結(jié)直腸癌檢測的生物標(biāo)志物研究進展

陳曉菲，高 媛，尤洪蘭，張紅明，于 農(nóng)

（蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州215129）

癌癥是世界范圍的健康問題，也是很多國家人口死亡的主要原因［1］。全球每年都有約140萬例惡性腫瘤病例，死亡人數(shù)達到70萬人。其中，結(jié)直腸癌（CRC）是位居全球惡性腫瘤的第三位，其死亡率也位居第四位［2］。最近的一項估計表明，到2030年，預(yù)計將增加60%的結(jié)直腸癌病例，也就是即將有超過220萬例新病例，死亡人數(shù)也將達110萬［3］。作為癌癥發(fā)病人數(shù)全球第一的中國，國家癌癥中心于2017年11月發(fā)布了《中國腫瘤的現(xiàn)狀和趨勢》，報告中指出，結(jié)腸直癌在我國無論是發(fā)病率還是死亡率都一直穩(wěn)居前五的位置，提高對于結(jié)直腸癌的認識刻不容緩。對于結(jié)直腸癌的檢測、診斷、治療，可以為預(yù)防結(jié)直腸癌惡化提供有效的手段，提高結(jié)直腸癌治愈率及患者生存率［4］。

為完善對結(jié)直腸癌的預(yù)測和預(yù)后，美國癌癥聯(lián)合委員會更新了癌癥分期系統(tǒng)，在結(jié)直腸癌的檢測方法中增加了新的預(yù)后和預(yù)測因素，以便于基于組織病理學(xué)以及分子生物學(xué)的非侵入性診斷方法的應(yīng)用。推薦的方法中，除了臨床解剖學(xué)特征指標(biāo)，還包括常規(guī)檢測抗原、相關(guān)蛋白激酶、特征基因改變檢驗等多種方法。開發(fā)出更多的腫瘤檢驗生物標(biāo)志物，有利于精確地診斷結(jié)直腸癌的階段和預(yù)后，為結(jié)直腸癌治療提供最直觀的建議。

1 常規(guī)結(jié)直腸癌檢驗標(biāo)志物

常規(guī)血清癌胚抗原（CEA）、糖蛋白抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9）與某些組織分子相關(guān)的值是常用的結(jié)直腸癌預(yù)測及預(yù)后檢驗診斷的生物標(biāo)志物。其中，癌胚抗原是在結(jié)直腸癌治療和后期進行監(jiān)測的具有公認功效的腫瘤標(biāo)志物，也是目前已知指南中推薦用于CRC監(jiān)測和預(yù)后的唯一血液標(biāo)志物［5］。癌胚抗原是在1965年被發(fā)現(xiàn)的，最初，它被認為是具有結(jié)直腸癌特異性的，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)在其他組織如胰腺、胃、支氣管、乳腺等癌癥中也能檢測到該抗原。從預(yù)后的角度來看，在患者術(shù)前通過檢驗手段確定CEA水平，有助于確定患者預(yù)后的預(yù)期壽命［6］。持續(xù)升高的CEA水平就可能指示腫瘤組織存在浸潤或者轉(zhuǎn)移，術(shù)后CEA水平緩慢增加是腫瘤局部復(fù)發(fā)的典型癥狀，而動態(tài)升高則說明可能腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移［7］。

最初，CA 19-9是在人類結(jié)直腸癌細胞系中鑒定出來的黏蛋白樣產(chǎn)物，它是在正常人組織中表達的腫瘤相關(guān)抗原而非腫瘤特異性抗原［8］。其在血清中水平升高是診斷上消化道腺癌和結(jié)直腸癌的重要標(biāo)志物，CA 19-9水平升高是檢驗?zāi)[瘤預(yù)后不良的因素。

