筋骨草超微粉對LPS致急性肺損傷肉雞的保護(hù)作用

林水城, 胡可慧, 劉云輝, 黃小紅

(福建農(nóng)林大學(xué)中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002 )

筋骨草(AjugadecumbensThunb),別名白毛夏枯草、金瘡小草、破血丹等，為管狀花目唇形科筋骨草屬多年生草本,其根部膨大,直立,無匍匐莖.筋骨草為藥用植物,性味苦寒,有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等功效.研究表明,筋骨草具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功能[1-2],同時還具有抗炎的藥用價值[3].

急性肺損傷是由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、膿毒癥等多種因素引起的彌漫性的肺實質(zhì)損傷,臨床上表現(xiàn)為頑固性低血氧癥和呼吸窘迫,其發(fā)展至嚴(yán)重階段時被稱為急性呼吸道窘迫綜合征,臨床上發(fā)病率高,死亡率高達(dá)30%～50%.細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為急性肺損傷的主要致病因素之一,可以誘導(dǎo)相應(yīng)的宿主效應(yīng)細(xì)胞(單細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)產(chǎn)生大量炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等),而這些炎性因子的誘生、相互作用、炎癥效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)[4].由于急性肺損傷復(fù)雜的發(fā)病機制,至今還沒有有效的治療藥物.現(xiàn)階段,關(guān)于筋骨草超微粉在急性肺損傷肉雞的應(yīng)用上尚未見報道.為此，本試驗采用氣管注射LPS的方法建立雞急性肺損傷模型,觀察筋骨草超微粉對雞急性肺損傷的防治效應(yīng),并初步探討其抗炎作用機制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 筋骨草超微粉購自福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司,其有效活性成分乙酰哈巴苷的含量為0.62%.

1.1.2 試驗動物 200只1日齡艾維茵白羽肉雞購自福建圣農(nóng)集團(tuán)有限公司.

1.1.3 試劑 NO測試盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)測試盒、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)測試盒均購自南京建成生物工程研究所;LPS購自Sigma公司;GoScriptTMReverse Transcription reaction試劑盒、GoTaq?qPCR Master Mix熒光試劑盒購自PROMEGA公司;TRIzol購自LIFE公司;氯仿、異丙醇、75%乙醇均為分析純.

1.1.4 儀器與設(shè)備 主要儀器與設(shè)備有VIS-7200 型可見分光光度計(上海美普達(dá)儀器有限公司)、iMARK型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)、CFX-96型熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司).

1.2 試驗設(shè)計

將200只1日齡白羽肉雞隨機分為5組(空白對照組、模型組、試驗Ⅰ～Ⅲ組),每組5個重復(fù),每個重復(fù)8只雞.空白對照組、模型組飼喂基礎(chǔ)日糧;試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組在飼喂的基礎(chǔ)日糧中分別添加500、1 000、2 000 mg·kg-1筋骨草超微粉.基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1,日糧均制成粉狀.試驗雞籠養(yǎng),讓其自由采食與飲水,按肉雞一般免疫程序免疫.試驗在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)試驗場進(jìn)行,分兩個階段,試驗前期1～21 d,試驗后期22～42 d,為期42 d.

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)

1)第1～21天的預(yù)混料為每千克日糧提供9 800 IU VA、2 780 IU VD、19.6 IU VE、2.24 mg VK3、1.4 mg VB1、7 mg VB2、33.6 mg VB3、9.8 mg VB5、3.36 mg VB6、0.056 mg生物素、1.12 mg葉酸、0.016 8 mg VB12、1 300 mg膽堿、8 mg銅、100 mg鐵、120 mg錳、100 mg鋅、0.3 mg硒、0.7 mg碘；第22～42天的預(yù)混料為每千克日糧提供7 000 IU VA、2 700 IU VD、14 IU VE、1.6 mg VK、1 mg VB1、5 mg VB2、24 mg VB3、7 mg VB5、2.4 mg VB6、0.04 mg生物素、0.8 mg葉酸、0.016 8 mg VB12、1 000 mg膽堿、8 mg銅、100.2 mg鐵、120 mg錳、100.1 mg鋅、0.3 mg硒、0.7 mg碘.

