茉莉花原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系的建立及應(yīng)用

張 婭, 劉曉烽, 張 婧, 何 弦, 袁 媛, 呂美玲, 黃晨星, 鄭祥梓, 繆 穎, 伍炳華

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省植物功能生物學(xué)與綠色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

茉莉花[Jasminumsambac(L.) Ait]是木犀科素馨屬香花植物，可用于茉莉花茶的窨制和香料提取[1,2].雙瓣茉莉是我國茉莉花栽培的主要品種，其花冠筒分為兩輪，花瓣潔白，產(chǎn)量高，花香濃，是窨制茉莉花茶的主要原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值；植株抗逆性較強(qiáng)，易于栽培，也是用于研究的理想材料[3].獲得可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株雖然是研究植物基因功能的重要手段，但由于耗時長、成本高、轉(zhuǎn)化體系不成熟等因素仍限制著當(dāng)今許多植物品種的分子生物學(xué)研究.瞬時表達(dá)技術(shù)結(jié)合報告基因的使用為研究目標(biāo)基因功能提供了快速、高效的途徑[4,5]，擬南芥、煙草、番茄、玉米原生質(zhì)體細(xì)胞，煙草葉肉細(xì)胞，煙草BY-2細(xì)胞以及洋蔥表皮細(xì)胞等介導(dǎo)的基因瞬時表達(dá)體系已被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位、啟動子及蛋白活性檢測、蛋白互作等基因功能研究分析[6-9].現(xiàn)階段植物細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)化研究主要集中在模式植物，在花卉植物上的研究相對較少.然而，異源受體細(xì)胞對同一蛋白的表達(dá)效果可能存在差異[10]，為了使目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物正確折疊，修飾并精準(zhǔn)定位于相應(yīng)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，選擇同源植物細(xì)胞瞬時表達(dá)分析可增加研究的準(zhǔn)確性.

前人在茉莉花品種形態(tài)特征、香氣特性和精油提取方面做了大量研究[2,3,11]，但關(guān)于功能基因在細(xì)胞水平方面的研究甚少，而關(guān)于茉莉花原生質(zhì)體瞬時表達(dá)的方法還未見報道，因此建立茉莉花原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化體系為深入開展茉莉花細(xì)胞水平及分子水平的功能基因組研究具有重要意義.本研究通過酶解法分離到大量有活力的雙瓣茉莉花花瓣原生質(zhì)體，運(yùn)用PEG介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化體系，成功鑒定了3個茉莉花來源的目標(biāo)蛋白在原細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，為高通量開展茉莉花候選基因的功能分析奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 茉莉花供試材料為自然條件下盆栽種植的雙瓣茉莉，取自福建農(nóng)林大學(xué)茉莉花種質(zhì)資源圃.擬南芥供試材料為哥倫比亞生態(tài)型[Arabidopsisthaliana(L.) Heynold ecotype Columbia 0]，由本實(shí)驗(yàn)室人工氣候室培育，生長條件為22 ℃,光照13 h(22 ℃),黑暗11 h,光照強(qiáng)度約80 μmol·m-2·s-1,濕度60%. 擬南芥種子在4 ℃冷室春化48 h后，移至溫室萌發(fā)，萌發(fā)后的種子移至蛭石上，定期澆灌1/4 Hoagland營養(yǎng)液.

1.1.2 質(zhì)粒載體 試驗(yàn)所用載體p35S-GFP來源于細(xì)胞表達(dá)載體p2FGW7(6666 bp)[12],表達(dá)框由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、綠色熒光蛋白(GFP)基因和胭脂堿合成酶終止子(NOS)構(gòu)成.質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α菌株中擴(kuò)增后，大量提取純化質(zhì)粒DNA，電泳鑒定并測定質(zhì)粒DNA濃度和純度，D260 nm/D280 nm=1.8～1.9,DNA濃度為1 μg·μL-1,-20 ℃保存?zhèn)溆?

JsLHY-GFP、JsSWEET1-GFP和JsSWEET17-GFP載體：JsLHY、JsSWEET1和JsSWEET17是福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院伍炳華課題組從茉莉花花朵cDNA中利用RACE引物分離克隆到的3個基因，其中JsLHY屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的生物鐘LHY/CCA1[13]的同源編碼基因；JsSWEET1和JsSWEET17屬于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET家族的兩個編碼基因[14].3個基因均已亞克隆至細(xì)胞表達(dá)載體p2GWF7(6670 bp)[12]的GFP編碼序列的閱讀框5′端，構(gòu)建了JsLHY-GFP、JsSWEET1-GFP和JsSWEET17-GFP載體.