然而，目前的一系列研究結(jié)果說明在診斷時僅使用CEA或CA 19-9缺乏靈敏度和特異性［9-10］，尤其CA 19-9對于腫瘤的的靈敏度遠低于CEA［11］。因此，需要發(fā)現(xiàn)更多的結(jié)直腸癌檢驗診斷的生物標(biāo)志物。目前，F(xiàn)DA也已經(jīng)批準(zhǔn)了CRC早期診斷的甲基化標(biāo)志物進行商業(yè)實驗，如SEPT9、NDRG4、BMP3等（商品名EpiproColon?和Cologuard）［12-13］，然而，從預(yù)后或者預(yù)測的角度來看，臨床上還是沒有出現(xiàn)最適合的標(biāo)志物。

2 新檢驗標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)

隨著診斷醫(yī)學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們對于信號通路的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)了眾多腫瘤檢驗相關(guān)的標(biāo)志物，隨著這些標(biāo)志物數(shù)量的增長，代表了腫瘤高度多樣化的生物結(jié)構(gòu)以及不同的細胞階段。在腫瘤發(fā)展過程中，相關(guān)標(biāo)志物的水平可能是動態(tài)的，即使是在相同疾病的不同患者體內(nèi)，典型的腫瘤標(biāo)志物也可能各不相同。因此，確認在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)不同的腫瘤檢驗標(biāo)志物對于個體化精準(zhǔn)治療的實施也具有很重要的意義。基因工程的發(fā)展更有利于建立完善的預(yù)測和預(yù)后體系，為結(jié)直腸癌的治療從群體化向個體化發(fā)展以及個性化用藥的實現(xiàn)提供基礎(chǔ)。目前對新的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)集中于蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)及其他相關(guān)方面的研究。

2.1 結(jié)直腸癌相關(guān)蛋白標(biāo)志物

作為目前癌癥治療的一個重要策略，血管生成相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物的表達研究在結(jié)直腸癌預(yù)測預(yù)后指標(biāo)的建立中有很大的潛力［14］。通過對正常細胞和惡性結(jié)直腸組織血管內(nèi)皮細胞的基因表達分析顯示，腫瘤內(nèi)皮細胞內(nèi)特異性升高的46個轉(zhuǎn)錄物中，有9種轉(zhuǎn)錄物可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)，命名為腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物（TEM）。TEM在人類腫瘤內(nèi)皮中的表達量是正常細胞的20倍，可能有助于區(qū)分腫瘤和正常內(nèi)皮細胞［15］。其中TEM1可能是由腫瘤細胞大量繁殖造成高密度及缺氧環(huán)境調(diào)控表達，其在遠端正常黏膜和原發(fā)腫瘤間基質(zhì)中表達顯著增加，說明TEM1可能參與腫瘤侵襲（進展和轉(zhuǎn)移）。因此，可以設(shè)計靶向TEM1的抗體用于腫瘤的治療。TEM5和TEM7也與腫瘤相關(guān)血管系統(tǒng)的過度表達有關(guān)［16］，TEMs的檢測也較為簡便，可以是未來腫瘤檢驗的一個有用標(biāo)志物。

腫瘤向遠端轉(zhuǎn)移的一個重要因素就是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在結(jié)直腸癌中，有多個蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這些蛋白標(biāo)志物可以用于表征體內(nèi)存在侵襲性的原發(fā)腫瘤，可以作為評價腫瘤預(yù)后的蛋白標(biāo)志物。其中，受體-酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ROR1）的過度表達就與某些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［17］。Western blot和免疫組化結(jié)果顯示，ROR1在結(jié)直腸癌中的表達明顯高于癌旁正常組織。同時，ROR1表達與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.01）。生存分析顯示，ROR1表達較高的患者總生存期明顯縮短（P＜0.01）。說明ROR1表達與惡性屬性相關(guān)，并且可以作為結(jié)腸直腸癌檢測的新型預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。另一個結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移潛在標(biāo)志物絲氨酸-蘇氨酸激酶31（STK31），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)的表達水平顯著升高［18］。免疫組化和實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，STK31的表達高于淋巴結(jié)樣品中的RNA水平和蛋白質(zhì)水平，因此也可能是監(jiān)控和預(yù)測結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險的潛在生物標(biāo)志物。同樣地，通過免疫組化方法比較腫瘤組織與非腫瘤鄰近組織中醛脫氫酶1A1（ALDH1A1）的表達，結(jié)果顯示，CRC組織中ALDH1A1蛋白表達顯著增加。在CRC患者中，ALDH1A1蛋白表達增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在顯著相關(guān)：N0病例中為64.28%；N1例病例占75.49%；在N2情況下為82.14%，（P＝0.002）。因此，CRC組織中ALDH1A1蛋白的表達可能是CRC患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物［19］。

