎切除小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型[21-22]選用24只C57BL/6小鼠,雄性,體重25~28 g,隨機(jī)將小鼠分為三個(gè)組(8只/組):S組、IR組、干預(yù)處理+IR組。每只小鼠均通過(guò)吸入異氟烷的方式麻醉。IR組:腹部皮膚中央?yún)^(qū)域碘伏消毒,腹部正中切口剖腹,游離雙側(cè)腎蒂,左側(cè)腎門(mén)部結(jié)扎腎動(dòng)脈和輸尿管,切除左側(cè)腎臟,留取腎臟組織標(biāo)本;右側(cè)腎蒂用無(wú)損傷微動(dòng)脈止血夾夾閉(腎臟顏色由櫻桃紅轉(zhuǎn)為深紫色即為夾閉成功),持續(xù)夾閉30 min,夾閉時(shí)間結(jié)束后,松開(kāi)止血夾恢復(fù)腎臟灌注(腎臟由深紫色恢復(fù)櫻桃紅色);操作結(jié)束后,縫合腹部創(chuàng)口,將術(shù)后小鼠放置于保溫加熱板上,直至小鼠清醒。S組:同樣進(jìn)行麻醉、消毒、腹部切開(kāi)操作,術(shù)后保溫自然蘇醒,但不進(jìn)行左側(cè)腎切除,右側(cè)腎蒂夾閉操作。干預(yù)處理+IR組:于術(shù)前或術(shù)后對(duì)小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)操作,其余處理同IR組。各組小鼠均于腎臟再灌注后24 h處死取材(經(jīng)眼球靜脈叢取血,開(kāi)腹取腎臟組織),進(jìn)一步送檢分析。

    2.3模型三 甘油注射小鼠急性腎損傷模型[23]選用18只C57BL/6清潔級(jí)小鼠,雄性,6~8 周齡,體重18~22 g,隨機(jī)分為3組(6只/組):C組,AKI組,干預(yù)處理+AKI組。各組小鼠均在操作前禁水12 h。C組:在小鼠雙側(cè)股肌內(nèi)側(cè)注射生理鹽水(8 ml/kg)。AKI組:將用PBS稀釋后的50 %甘油,于小鼠雙側(cè)股肌內(nèi)側(cè)注射,劑量為8 ml/kg。干預(yù)處理+AKI組:甘油注射同AKI組,造模6 h后,進(jìn)行干預(yù)處理,于小鼠尾靜脈注射藥物或生物制劑200 μL。實(shí)驗(yàn)階段全程對(duì)小鼠進(jìn)行分籠清潔級(jí)動(dòng)物喂養(yǎng),室溫保持在20℃左右,相對(duì)濕度為40 %~60 %。操作結(jié)束3 d后,處死全部小鼠,并取血及雙側(cè)腎臟進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)分析。

    2.4模型四 結(jié)扎盲腸小鼠急性腎損傷模型[24]選用30只C57BL/6小鼠,雄性,6~8 周齡,體重20~25 g。用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為3個(gè)組(10只/組):膿毒癥組(cecum ligation and puncture,CLP組)、膿毒癥+干預(yù)組、S組。首先對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,采用2 %戊巴比妥鈉(80mg/kg),腹腔內(nèi)注射,待小鼠麻醉至合適的麻醉深度后,取仰臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái),進(jìn)一步備皮消毒腹正中部手術(shù)區(qū)域,隨后進(jìn)行各組操作。CLP組:于小鼠腹正中線(xiàn)剖腹切開(kāi),切口約1.5 cm,用鑷子游離小鼠的盲腸和腸系膜,進(jìn)而于回盲部一下位置用無(wú)菌絲線(xiàn)(4號(hào))環(huán)形結(jié)扎盲腸,然后用針頭(20號(hào))于盲腸末端部位進(jìn)行穿刺,嘗試可以擠出糞便即可,接著將盲腸及腹腔內(nèi)組織還納腹腔,逐層進(jìn)行縫合關(guān)腹;術(shù)后將1 ml生理鹽水注入小鼠背部皮下,行體液復(fù)蘇,術(shù)后自由進(jìn)食水。膿毒癥+干預(yù)組:盲腸結(jié)扎及穿刺等造模步驟同CLP組,于造模1 h后,對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射,行藥物或生物制劑干預(yù)處理。S組:余操作同膿毒癥+干預(yù)組,但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔,操作后腹腔內(nèi)注射藥物替換為等量生理鹽水。三組小鼠均于操作完成后24 h進(jìn)行適量麻醉(方法同前),隨后處死取材:經(jīng)一側(cè)眼球取全血,量約7 00~1 000 μL,隨后進(jìn)一步送檢;沿小鼠腹正中線(xiàn)切開(kāi)腹腔,分離暴露主動(dòng)脈以及雙側(cè)腎蒂,采取腎切除術(shù),取雙側(cè)腎組織進(jìn)一步檢驗(yàn)。

