響應(yīng)面杉木葉片多酚提取工藝及其優(yōu)化

張 健, 呂蒙蒙, 謝亞聰, 武憶寒, 林思祖, 陳 宇

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.國(guó)家林業(yè)和草原局杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

植物多酚又稱植物單寧，是植物次級(jí)代謝產(chǎn)生的一種天然有機(jī)化合物，廣泛存在于植物體的各組織中[1].多酚類成分具有抗氧化活性[2]、抗菌[3]、抗病毒、抗微生物、調(diào)血脂和降血糖[4-9]的作用；具有抗脂質(zhì)化作用[10]、增強(qiáng)抗氧化性能力等生物學(xué)作用[11].因此，植物多酚被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)療保健[12]、化妝品[13]、食品保鮮[14-15]、建筑功能材料[16]等諸多領(lǐng)域.近些年隨著多酚提取方法的不斷發(fā)展，先后有諸多學(xué)者對(duì)甘薯[17]、蘋果[18]、青莢[19]、梨[20]、雞桑[21]等植物的葉進(jìn)行了多酚提取工藝優(yōu)化研究，為不同植物資源的綜合利用提供了研究思路.

杉木[Cunninghamialanceolata(Hook.) Lamb.]為中國(guó)長(zhǎng)江、秦嶺以南地區(qū)用材栽培最廣樹種[22].杉木資源利用目前主要集中在木材方面，而其非木質(zhì)利用方面研究相對(duì)匱乏，鮮有學(xué)者對(duì)其種鱗進(jìn)行了多酚的提取方法及工藝優(yōu)化研究[23].隨著生態(tài)建設(shè)中杉木人工林培育面積和區(qū)域不斷擴(kuò)大，在其撫育、間伐[24-25]過(guò)程中產(chǎn)生大量剩余樹葉，剩余物巨大，如何利用這些剩余物資源，豐富杉木人工林產(chǎn)品種類，提高杉木綜合利用效率，對(duì)于促進(jìn)杉木人工林總體產(chǎn)值提升具有重要意義.而開展杉木葉片多酚最佳提取工藝的研究是開發(fā)杉木資源潛在價(jià)值的有效手段之一.因此，本研究以杉木葉片為原料，采用超聲波微波萃取協(xié)同輔助提取多酚，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其工藝參數(shù)，以期為杉木葉片中的多酚產(chǎn)業(yè)開發(fā)及杉木綜合資源的利用提供一定的研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料為2018年2月至7月在福建省三明市尤溪國(guó)有林場(chǎng)撫育、間伐、采伐及實(shí)驗(yàn)采樣后的杉木廢棄葉片，保鮮處理后帶回實(shí)驗(yàn)室，冷凍干燥36 h，用粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)篩(100目)后收集至密封袋，置于4 ℃冰箱備用.

藥品(分析純)：沒(méi)食子酸(20180809,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無(wú)水乙醇(20180806,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水碳酸鈉(20151216,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；福林酚試劑(20180812,北京索萊寶科技有限公司).

儀器：FT102微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，CP224C奧豪斯電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；Xinyi-1000Q超聲波微波協(xié)同萃取儀(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；Infinite?200 Pro NanoQuant酶標(biāo)儀(Tecan Austria GmbH)； HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；PD-1E冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精確稱量沒(méi)食子酸標(biāo)品0.025 g后，超純水溶解，定容至100 mL，制備得0.25 mg·mL-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液.采用福林酚試劑法[23]，按梯度精確遞增吸取一定量的0.25 mg·mL-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，制備0.25、0.20、0.15、0.10、0.05和0 mg·mL-1的標(biāo)液.依次按梯度取0.2 mL不同濃度標(biāo)液于6個(gè)10 mL棕色離心管內(nèi)，再加入0.4 mL福林酚試劑，震蕩搖勻，5 min后依次加入2 mL 10% Na2CO3溶液，取超純水2.4 mL定容至5 mL，震蕩搖勻，50 ℃水浴1 h，然后在765 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)得吸光度值[23].根據(jù)吸光度值與濃度的關(guān)系,線性回歸后得方程為y=2.830 9x+0.058 6,R2=0.999 3.

1.2.2 杉木葉片多酚提取量的測(cè)定 稱取一定的杉木混合葉片后加入既定濃度的乙醇溶液，在不同條件下進(jìn)行超聲萃取后，經(jīng)真空過(guò)濾后得到葉片提取液.將其稀釋一定倍數(shù)后取0.2 mL于10 mL棕色離心管內(nèi)，依照1.2.1福林酚試劑法測(cè)定多酚步驟于可見光分區(qū)765 nm處測(cè)其吸光值.以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣品中的多酚含量，計(jì)算公式如下：

式中：V為提取液體積(mL)；M為原樣質(zhì)量(g)；A為原液液稀釋后測(cè)得的吸光值；N為提取液稀釋倍數(shù)；P為多酚提取量(mg·g-1).