質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展給候選蛋白的驗證帶來了新的方法。選擇性反應(yīng)監(jiān)測（SRM）是一種具有高分辨率高精度的靶蛋白組學(xué)方法，三重四極質(zhì)譜儀即可以完成該檢測。通過這種方法可以驗證多個候選的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物［20］。有研究利用SRM進行靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析估算患者血清胞外囊泡成分中的候選蛋白，確定了一些潛在的早期診斷結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志候選物。通過對SRM驗證得到的37個肽進行ROC分析，發(fā)現(xiàn)其中有3個肽類是高度敏感，AUC在0.7～0.9，而通過SPSS軟件進行基于邏輯回歸的候選標(biāo)志物組合分析發(fā)現(xiàn)，將肽類進行組合后，得到的靈敏度可以進一步提高。特別是有8種肽類組合的AUC均大于0.9，其中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白1、中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白、血管生成素-1這三種蛋白組合的AUC可以達到0.97，說明多種標(biāo)志物結(jié)合可以提高CRC早期診斷的準(zhǔn)確性。而在SRM驗證的肽類中，有17種肽類的靈敏度都超過了CEA［21］。

2.2 結(jié)直腸癌相關(guān)核酸標(biāo)志物

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是微衛(wèi)星染色體的編碼和非編碼序列的變化，比如重復(fù)的DNA序列的增殖或丟失，這會導(dǎo)致腫瘤細胞中微衛(wèi)星區(qū)域的縮短或延伸。錯配修復(fù)基因（MMR）可以消除這些突變，因此，MSI可能是由這些基因的突變引起的［22］。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可分為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高（MSI-H）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性低（MSI-L），這取決于與MSI特征相關(guān)基因座的百分比。在CRC II期和III期患者的回顧性研究分析中發(fā)現(xiàn)，無論癌癥的進展如何，MSI-H都是改善總體生存的預(yù)測因素，與MSI-L或缺乏MSI特征的腫瘤細胞相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較低［23］。MSI可能是預(yù)后的一個重要檢測因素。

DNA基因的突變也是腫瘤細胞大量增殖的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，12號染色體短臂上第12位密碼子（80%的患者）或13位密碼子的KRAS基因突變可以作為患者接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療的生物標(biāo)志物［24］。在許多實體瘤中都存在編碼磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的p110α催化亞基的基因突變，包括CRC。PIK3CA基因在10%～20%的CRC腫瘤中發(fā)生突變。與PIK3CA野生型腫瘤患者相比，PIK3CA突變腫瘤患者的結(jié)直腸癌特異性死亡率增加［25］。在患有KRAS野生型腫瘤的患者中，PIK3CA突變的存在與結(jié)直腸癌特異性死亡率的顯著增加相關(guān)。相反，PIK3CA突變對KRAS突變腫瘤患者的死亡率沒有顯著影響。而對于伊立替康治療患者來說，其UGT1A1基因多態(tài)性又是潛在毒性的重要生物標(biāo)志物。在使用伊立替康治療前檢測其UGT1A1基因，可以避免產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng)。上述結(jié)果說明不同基因位點的突變可能獨立影響了腫瘤的預(yù)測或者預(yù)后效果，因此，也有必要對于腫瘤患者基因組中特定生物標(biāo)志物進行檢測，以利于個體化精準(zhǔn)化治療的順利實施。