1.1.3 試劑 主要試劑有纖維素酶(Cellulase ‘Onozuka’ R10, Yakult Pharmaceutical Industry)、離析酶(Macerozyme ‘Onozuka’ R10, Yakult Pharmaceutical Industry)、果膠酶(Pectinase, Sigma)、牛血清白蛋白(BSA, Sigma)、MES(Sigma)、PEG4000(Sigma)、二乙酸熒光素(Fluorescein Diacetate, FDA, sigma)、碘化丙啶(Propidium Iodide, PI, Sigma).其余基本試劑均購自生工生物公司.

1.2 外植體材料的處理

參照Yoo et al[12]的方法，選取生長5～6周的擬南芥真葉中完全伸展的葉片，或自然盆栽下3年生茉莉花植株的嫩葉，用單面刀片將葉片切成寬約0.5～1.0 mm的細(xì)絲，與酶液充分混合后，進(jìn)行原生質(zhì)體分離.

本試驗(yàn)還選用盛開的茉莉花花瓣作為分離原生質(zhì)體的酶解材料，并借鑒Yoo et al[12]、Wu et al[15]和Zheng et al[16]的方法，采用不同的處理方式，本文命名為切絲法、膠撕法和磨砂法，比較對茉莉花花瓣原生質(zhì)體分離效率的影響.選取3～5朵新鮮開放的花朵0.1～0.4 g，采用不同的處理方式使花瓣細(xì)胞暴露：A切絲法，用刀片將花瓣切成寬度為0.5～1.0 mm細(xì)條；B膠撕法，用膠帶紙粘住花瓣正反面，輕輕撕去粘在下表皮上的膠帶，使花瓣細(xì)胞暴露；C磨砂法，用極細(xì)石英砂輕輕摩擦花瓣下表皮，造成表皮輕微磨損暴露出花瓣細(xì)胞.處理后的花瓣組織立即移至酶液中，進(jìn)行原生質(zhì)體分離，每個處理試驗(yàn)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，分別統(tǒng)計(jì)花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性.

1.3 原生質(zhì)體的分離方法

葉片或花瓣原生質(zhì)體的制備方法參照Yoo et al[12]的方法，并略做修改，將處理后的植物材料浸泡于含15 g·L-1纖維素酶和4 g·L-1離析酶的酶解液中，酶溶劑為20 mmol·L-1KCl,0.4 mol·L-1甘露醇，20 mmol·L-1MES pH 5.7,10 mmol·L-1CaCl2和1 g·L-1BSA的混合液，抽真空處理30 min后，在25 ℃黑暗條件下靜置酶解4 h，之后置于水平振蕩器上以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速震蕩10 min,使原生質(zhì)體充分釋放到酶解液中.向酶解混合液中加入等體積的W5溶液(154 mmol·L-1NaCl,125 mmol·L-1CaCl2,5 mmol·L-1KCl,2 mmol·L-1MES pH 5.7)，經(jīng)200目紗布過濾后，于200g，4 ℃離心3 min，棄上清收集原生質(zhì)體，之后再加入2 mL的W5，靜置冰上40 min，移除上清后，加入2 mL W5溶液重懸，測定原生質(zhì)體總量.

為優(yōu)化茉莉花瓣原生質(zhì)體的分離效率，將切絲法處理后的花瓣組織置于含一定濃度梯度纖維素酶或果膠酶的酶解液中，黑暗條件下酶解3～6 h,在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和死亡率，確定適宜的酶液組合和酶解時間，試驗(yàn)重復(fù)3次.使用熒光染料PI檢測原生質(zhì)體的死亡率.向100 μL收集的原生質(zhì)體中加入 1 μL PI溶液(100 μg·mL-1)混勻，取10 μL至載玻片上，在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)一個視野中發(fā)出紅色熒光信號的原生質(zhì)體個數(shù)和白光視野下原生質(zhì)體的總個數(shù)，觀察視野5～10個，原生質(zhì)體死亡率/%=(發(fā)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100.