    2.5模型五 順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型[25]選用18只C57BL/6清潔級(jí)小鼠,雄性,周齡8周左右,體重22~25 g。隨機(jī)將小鼠分為3組,每組各6只:順鉑10 mg/kg組,順鉑20 mg/kg組,C組。操作前,將順鉑以1 g/L溶于生理鹽水中。順鉑10 mg/kg組:將順鉑以10 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。順鉑20 mg/kg組:將順鉑以20 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。C組:將生理鹽水替代順鉑進(jìn)行注射,劑量為每10g體重單次腹腔注射0.9 %生理鹽水0.2 mL。三組小鼠均于注射藥物72 h后處死,留取血液、尿液標(biāo)本,同時(shí)切開(kāi)腹腔游離腎臟,留取腎組織標(biāo)本,進(jìn)一步送檢。

    3 小鼠AKI模型的分析與選擇

    以上5種模型為近些年來(lái)AKI相關(guān)研究的常用模型,每組模型都有各自的優(yōu)勢(shì)與不足。其中雙側(cè)夾閉缺血再灌注模型省去了單側(cè)腎切除術(shù),降低了術(shù)中意外損傷、出血的風(fēng)險(xiǎn),術(shù)后小鼠恢復(fù)好,存活率高,相對(duì)于其他侵入性操作模型更為簡(jiǎn)單且成功率高,從而降低了模型成本,但是該模型小鼠的代償能力較強(qiáng),術(shù)后腎功能恢復(fù)較快,腎功能損傷相關(guān)生化指標(biāo)變化趨勢(shì)欠明顯;單側(cè)夾閉、對(duì)側(cè)腎切除小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型,降低了小鼠的腎功能代償能力,術(shù)后腎功能損傷較明顯,相關(guān)生化指標(biāo)損傷趨勢(shì)明顯,但對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作要求更高,小鼠容易在造模過(guò)程中意外死亡,術(shù)后存活率較低,故在一定程度上降低了造模成功率,增加了試驗(yàn)成本;甘油注射小鼠急性腎損傷模型,利用了甘油注射后橫紋肌溶解進(jìn)而導(dǎo)致AKI的原理,操作簡(jiǎn)單,小鼠對(duì)操作反應(yīng)較小,且避免了麻醉死亡的風(fēng)險(xiǎn),但該操作對(duì)藥物準(zhǔn)備要求相對(duì)較高,須保證藥物濃度調(diào)配無(wú)誤,劑量精確,同時(shí)應(yīng)熟練掌握操作中的注射方法,如研究?jī)?nèi)容受甘油注射干擾需選擇其他模型;結(jié)扎盲腸小鼠急性腎損傷模型,針對(duì)膿毒癥造成的AKI研究有針對(duì)性意義,由于解剖結(jié)構(gòu)原因,造模中導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p傷的可能性較小,術(shù)后恢復(fù)較好,但該模型的對(duì)操作者解剖基礎(chǔ)要求較高,操作相對(duì)繁瑣,且術(shù)后由于小鼠個(gè)體差異,以及對(duì)感染的耐受不同,模型效果相對(duì)不穩(wěn)定,如研究?jī)?nèi)容受感染因素干擾,應(yīng)考慮選擇其他模型方法;順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型,操作簡(jiǎn)單,操作后AKI效果明顯,避免了麻醉,侵入性操作的風(fēng)險(xiǎn),但該模型的藥物成本更高,同時(shí)要求操作者對(duì)化療藥物的特點(diǎn)及計(jì)量調(diào)整熟練掌握,如化療藥物的使用對(duì)研究?jī)?nèi)容存在干擾應(yīng)考慮其他模型方法。

    4 AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究中動(dòng)物模型的思考與展望

    SIRT作為一種對(duì)于細(xì)胞應(yīng)激、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程具有保護(hù)及調(diào)節(jié)作用的蛋白,以每種模型作為基礎(chǔ)進(jìn)行研究均有其價(jià)值所在。造影劑腎病(Contrast-induced acute kidney injury, CI-AKI)、糖尿病腎病、橫紋肌溶解癥相關(guān)性急性腎損傷、膿毒癥急性腎損傷以及順鉑急性腎損傷均是臨床中棘手的難題,以上模型可在一定程度上模擬相關(guān)臨床疾病的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)而在此模型基礎(chǔ)上的SIRT的研究將進(jìn)一步明確SIRT在各類(lèi)疾病中的影響與相關(guān)機(jī)制,對(duì)各類(lèi)疾病導(dǎo)致的AKI提供線(xiàn)粒體靶向治療的可能性。

    近些年來(lái),隨著冠心病患者從冠脈介入中的臨床獲益程度日益增加,介入治療的相關(guān)并發(fā)癥也逐漸凸顯,其中CI-AKI是臨床中較為常見(jiàn)的問(wèn)題。CI-AKI的基本病理生理過(guò)程是急性腎小管上皮細(xì)胞缺血,以缺血再灌注損傷為基礎(chǔ)的小鼠的AKI模型可較好的模擬CI-AKI,這使得與CI-AKI密切相關(guān)的“腎臟缺血對(duì)線(xiàn)粒體特異性SIRT 的影響及機(jī)制研究”更為可行。該研究具有深刻的現(xiàn)實(shí)意義,對(duì)今后臨床中CI-AKI的防治思路提供了新的契機(jī),值得我們?cè)诮窈蟮膶W(xué)習(xí)中進(jìn)一步關(guān)注。

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