在過去十年中，對小RNA（miRNA）功能的研究改變了我們對細胞和疾病的理解，尤其是在癌癥生物學(xué)方面。因此，越來越多的人開始將它們作為癌癥治療過程中能夠揭示疾病進展和預(yù)后的生物標(biāo)志物的候選物［26］?；趍iRNA的分析是非侵入性的，它們在癌癥檢測過程中具有高度的靈敏度，選擇性和特異性。另外，用于miRNA分析的工具簡便易用，如實時定量PCR［27］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多具有生物標(biāo)志物潛力的miRNA。使用微陣列檢查來自相同CRC患者的血漿外泌體，原發(fā)性腫瘤組織和肝轉(zhuǎn)移組織的miRNA譜。結(jié)果顯示，在三者中，miR-21水平都高度上調(diào)。高外顯子-miR-21患者的總生存率和無病生存率明顯低于低miR-21患者。血漿外泌體miR-21水平檢測是用于預(yù)測II期，III期或IV期CRC患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的重要生物標(biāo)志物［28］。WANG等［29］研究了CRC中的miRNA-552水平。他們指出也可以使用miR-552作為生物標(biāo)志物來進行CRC預(yù)后不良的預(yù)測。事實上，miR-552促進腫瘤細胞增殖和遷移，在晚期的CRC中表達水平也更高［30］。

也有研究顯示，miR626852在CRC組織中與鄰近的正常組織相比表達不足，miR626852的過表達能顯著抑制CRC細胞的增殖和侵襲。miR626852的表達與CRC轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，而與患者預(yù)后呈正相關(guān)。進一步的研究顯示，TCF7是CRC細胞中miR626852的直接靶標(biāo)。過表達miR626852可顯著抑制CRC細胞中TCF7的mRNA和蛋白水平［31］。miR626852通過靶向TCF7可以在CRC治療中起抑制腫瘤的作用，這也是CRC臨床檢驗的一個潛在指標(biāo)。

另外，包括CRC在內(nèi)的很多腫瘤中，都存在啟動子高度甲基化引起的腫瘤相關(guān)基因的表觀遺傳沉默。在很多CRC患者的血液中都能檢測到腫瘤特異性的DND甲基化，研究發(fā)現(xiàn)，在CRC患者中，MAL、SEPT9、TAC1、NELL1、CRABP1、SST及EYA4這七個基因甲基化程度更高［32-33］。這些血清中甲基化的基因?qū)τ贑RC預(yù)后或預(yù)測具有一定的潛力。血清中另一類標(biāo)志物，長鏈非編碼RNA（lncRNA）也是宿主-腫瘤應(yīng)答的重要介質(zhì)。如Gas5與結(jié)腸癌大小就呈負相關(guān)［34］，lncRNA UICLM則作為miR-215的一種競爭性的內(nèi)源RNA，即ceRNA，調(diào)控ZEB2的的表達，促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生［35］。而lncRNA h19可以與miR-138和miR-200a競爭，拮抗其功能，影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進腫瘤發(fā)展，從而作為預(yù)測的的標(biāo)志物［36］。以上研究說明lncRNA可能同時涉及多個基因的表達，調(diào)節(jié)腫瘤進展過程中的多個途徑，對其進行檢測，可能有利于更好地對CRC進行預(yù)測或預(yù)后分析。