1.4 原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活性測定

產(chǎn)量測定：通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).收集的原生質(zhì)體重懸于W5溶液中，取少量滴于0.1 mm血球計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下觀察，選取膜結(jié)構(gòu)完整的原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，每個樣品計(jì)數(shù)3個重復(fù)，取平均值，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量.懸浮液中原生質(zhì)體濃度/(個·mL-1)=血球計(jì)數(shù)板平均每個大方格(0.1 mm3,即0.1 μL)的原生質(zhì)體個數(shù)×104.原生質(zhì)體產(chǎn)量，即每克鮮重材料所得的原生質(zhì)體個數(shù)/(個·g-1)=原生質(zhì)體的濃度(個·mL-1)×懸浮原生質(zhì)體的W5溶液體積(mL)/花瓣質(zhì)量(g).

活性測定：采用FDA活體染色法.每100 μL懸浮的原生質(zhì)體中加入1 μL FDA染色液(5 mg·mL-1溶解于丙酮)，取10 μL置于載玻片上，在熒光顯微鏡下檢查其活性，活力高的原生質(zhì)體在熒光下顯微鏡下可發(fā)出黃綠色熒光.

1.5 原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化

將沉淀后的原生質(zhì)體用MMG溶液(0.4 mol·L-1甘露醇,15 mmol·L-1MgCl2,4 mmol·L-1MES pH 5.7)重懸，使其濃度達(dá)到2×105個·mL-1，用于PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.每100 μL原生質(zhì)體樣品與10 μL外源質(zhì)粒DNA(1 μg·μL-1)以及110 μL PEG溶液[400 g·L-1PEG 4000,0.2 mol·L-1甘露醇，0.1 mol·L-1CaCl2]充分混勻后，室溫靜置5 min，加入440 μL W5溶液終止反應(yīng)，200g離心棄上清.用100 μL W1溶液(0.5 mol·L-1甘露醇,20 mmol·L-1KCl,4 mmol·L-1MES pH 5.7)重懸原生質(zhì)體，22 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12～16 h,可觀察原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率或目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位.

為改善茉莉花瓣原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率，將分離純化后的花瓣原生質(zhì)體重懸成不同濃度的細(xì)胞液，向轉(zhuǎn)化體系中加入不同量的p35S-GFP質(zhì)粒DNA，與等體積的不同質(zhì)量濃度的PEG溶液輕柔混勻，使轉(zhuǎn)化體系的PEG終濃度分別為50、100、150、200和250 g·L-1， 室溫靜置分別處理2、5、10、15和30 min，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體暗處孵育16 h，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率，試驗(yàn)重復(fù)3次.轉(zhuǎn)化效率檢測：向100 μL轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體加入1 μL PI溶液，取10 μL至載玻片上，在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)1個視野中發(fā)出紅色熒光信號的原生質(zhì)體個數(shù)，表達(dá)綠色熒光蛋白的原生質(zhì)體個數(shù)和白光視野下原生質(zhì)體的總個數(shù)，觀察視野5～10個，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率/%=[發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/(原生質(zhì)體總數(shù)-PI染色發(fā)紅色熒光的細(xì)胞數(shù))]×100.

1.6 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞定位

含目標(biāo)基因的瞬時表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，孵育16 h后，從管底吸取10 μL 原生質(zhì)體溶液置于載玻片上，用 Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況.用于觀察GFP信號的熒光激發(fā)光波長為488 nm,發(fā)射波長為505～535 nm;觀察葉綠體自發(fā)熒光的激發(fā)光波長為633 nm,發(fā)射波長為647～685 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉花原生質(zhì)體分離體系的優(yōu)化

為了分離到足夠量、有活力的茉莉花原生質(zhì)體，本試驗(yàn)采用酶解法，針對不同組織器官、不同處理方式、酶解液組合、酶解時間等因素進(jìn)行了摸索和優(yōu)化.

2.1.1 不同處理方式對茉莉花原生質(zhì)體分離的影響 借鑒擬南芥和番茄葉片原生質(zhì)體制備方法[12,15,16]，初步嘗試從茉莉花葉片分離原生質(zhì)體，然而得到的原生質(zhì)體多為細(xì)胞碎片，且形狀異常，F(xiàn)DA染色大部分無熒光，顯示存活率極低(圖1-A,B).然而，以茉莉花花瓣為試材時，在相同的酶解液中可收集到形態(tài)良好，F(xiàn)DA處理發(fā)熒光，有活力的原生質(zhì)體(圖1-C,D)，因此在接下來的研究中須專注于優(yōu)化茉莉花花瓣的原生質(zhì)體分離體系.