1.2.3 單因素試驗(yàn) 稱取0.5 g杉木葉片粉末，微波功率固定150 W，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以多酚提取量為考察指標(biāo)，考察各個(gè)因素.各單因素條件分別為提取時(shí)間10、15、20、25、35 min，乙醇濃度20%、40%、60%、80%、100%，液料比(一定濃度的乙醇體積與杉木混合葉片質(zhì)量比值)60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1，提取溫度30、40、50、60 、70 ℃和超聲波功率100、200、300、400、500 W.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在1.2.3試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定提取時(shí)間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取溫度(D)為因子、多酚提取量(P)為響應(yīng)值，建立4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，29個(gè)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次經(jīng)分析回歸擬合后得到回歸方程，理論預(yù)測(cè)試驗(yàn)方案及多酚提取量理論值.杉木葉片的響應(yīng)面因素及水平設(shè)計(jì)見表1.

表1 杉木葉片響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface test for Chinese fir leaves

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016分析處理后，在其試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，用 Design-expert 10設(shè)計(jì)及處理分析，制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，在設(shè)定的單因素的取值范圍內(nèi)，杉木葉片多酚提取量均為先升后降趨勢(shì).提取時(shí)間30 min時(shí)，多酚提取量最高(43.33 mg·g-1)，比最低水平提升了10.68%(圖1a)；提取溫度40 ℃時(shí)，多酚提取量最高(43.80 mg·g-1)，比最低水平提升了20.93%(圖1b)；乙醇濃度60%時(shí)，多酚提取量最高(45.65mg·g-1)，比最低水平提升了26.89%(圖1c)；當(dāng)液料比為90∶1時(shí)，多酚提取量最高(49.30 mg·g-1)，比最低水平提升了23.25%(圖1d)；超聲波功率對(duì)杉木葉片多酚提取量無(wú)明顯影響(圖1e),在保證多酚提取量的前提下，為節(jié)約能耗，降低儀器損耗，將超聲功率固定為100 W.

圖1 各因素對(duì)多酚提取量的影響Fig.1 Effects of factors on polyphenols yields

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 回歸數(shù)學(xué)模型的建立與分析 采用Design-expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面(Box-Behnken) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示.該試驗(yàn)共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)5個(gè)零點(diǎn)以及24個(gè)分析因點(diǎn)，其中的自變量為分析因點(diǎn)，取值(以單因素結(jié)果為基礎(chǔ))于提取時(shí)間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)及溫度(D)中所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)提取時(shí)間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取溫度(D)的中心點(diǎn)，為保證試驗(yàn)重復(fù)性，點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行3次，以降低不可控因素對(duì)試驗(yàn)的干擾.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果1)Table 2 Results of response surface test

1)表中最終值為3次重復(fù)試驗(yàn)的均值.

表2數(shù)據(jù)用軟件進(jìn)行回歸方程擬合，得到多酚提取量理論預(yù)測(cè)值(Y)與提取時(shí)間(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、溫度(D)的回歸模型方程:

Y=74.24-3.17A-1.51B+3.31C-0.46D+0.04AB-0.02AC+1.25AD+4.61BC+6.60BD+7.5CD+8.26A2-

4.77B2-0.025C2-5.22D2

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，比較各因素作用大小，分析如表3.數(shù)字模型方程(P<0.01)極顯著，其決定系數(shù)(R2)為0.819,Radj2=0.637為調(diào)整后系數(shù),可見該模型擬合性較好，失擬性P=0.064 2，差異不顯著(P>0.05)，變異系數(shù)CV=3.920%,可知該回歸方程擬合度較高，試驗(yàn)誤差小，置信度較高，試驗(yàn)可重復(fù)性較高.其中A、C、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、D2差異不顯著，D、C2差異顯著，B、AB差異極顯著，從表3的顯著性和F值可知，影響杉木葉片多酚提取量的因素依次為液料比(B)>提取溫度(D)>乙醇濃度(C)>提取時(shí)間(A).

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)表1)Table 3 Significance testing for the regression equations

1)*表明P>0.05差異不顯著,**表明P<0.05差異顯著,***表明P<0.01差異極顯著.