2.3 結(jié)直腸癌相關(guān)其他標(biāo)志物

最近的研究表明，基于生物流體的代謝組學(xué)也可以識別潛在的CRC診斷代謝標(biāo)志物。采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）249例CRC患者的血清代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，CRC患者有明顯的代謝特征，其中，有72個代謝產(chǎn)物有特征性表達，涉及了三羧酸（TCA）循環(huán)、尿素循環(huán)、谷氨酰胺、脂肪酸和腸道菌群代謝，均與正常人群不同［37］。在CRC患者中，油酸、鳥氨酸是具有最顯著差異的兩種代謝產(chǎn)物，丙酮酸鹽在CRC患者中的水平也高于健康對照組，而一些TCA循環(huán)中間產(chǎn)物，如富馬酸和順式烏頭酸，在CRC患者中呈現(xiàn)耗竭狀態(tài)。另外，在CRC組織中氨基酸水平高，而血清中氨基酸缺失，這可能是由于癌細胞中氨基酸消耗量增加所致。有報告顯示CRC患者溶血酶水平降低，脂肪酸合成酶表達增加。也有研究發(fā)現(xiàn)，CRC男性患者糞便脂肪酸代謝組特征的變化，尤其是總ω-6多不飽和脂肪酸中的亞油酸水平，顯著高于健康男性，因此，糞便脂肪酸也可能是CRC檢驗工作中的新型篩查工具［38］。這些代謝變化是有標(biāo)志性的，因此，采用一組血清代謝產(chǎn)物標(biāo)志物作為CRC預(yù)測的方法也具有很大的潛力

除了常規(guī)標(biāo)志物，目前也發(fā)現(xiàn)了很多其他類型的生物標(biāo)志物。比如年齡對于MSI的影響。在老年人（≥50歲）群體中，高患病率（79%）與MSI中MLH1基因丟失相關(guān)，這種MMR失活模式是由甲基化沉默來驅(qū)動的［39］。而在≤30歲的CRC患者中，出現(xiàn)了廣泛的MMR基因丟失與BRAF突變，這與老年人MMR有所不同［23］。另外，也有研究顯示，活化凝血系統(tǒng)的程度與某些惡性腫瘤（包括結(jié)直腸癌）的腫瘤分期和預(yù)后相關(guān)［40］。纖維蛋白降解的終產(chǎn)物D-二聚體在較大腫瘤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管入侵的患者中顯著升高。在另一項試驗中，晚期和復(fù)發(fā)性CRC患者中血漿D-二聚體水平高的患者存活率明顯縮短［41］。腫瘤基質(zhì)細胞對尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）的結(jié)合激活纖溶酶原，u-PA的生物活性對局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移起重要作用。這種侵襲性在臨床上反映為升高的纖維蛋白降解產(chǎn)物，即較高的D-二聚體水平與較高的疾病階段。因此，在凝血和纖維蛋白溶解系統(tǒng)中的腫瘤相關(guān)降解產(chǎn)物的檢測可用作腫瘤負荷和結(jié)果的預(yù)測因子。

個體化精準(zhǔn)治療的發(fā)展，給CRC治療過程中用藥的選擇性也帶來了新的挑戰(zhàn)，如部分CRC患者表現(xiàn)出5-Fu抵抗，有相關(guān)研究顯示，lncRNA h19可以作為ceRNA，作用于miR-194-5p，影響其與靶點SIRT1的結(jié)合，從而觸發(fā)自噬，形成化學(xué)抵抗，影響5-Fu化療效果［42］。MSI與MMR也是影響氟尿嘧啶類藥物療效的原因。而對于腫瘤治療的另一利器，抗體藥物來說，其作用靶點的狀態(tài)，更是CRC預(yù)后檢測的重要因素。在中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015版）中，就推薦確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的患者檢測KRAS、NRAS、BRAF基因狀態(tài)，這些基因突變的患者，都有可能對單抗藥物治療無效。隨著各種凝膠電泳、水凝膠以及納米材料傳感器等檢測技術(shù)的蓬勃發(fā)展，也有各種不同的新型技術(shù)應(yīng)用于新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)活動中。

3 展望

目前對于CRC新的生物標(biāo)志物的研究還在不斷進行，無論是蛋白質(zhì)組學(xué)還是基因組學(xué)都將涌現(xiàn)越來越多的生物標(biāo)志物。將它們組合應(yīng)用于CRC的檢驗工作和預(yù)后評估，并針對不同生物標(biāo)志物的水平進行靶向治療，未來有可能實現(xiàn)精準(zhǔn)化、個體化的CRC治療以及CRC死亡率的改善。