A.從葉片中分離出的原生質(zhì)體；B.FDA染色后的葉片原生質(zhì)體；C.從花瓣中分離出的原生質(zhì)體；D.FDA染色后的花瓣原生質(zhì)體.酶解液組合為1.5%纖維素酶+0.4%離析酶；酶解時間為4 h.標(biāo)尺=49 μm.圖1 雙瓣茉莉葉片和花瓣原生質(zhì)體的分離及檢測Fig.1 Isolation and viability test of the protoplasts from jasmine leaves and petals

嘗試了用切絲法、膠撕法和磨砂法在酶解前分別對花瓣組織進(jìn)行處理(圖2-A，B，C)，以使花瓣細(xì)胞能充分接觸酶解液.在4 mL相同酶解液中孵育6 h后，收集觀察原生質(zhì)體產(chǎn)量，在3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)中均顯示切絲法獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多，膠撕法次之，磨砂法得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量最低(圖3).考慮到操作的簡易性，切絲法處理茉莉花花瓣對原生質(zhì)體分離最有效.

A.切絲法；B.膠撕法；C.磨砂法.圖2 花瓣的不同處理方式Fig.2 Different methods on breaking petal epidermis

酶解液組合為15 g·L-1纖維素酶+4 g·L-1離析酶, 酶解時間為4 h.同一測定項(xiàng)目不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著.圖3 比較花瓣的不同處理方式對原生質(zhì)體分離效率的影響Fig.3 Comparison on protoplast yields via different petal epidermis isolation methods

2.1.2 酶液組合和酶解時間對茉莉花原生質(zhì)體分離的影響 在含4 g·L-1離析酶 和2 g·L-1果膠酶的酶解液中梯度增加纖維素酶的質(zhì)量濃度從5至30 g·L-1，檢測結(jié)果顯示(圖4-A)，在一定濃度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨纖維素酶質(zhì)量濃度提高而增加，當(dāng)濃度為15 g·L-1時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到峰值，為1.34×106個·g-1，死亡率為29.1%；隨著纖維素酶質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都開始下降，細(xì)胞破碎程度嚴(yán)重.因此，分離茉莉花花瓣原生質(zhì)體較適宜的纖維素酶質(zhì)量濃度為15 g·L-1.在含4 g·L-1離析酶和15 g·L-1纖維素酶的酶解液梯度增加果膠酶的質(zhì)量濃度從2至10 g·L-1， 花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)量檢測結(jié)果顯示(圖4-B)，隨果膠酶濃度升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量同步增加，當(dāng)果膠酶質(zhì)量濃度為8 g·L-1時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為1.48×106個·g-1，死亡率較低，為31.0%， 較適宜花瓣原生質(zhì)體的分離.試驗(yàn)表明，酶解液中最佳的纖維素酶和果膠酶質(zhì)量濃度分別為15和8 g·L-1.

為進(jìn)一步優(yōu)化茉莉花花瓣原生質(zhì)體的分離效率，選取4個酶解時間段3、4、5、6 h，采用上述優(yōu)化后的酶解液組合，檢測釋放出來的原生質(zhì)體總量及死亡率.如圖4-C所示，隨著酶解時間延長，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐步增多，在酶解5 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到2.96×106個·g-1，死亡率為23.5%，相對較低.因此最適合酶解時間為5 h.

A.纖維素酶濃度對原生質(zhì)體分離的影響，酶解液中含4 g·L-1離析酶和2 g·L-1果膠酶,酶解時間為4 h；B.果膠酶濃度對原生質(zhì)體分離的影響，酶解液中含4 g·L-1離析酶和15 g·L-1纖維素酶,酶解時間為4 h.C.酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響，酶液組合為15 g·L-1纖維素酶+8 g·L-1果膠酶+4 g·L-1離析酶.材料均為為切絲法處理的花瓣組織.圖4 酶液濃度和酶解時間對原生質(zhì)體分離效率的影響Fig.4 Influences of enzyme concentration and enzymolysis time on protoplast yield

2.2 茉莉花原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

本研究進(jìn)一步采用PEG介導(dǎo)法，探討了原生質(zhì)體終濃度、外源DNA含量、不同PEG處理等對茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響.