1.3 急性肺損傷模型的建立

試驗第42天時,將雞用乙醚麻醉后,分別對模型組、試驗Ⅰ～Ⅲ組雞用1 mL注射器穿透咽喉部軟骨向氣管注入用磷酸鹽緩沖液溶解的LPS,每只雞的給藥量為0.2 mg·kg-1,空白對照組注入同等體積的磷酸鹽緩沖液.

1.4 樣品的采集與處理

在注射LPS的第0、12、24小時,分別從試驗組、模型組、空白對照組每個重復(fù)組中隨機抽取1只雞進(jìn)行采血,采血前空腹12 h,翅下靜脈采血,每次每只抽取10 mL全血置于離心管中,在4 ℃、3 500 r·min-1下離心10 min,分離血清,分裝于Eppendorf管中,置冰箱(-20 ℃)中保存,用于NO、NOS指標(biāo)的測定.采血完畢后頸部放血處死,采集肺組織,并取一小塊用4%多聚甲醛固定做切片標(biāo)本,其余保存在冰箱(-80 ℃)中,用于其他指標(biāo)的檢測.

1.5 指標(biāo)的測定

1.5.1 血清NO、NOS指標(biāo)的測定 NO濃度、NOS活性采用比色法測定,按試劑盒說明書的步驟進(jìn)行.

1.5.2 肺組織病理學(xué)檢測 肺組織采用常規(guī)石蠟包埋處理，切片厚5 μm，HE染色，于光鏡下觀察肺損傷的程度.

1.5.3 細(xì)胞因子的測定 采用ELISA法檢測肺組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,按試劑盒說明書的步驟進(jìn)行.

1.5.4 MPO活性的測定 采用比色法測定MPO活性,按試劑盒說明書的步驟進(jìn)行.

1.5.5 肺組織中核蛋白質(zhì)NF-κBp65含量的測定 采用ELISA法檢測NF-κBp65的含量，按試劑盒說明書的步驟進(jìn)行.

1.5.6 肺組織chTLR4、NF-κBmRNA表達(dá)水平的檢測 (1)總RNA的提取:取右下肺組織50 mg,采用Trizol試劑提取肺組織總RNA.(2)cDNA的合成:RNA樣本的濃度、純度經(jīng)檢測(D260nm/D280nm=1.8～2.0)后,用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，采用GoScriptTMReverse Transcription reaction試劑盒將提取的RNA按試劑盒說明書的方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA.(3)qRT-PCR檢測:反應(yīng)體系12.5 μL,含1 μL cDNA、上下游引物各0.25 μL、6.25 μL GoTaq?qPCR Master Mix、0.25 μL CRX Reference Dye、4.5 μL無核酸酶水.反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán).引物序列及擴增長度見表2.

表2 基因擴增引物序列及產(chǎn)物長度Table 2 Gene amplification primer sequences and product lengths

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 2.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理組肉雞肺組織的病理形態(tài)

光鏡觀察結(jié)果顯示:與空白對照組相比,模型組肉雞肺泡壁增厚,肺間質(zhì)變寬并有大量炎性細(xì)胞浸潤,肺泡腔內(nèi)有炎性滲出物,肺呼吸毛細(xì)管腔受到擠壓變小,甚至消失(圖1B箭頭所示);試驗Ⅰ～Ⅲ組肺組織病理形態(tài)變化較模型組輕,肺泡壁厚度、肺間質(zhì)寬度改變較小,肺組織結(jié)構(gòu)破壞程度較輕(圖1C、1D、1E箭頭所示).

A:空白對照組;B:模型組;C:試驗Ⅰ組;D:試驗Ⅱ組;E:試驗Ⅲ組(箭頭示病變位置).圖1 肺組織的主要病理變化Fig.1 Main histopathologic changes in the lung tissues with acute injury

2.2 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞血清NO濃度、NOS活性的影響

由表3可知:注射LPS 0 h,各試驗組肉雞血清的NO濃度、NOS活性差異不顯著(P>0.05);注射LPS 12 h,與空白對照組比較,模型組、試驗Ⅰ～Ⅲ組的NO濃度、NOS活性均顯著提高(P<0.05),但試驗Ⅰ～Ⅲ組的NO濃度、NOS活性顯著低于模型組(P<0.05);注射LPS 24 h,NO濃度、NOS活性呈現(xiàn)與12 h相同的變化趨勢.