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 圖2為多酚提取量(響應(yīng)值)與各個(gè)因子之間的響應(yīng)曲面.圖2a、2c為提取時(shí)間與液料比、溫度的之間的交互作用對(duì)杉木葉片多酚提取量的影響結(jié)果，當(dāng)提取時(shí)間在25～35 min之間時(shí)，多酚提取量均有下降趨勢(shì).提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用對(duì)杉木葉片多酚提取量的影響結(jié)果如圖2b所示,多酚提取量先緩慢上升后趨于平緩.圖2c、2e、2f為提取溫度與其他因素的交互作用對(duì)杉木葉片多酚提取量的影響結(jié)果，當(dāng)提取溫度在30～50 ℃之間時(shí)，多酚提取量均呈上升趨勢(shì).乙醇濃度與剩余因素之間的交互作用結(jié)果如圖2b、2d、2f所示，當(dāng)乙醇濃度在50%～70%之間時(shí)，多酚提取量先是緩慢上升然后呈下降趨勢(shì)，響應(yīng)面坡度變化較大.圖2a、2d、2e為液料比與其他3個(gè)因素的交互作用結(jié)果,當(dāng)液料比在70∶1～110∶1之間，多酚提取量均呈上升趨勢(shì)，其響應(yīng)面坡度變化的幅度極大.

2.3 最佳理論工藝及驗(yàn)證性試驗(yàn)

運(yùn)用軟件得出的模型方程進(jìn)行最佳理論試驗(yàn)?zāi)M后，得杉木葉片的最佳提取工藝：提取時(shí)間35 min，液料比110∶1，乙醇濃度61.50%，提取溫度50 ℃，理論預(yù)測(cè)多酚提取量為68.97 mg·g-1.重復(fù)6次最佳工藝，實(shí)際測(cè)得多酚平均量為62.72 mg·g-1，低于理論值10%，實(shí)測(cè)值與理論值相差較小，說(shuō)明此模型較為準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際操作可行性(表4).在保證提取量的基礎(chǔ)上，應(yīng)簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，迎合試驗(yàn)操作.因此提取工藝改良為：提取時(shí)間35 min，液料比110∶1，乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃.在該條件下重復(fù)6次，測(cè)得多酚平均得率為 62.92 mg·g-1，高于最佳工藝值0.32%，適用于實(shí)際試驗(yàn)操作.

3 討論

本研究運(yùn)用Box-Behnken的試驗(yàn)原理，探討以杉木葉片為試驗(yàn)材料，采用超聲波提取法提取多酚的最佳工藝及其優(yōu)化，得到其最佳工藝條件：提取時(shí)間35 min，液料比110∶1，乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃.在單因素處理的結(jié)果中，超聲功率的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)杉木葉片多酚提取影響不大，且多酚得率在超聲功率增大后有略微下降，推測(cè)其因“空化效應(yīng)”增強(qiáng)，導(dǎo)致已提取出的多酚結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而多酚得率下降[26-27].提取溫度對(duì)杉木葉片多酚提取率影響的機(jī)理是：提取溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，多酚析出增加，加速了乙醇揮發(fā)，同時(shí)多酚結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多酚得率降低[28-29].其次，加大液料比，延長(zhǎng)提取時(shí)間，均屬于變相增大接觸面積和延長(zhǎng)時(shí)間促進(jìn)溶質(zhì)析出；乙醇濃度在一定范圍內(nèi)變化，有利于多酚與蛋白質(zhì)等結(jié)合的氫鍵破壞，但超限后會(huì)導(dǎo)致提取液中醇性雜質(zhì)增多，進(jìn)而使多酚提取率有所降低[30-31].

圖2 不同組合變量與多酚提取量的關(guān)系響應(yīng)曲面Fig.2 Response surface map of pairwise combinations of variables and polyphenol yields

類型重復(fù)次數(shù)多酚提取量mg·g-1均值mg·g-1方差相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%類型重復(fù)次數(shù)多酚提取量mg·g-1均值mg·g-1方差相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%最佳工藝162.1662.722.070.02試驗(yàn)工藝162.6362.923.320.03262.16263.22361.82365.88461.43461.72565.33560.67663.40663.40

目前已在較多物種中開展關(guān)于利用植物采伐剩余物提取多酚的研究.相較于玉米苞葉(3.72 mg·g-1)[32]、枇杷葉(48.24 mg·g-1)[33]、甘薯葉(15.80 mg·g-1)[34]、黃芩葉(4.99 mg·g-1)[35]等，杉木葉片的多酚得率較高(62.92 mg·g-1).李佳等[23]利用杉木種子園中收種后的剩余球果進(jìn)行多酚提取，其多酚得率為34.30 mg·g-1，低于本研究中葉片的多酚得率 62.92 mg·g-1，推測(cè)與鱗片的含水率較高和提取方法不同有關(guān).從本研究的結(jié)果看，杉木葉片中含有較為豐富的植物多酚資源，具有良好的應(yīng)用前景.