將收集的花瓣原生質(zhì)體稀釋成不同終濃度的細(xì)胞液，經(jīng)相同的轉(zhuǎn)化方法和孵育時間，熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如圖5-A所示，相同轉(zhuǎn)化體系中，外源DNA含量為100 μg·mL-1原生質(zhì)體時，最適合轉(zhuǎn)化的茉莉花花瓣原生質(zhì)體濃度為4×105個·mL-1，轉(zhuǎn)化效率約78%.

A.原生質(zhì)體濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響，每100 μL原生質(zhì)體與10 μg p35S-GFP質(zhì)粒DNA混合；B.質(zhì)粒DNA含量對轉(zhuǎn)化效率的影響，轉(zhuǎn)化體系的原生質(zhì)體濃度為4×105個·mL-1，質(zhì)粒為p35S-GFP.A,B試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化時PEG溶液終濃度均為200 g·L-1，處理時間均為5 min.C.PEG-4000終濃度對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響，PEG處理時間為5 min;D.PEG處理時間對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響,PEG溶液終濃度為200 g·L-1.C,D試驗(yàn)中，原生質(zhì)體濃度均為4×105個·mL-1，每100 μL原生質(zhì)體加入10 μg p35S-GFP質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化.同一測定項(xiàng)目不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著.圖5 原生質(zhì)體濃度、質(zhì)粒DNA含量及PEG處理對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Influences of protoplast concentration, plasmid DNA content and, PEG treatment on transformation efficiency

向原生質(zhì)體濃度為4×105個·mL-1的轉(zhuǎn)化體系中加入不同量的p35S-GFP質(zhì)粒，經(jīng)相同的PEG處理和孵育時間，結(jié)果如圖5-B所示，當(dāng)轉(zhuǎn)化體系中DNA含量為75 μg·mL-1原生質(zhì)體時，轉(zhuǎn)化效率最佳，約為79%.

本研究分析了不同終濃度的PEG4000對茉莉花花瓣原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響(圖5-C).在終濃度為200 g·L-1的PEG處理下花瓣原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率顯著高于其他濃度，其次是150和250 g·L-1的PEG終濃度，50 g·L-1PEG處理下原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率最低.

為進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，本試驗(yàn)還比較了PEG誘導(dǎo)時間對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響(圖5-D).PEG處理時間在10 min以內(nèi)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率均達(dá)到70%以上，當(dāng)處理時間超過15 min,轉(zhuǎn)化效率顯著降低.

2.3 茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系的建立

綜合分析了影響茉莉花原生質(zhì)體分離的主要因素，建立了茉莉花花瓣原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化體系.試驗(yàn)流程為：以溫室或自然環(huán)境中生長并盛開的茉莉花朵為材料，取其充分展開的花瓣為外植體(圖6-A)，用刀片將花瓣切割到足夠纖細(xì)且均勻，移至含15 g·L-1纖維素酶，4 g·L-1離析酶和8 g·L-1果膠酶的酶解混合液中，每5 mL酶解液可酶解約0.5 g花瓣量(圖6-B)，酶解5h，過濾收集到的原生質(zhì)體經(jīng)過清洗和沉淀，可獲得明顯的原生質(zhì)體聚集層(圖6-C). 用MMG溶液將收集到的原生質(zhì)體稀釋至濃度為4×105個·mL-1，按75 μg·mL-1原生質(zhì)體的比例加入含GFP標(biāo)簽的外源質(zhì)粒DNA，再加入等體積的400 g·L-1PEG溶液，混勻后，室溫誘導(dǎo)約5 min，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體暗處孵育16 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)出綠色熒光信號的原生質(zhì)體(圖6-E)，說明含GFP熒光蛋白標(biāo)簽的質(zhì)?？筛咄繉?dǎo)入茉莉花花瓣原生質(zhì)體，并得到穩(wěn)定表達(dá).