表3 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞血清NO濃度、NOS活性的影響1)Table 3 Effects of A.decumbens ultramicro powder on the serum NO level and NOS activity of broilers with acute lung injury

1)同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05),附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.3 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞炎性細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知:注射LPS 0 h,試驗Ⅱ組肉雞炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量與空白對照組、模型組的差異顯著(P<0.05);注射LPS 12 h，模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α含量較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05);注射LPS 24 h,模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α含量較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05).

表4 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞炎性細(xì)胞因子含量、MPO活性、NF-κBp65含量的影響1)Table 4 Effects of A.decumbens ultramicro powder on the inflammatory cytokines levels，MPO activity and NF-κBp65 contents in broiler lung with acute injury

1)同列數(shù)據(jù)后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05),附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.4 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞肺組織MPO活性的影響

由表4可知:注射LPS 12 h,模型組肉雞肺組織的MPO活性較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05);注射LPS 24 h,模型組的MPO活性較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05).

2.5 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞肺組織核蛋白質(zhì)中NF-κBp65含量的影響

由表4可知:注射LPS 12 h,模型組肉雞肺組織核蛋白質(zhì)中的NF-κBp65含量較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05);注射LPS 24 h,模型組的NF-κBp65含量較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05).

2.6 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞肺組織chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平的影響

由圖2可知:注射LPS 0 h,各試驗組肉雞肺組織chTLR4 mRNA的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05);注射LPS 12、24 h,模型組、試驗Ⅰ～Ⅲ組的chTLR4 mRNA表達(dá)量較空白對照組顯著提高(P<0.05),試驗Ⅰ～Ⅲ組較模型組顯著降低(P<0.05).注射LPS 0 h,各試驗組肉雞肺組織NF-κB mRNA的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05);注射LPS 12、24 h,模型組、試驗Ⅰ～Ⅲ組的NF-κB mRNA表達(dá)量較空白對照組顯著提高(P<0.05),其中,注射LPS 24 h,試驗Ⅰ、Ⅱ組較模型組顯著降低(P<0.05).

圖柱上附不同字母者表示差異顯著(P<0.05),附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).圖2 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞肺組織chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of A.decumbens ultramicro powder on mRNA expressions of chTLR4 and NF-κB in the broiler lung with acute injury

3 討論

3.1 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞血清NO濃度、NOS活性的影響

NO是細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)重要的信息物質(zhì)和效應(yīng)分子,在機體的生理和病理過程中起著重要的作用.體內(nèi)NO合成過多，會與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，生成具有細(xì)胞毒性的羥自由基和過氧硝基陰離子，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[5].NOS是NO反應(yīng)通路的限速酶，通過催化L-精氨酸生成NO.當(dāng)受到外界刺激處于應(yīng)激狀態(tài)時，巨噬細(xì)胞內(nèi)的iNOS表達(dá)增多，產(chǎn)生大量的NO和過氧化物，兩者可生成具有強氧化性的過氧化亞硝基，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[6].研究表明，小鼠尾靜脈注射LPS后，其血清和肺灌洗液中的NO2-/NO3-水平顯著升高，表明在LPS致小鼠急性肺損傷的過程中有過氧化損傷的參與[7].本試驗結(jié)果顯示，注射LPS 0 h，各處理組血清的NO濃度、NOS活性差異不顯著(P>0.05)，注射LPS 12、24 h，NO濃度、NOS活性升高，試驗Ⅰ～Ⅲ組的NO濃度、NOS活性明顯低于模型組.表明筋骨草超微粉能夠緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷.

3.2 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞免疫功能的影響

LPS是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，進(jìn)入動物機體內(nèi)能夠與相應(yīng)的宿主效應(yīng)細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)相互作用，刺激淋巴細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α)，引起炎癥反應(yīng)，并激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機體厭食、嗜睡和發(fā)熱等免疫應(yīng)激臨床癥狀[8-9].現(xiàn)代研究中，這些炎癥因子和臨床癥狀多作為實際生產(chǎn)中免疫應(yīng)激發(fā)生的參考指標(biāo).因此，LPS模型能夠作為研究肉雞急性肺損傷的模型.