A.用于制備原生質(zhì)體的盛開的茉莉花；B.切成細(xì)絲狀的花瓣浸泡于酶解液中；C.沉淀后的花瓣原生質(zhì)體(虛線所示)；D.明場下的轉(zhuǎn)化后的花瓣原生質(zhì)體;E.綠色熒光通道下轉(zhuǎn)化后瞬時表達(dá)GFP蛋白的花瓣原生質(zhì)體.標(biāo)尺=49 μm.圖6 茉莉花瓣原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化Fig.6 Isolation and transformation of jasmine petal protoplasts

進(jìn)一步利用含有轉(zhuǎn)錄因子JsLHY-GFP融合載體，進(jìn)行目標(biāo)基因的原生質(zhì)體表達(dá)研究.以p35S-GFP空載體為對照，分別轉(zhuǎn)入茉莉花瓣原生質(zhì)體后，通過激光共聚焦顯微鏡掃描檢測它們的亞細(xì)胞定位.觀察顯示GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)入花瓣原生質(zhì)體后，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等部位均有明顯綠色熒光信號，這與其他植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中觀察到的結(jié)果一致[12,16,17]，而轉(zhuǎn)入JsLHY-GFP融合載體的花瓣原生質(zhì)體產(chǎn)生的綠色熒光信號主要集中在細(xì)胞核中(圖7)，說明轉(zhuǎn)錄因子JsLHY定位于茉莉花細(xì)胞的細(xì)胞核中行使功能.

Bright field:明場下原生質(zhì)體狀態(tài)；GFP:GFP熒光；Nucleus:DAPI染色的原生質(zhì)體細(xì)胞核；Merge:明場下細(xì)胞狀態(tài)，GFP熒光和DAPI染色的原生質(zhì)體細(xì)胞核的疊加.標(biāo)尺=5 μm.圖7 GFP和JsLHY-GFP在茉莉花瓣原生質(zhì)體中的分布Fig.7 Distribution of GFP and JsLHY-GFP in the transformed jasmine petal protoplasts

2.4 茉莉花蛋白JsSWEET1和JsSWEET17的亞細(xì)胞定位分析

為檢驗(yàn)茉莉花來源的蛋白在茉莉花原生質(zhì)體和異源表達(dá)體系中的亞細(xì)胞定位是否一致，本研究選擇了茉莉花的2個糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員JsSWEET1和JsSWEET17[14]，采用上述優(yōu)化建立的茉莉花花瓣原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來分析它們的亞細(xì)胞分布，同時以擬南芥葉片原生質(zhì)體系統(tǒng)[12]作為對照.由于白色花瓣原生質(zhì)體中不含葉綠體，無法檢測到葉綠體產(chǎn)生的自發(fā)熒光，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，JsSWEET1-GFP融合蛋白分布于茉莉花瓣原生質(zhì)體細(xì)胞膜上，同時在胞質(zhì)中有明顯的斑點(diǎn)狀分布，而在擬南芥葉肉原生質(zhì)體中JsSWEET1-GFP主要以斑點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖8-A和C).JsSWEET17-GFP在茉莉花瓣原生質(zhì)體和擬南芥葉片原生質(zhì)體中均主要分布于細(xì)胞質(zhì)或胞質(zhì)內(nèi)膜系統(tǒng)中(圖8-B和D).

A-B.JsSWEET1-GFP和JsSWEET17-GFP在茉莉花瓣原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；C-D.JsSWEET1-GFP和JsSWEET17-GFP在擬南芥葉片原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位.Bright field:明場下原生質(zhì)體狀態(tài)；GFP:GFP熒光；Chlorophyll:葉綠體自發(fā)熒光；Merge:明場下細(xì)胞狀態(tài)，GFP熒光和葉綠體自發(fā)熒光的疊加.標(biāo)尺=10 μm.圖8 JsSWEET1-GFP和JsSWEET17-GFP在茉莉花瓣原生質(zhì)體和擬南芥葉片原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of JsSWEET1-GFP and JsSWEET17-GFP in jasmine petal protoplasts and Arabidopsis mesophyll protoplasts

3 小結(jié)與討論

茉莉花作為一種有重要經(jīng)濟(jì)價值的花卉植物，由于其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺少使得其在遺傳轉(zhuǎn)化等方面的研究極其困難，而使用原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化則在一定程度上克服了這一障礙.目前，關(guān)于茉莉花原生質(zhì)體制備方法的研究尚未見報道.因此，本研究在借鑒擬南芥原生質(zhì)體制備的基礎(chǔ)上，探索了茉莉花植株上適合分離出原生質(zhì)體的組織器官，系統(tǒng)地改良了其原生質(zhì)體的制備條件和轉(zhuǎn)化條件，獲得了擁有較高數(shù)量和活力的花瓣原生質(zhì)體，并表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)化效果.茉莉花花瓣原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的建立，為茉莉花基因和蛋白的研究提供了快捷且更有針對性的受體材料和實(shí)驗(yàn)平臺，避免了利用其他模式植物瞬時轉(zhuǎn)化體系可能帶來的表達(dá)或定位紊亂，使得研究結(jié)果更具說服力.

獲得高質(zhì)量的植物原生質(zhì)體，需要考慮到合適的外植體、酶液組合與濃度、酶解時間和酶液滲透壓等關(guān)鍵因素[18-20]，幼嫩外植體常是分離原生質(zhì)體的最佳材料，研究表明，盛開的茉莉花花瓣相較于葉片具備組織幼嫩、細(xì)胞排列松散等特點(diǎn)，更適合作為原生質(zhì)體游離的材料.本研究還發(fā)現(xiàn)果膠酶對茉莉花花瓣原生質(zhì)體的分離有關(guān)鍵作用，當(dāng)酶液中缺少果膠酶時游離出的原生質(zhì)體數(shù)量稀少，而在纖維素酶、離析酶和果膠酶同時使用時，原生質(zhì)體產(chǎn)量有明顯改善.經(jīng)綜合分析，本試驗(yàn)中分離茉莉花瓣原生質(zhì)體的最適宜酶類組合為：15 g·L-1纖維素酶+4 g·L-1離析酶+8 g·L-1果膠酶，最優(yōu)酶解時間為5 h.

由于可以清晰看見其細(xì)胞膜與細(xì)胞器，使原生質(zhì)體在蛋白亞細(xì)胞定位上更具有優(yōu)勢， 利用原生質(zhì)體進(jìn)行簡易的基因瞬時表達(dá)及亞細(xì)胞定位是當(dāng)前研究植物分子與細(xì)胞生物學(xué)中最常用且高效的方法[21].本實(shí)驗(yàn)室在研究茉莉花開花過程相關(guān)功能基因時，鑒定到一系列在茉莉花瓣中特異性高度表達(dá)的基因[14]，采用已建立的茉莉花瓣原生質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)，成功鑒定了擬南芥生物鐘調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AtLHY[13]在茉莉花中的同源蛋白JsLHY具有細(xì)胞核定位特性.此外，茉莉花的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可能介導(dǎo)跨細(xì)胞膜的糖運(yùn)輸與儲存，其家族多個成員在開花過程中表達(dá)量顯著上調(diào)，煙草葉片瞬時表達(dá)顯示它們多分布于細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)膜中[14]，研究也表明，JsSWEET1-GFP和JsSWEET17-GFP分別定位于茉莉花瓣原生質(zhì)體的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，同時JsSWEET1-GFP還以斑點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中，猜測其可能通過高爾基體或囊泡等細(xì)胞器參與糖分運(yùn)輸，這些結(jié)果意味著它們介導(dǎo)的生物學(xué)功能發(fā)生在不同的細(xì)胞器中.在擬南芥葉片原生質(zhì)體中，JsSWEET17-GFP的分布與其在茉莉花瓣原生質(zhì)體中的定位基本一致，而JsSWEET1-GFP在細(xì)胞膜上定位信號較弱，主要以斑點(diǎn)狀分布于胞質(zhì)中，說明其亞細(xì)胞分布可能具有組織細(xì)胞特異性.

相較于成熟的擬南芥葉肉原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系，本研究中茉莉花瓣原生質(zhì)體的活性和轉(zhuǎn)化率還有待提升，不過由于栽培容易、自然盛開的茉莉花瓣容易收集、酶解時間短等優(yōu)點(diǎn)，使得花瓣原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可在1 d內(nèi)完成，有效促進(jìn)了某些基因功能的研究分析.受限于組織特異性，花瓣原生質(zhì)體中不含葉綠體，所以研究與葉綠體相關(guān)的蛋白或基因可能需要共轉(zhuǎn)化對照質(zhì)粒，未來對茉莉花葉片的原生質(zhì)體分離體系仍需進(jìn)一步優(yōu)化.