IL-1β、IL-6是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子.在生理狀態(tài)下，IL-1β促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；IL-6具有介導(dǎo)中樞免疫、修復(fù)神經(jīng)和抗炎癥反應(yīng)的作用.在炎癥狀態(tài)下，IL-1β、IL-6含量異常增高，激活補體及T細(xì)胞增殖，產(chǎn)生細(xì)胞毒害，同時誘發(fā)其他促炎因子的產(chǎn)生，加劇炎癥反應(yīng)[10].TNF-α是具有抗病毒感染、激活巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答等多功能的細(xì)胞因子.在生理狀態(tài)下，TNF-α具有抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)的作用.在炎癥狀態(tài)下，TNF-α含量短期內(nèi)迅速升高，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞向發(fā)生炎癥的部位聚集，引起炎癥的擴大[11-12].本試驗中，注射LPS 12、24 h，模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α含量較空白對照組顯著升高(P<0.05)，表明試驗動物已進(jìn)入肺損傷狀態(tài)，這與羅剛等[13]、石君霞等[14]的研究結(jié)果基本一致.本試驗結(jié)果顯示，注射LPS 0 h，試驗Ⅰ～Ⅲ組的IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高，表明筋骨草超微粉能增強肉雞的免疫調(diào)節(jié)功能；注射LPS 12、24 h，試驗Ⅰ～Ⅲ組均能有效延緩LPS導(dǎo)致的炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的升高(P<0.05)，表明筋骨草超微粉可以通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)的途徑對急性肺損傷肉雞的肺組織起到保護(hù)作用，以試驗Ⅱ組的保護(hù)效果最佳.

MPO是反映中性粒細(xì)胞浸潤和聚集程度的一個指標(biāo)，其活性變化是組織炎癥發(fā)展的重要過程[15].本試驗中，注射LPS 12、24 h，模型組的MPO活性較空白對照組顯著提高(P<0.05)，這與章卓等[16]、李鶯等[17]、邢海波等[18]的研究結(jié)果一致.本試驗結(jié)果顯示：注射LPS 0 h，各處理組的MPO活性差異不顯著(P>0.05)；注射LPS 12、24 h，試驗Ⅰ～Ⅲ組均能顯著降低MPO活性(P<0.05).表明筋骨草超微粉能夠延緩肉雞肺損傷過程中MPO活性的升高，減輕炎癥反應(yīng).

NF-κB是調(diào)控炎癥介質(zhì)表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其最大的亞基p65經(jīng)活化后參與炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，間接代表NF-κB的活化水平[19].本試驗中，注射LPS 12、24 h，模型組的NF-κBp65含量較空白對照組顯著升高(P<0.05)，這與徐世軍等[20]的研究結(jié)果基本一致.本試驗結(jié)果顯示：注射LPS 0 h，各試驗組之間的NF-κBp65含量差異不顯著(P>0.05)；注射LPS 12、24 h，試驗Ⅰ～Ⅲ組均能顯著降低NF-κBp65含量(P<0.05)，提示筋骨草超微粉可以通過影響核轉(zhuǎn)錄因子κB的活性來延緩炎癥的發(fā)生.

3.3 筋骨草超微粉對急性肺損傷肉雞肺組織chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平的影響

Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)是一類天然免疫受體，主要表達(dá)于多形核細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等表面，其中的TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素/LPS應(yīng)答最主要的受體[21].LPS與細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，TLR4聚合將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過一系列的反應(yīng)，最終激活NF-κB并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)各種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[22].本試驗中，注射LPS 12、24 h，模型組的chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達(dá)量較空白對照組顯著升高(P<0.05)，這與黃繼義等[23]的研究結(jié)果基本一致.本試驗結(jié)果顯示:注射LPS 0 h，各試驗組之間的chTLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；注射LPS 12、24 h，試驗Ⅰ～Ⅲ組均能顯著降低chTLR4 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)；注射LPS 24 h，試驗Ⅰ、Ⅱ組均顯著降低NF-κB mRNA的表達(dá)量(P<0.05).以上結(jié)果提示，筋骨草超微粉能夠通過抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路減輕炎癥反應(yīng).

4 結(jié)論

在肉雞基礎(chǔ)日糧中添加筋骨草超微粉有利于緩解由LPS刺激引起的急性肺損傷.本試驗條件下，筋骨草超微粉在肉雞飼糧中的適宜添加量為1 000 mg·kg-1.