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    重組綿羊FSH 在CHO-K1 細(xì)胞中的表達(dá)及其應(yīng)用

    2019-12-04 09:29:22王興隴李倩馬瑞仙李生軍李向茸馮若飛
    生物技術(shù)通報(bào) 2019年12期
    關(guān)鍵詞:單克隆綿羊質(zhì)粒

    王興隴 李倩 馬瑞仙 李生軍 李向茸 馮若飛

    (1. 西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730030;2. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030)

    促卵泡激素(Follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)是從垂體前葉嗜堿性細(xì)胞中合成并分泌的一種促性腺物質(zhì)[1-2],它屬于糖蛋白激素家族,其分子結(jié)構(gòu)由α、β 兩個(gè)可解離的亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)成,種屬間存在差異[3-5]。FSH 與膜受體結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶,進(jìn)而促使環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋 白CREB(cAMP-response element binding protein,CREB)發(fā)生磷酸化[6],從而增加了P450 芳香化酶的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)了結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá),而CTGF 進(jìn)一步促進(jìn)了卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化,促使卵泡生成發(fā)育[7-8]。另外FSH 與膜受體結(jié)合后還可促進(jìn)黃體生成激素(Luteinizing hormone,LH)受體的產(chǎn)生,LH 作用于細(xì)胞內(nèi)膜,可產(chǎn)生睪酮或者十九碳底物-雄烯二酮,它們?cè)诨罨姆枷忝缸饔孟罗D(zhuǎn)變?yōu)榇萍に兀?7-β 雌二醇),雌激素進(jìn)一步誘導(dǎo)促性腺激素生成及排卵[9]。

    目前促卵泡激素被用于家禽的超數(shù)排卵與胚胎移植工作,我國(guó)在引進(jìn)種羊繁殖的過(guò)程中,就使用促卵泡激素增進(jìn)種羊種群的快速繁殖[10]。我國(guó)畜用FSH 多數(shù)是從垂體中提取的,但是從垂體中提取FSH 代價(jià)高昂,對(duì)工藝要求較高,感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)較大[11-13]。醫(yī)用FSH 一般是采用尿源性的FSH,即從絕經(jīng)期婦女尿液中提取,純度僅為95%,其中5%的雜質(zhì)源自尿液中殘留的一些成分,這些成分大都具有蛋白性質(zhì),會(huì)影響FSH 的生物學(xué)活性[14]。并且尿源性FSH 生產(chǎn)成本依舊較高,如果進(jìn)一步提高純度,成本會(huì)更加昂貴,所以畜用FSH 采用該種方式的可能性非常小。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,基因重組技術(shù)逐漸趨于成熟,因此使用重組DNA 技術(shù)生產(chǎn)FSH 成為可能,這解決了我國(guó)畜用FSH 成本高昂的問題并且為下一步工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞,CHO-K1 全懸浮細(xì)胞(命名為CHO-K1-S2)均由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。DNA ladder 購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司;ExRed 核酸染料購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;高純質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I 均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;綿羊促卵泡激素ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司;孕酮ELISA 檢測(cè)試劑盒、促黃體生成激素ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;促卵泡激素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司;SFM4-CHO培養(yǎng)基購(gòu)自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司;G418 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;電轉(zhuǎn)染緩沖液、pmaxGFPTMVector購(gòu)自瑞士Lonza 公司;超濾膜包購(gòu)自美國(guó)PALL 公司;6 周齡雌鼠購(gòu)自甘肅華瑞祥和生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 重組FSH 設(shè)計(jì)及合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取綿羊FSH-α(GenBank:NM_001009464.1)和綿羊FSH-β(GenBank:NM_001009798.1)的核苷酸序列。經(jīng)在線信號(hào)肽分析工具分析FSH-β 核苷酸序列中前1-18 位為信號(hào)肽,在信號(hào)肽序列前加入Kozark 序列用來(lái)增強(qiáng)真核基因的翻譯效率,并加入102 bp 的N4(4 個(gè)N 連糖基化位點(diǎn))核苷酸序列作為L(zhǎng)inker來(lái)連接FSH-β 和FSH-α,同時(shí)上游加入酶切位點(diǎn)BamH I,下游加入酶切位點(diǎn)EcoR I,與真核表達(dá)載體pcDNA3.1 進(jìn)行連接,序列設(shè)計(jì)完成后由南京金斯瑞公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成重組表達(dá)質(zhì)粒。

    1.2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 的酶切、測(cè)序鑒定 將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 用BamH I 和EcoR I 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,酶切體系如下:DEPC H2O 30 μL,10×K buffer 5 μL,BamH I 2.5 μL,EcoR I 2.5 μL,重組質(zhì)粒10 μL,37℃恒溫水浴中酶切4 h。并將重組質(zhì)粒經(jīng)由上海生工進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序正確后提取高純質(zhì)粒備用。

    1.2.3 重 組 質(zhì) 粒pcDNA3.1-FSHβα 電 轉(zhuǎn) 染CHOK1-S2 細(xì)胞 采用電轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 轉(zhuǎn)染至CHO-K1-S2 細(xì)胞中,同期設(shè)置對(duì)照組,對(duì)照質(zhì)粒為pmaxGFP。平衡階段:將CHO-K1 細(xì)胞專用電轉(zhuǎn)試劑置于室溫平衡30 min;細(xì)胞培養(yǎng)板中加入完全培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)熱。吸取活力≥95%,密度為2×106個(gè)cells/mL 的CHOK1-S2 細(xì)胞1 mL 于 900 r/min 離心10 min。于1 支新的EP 管中加入電轉(zhuǎn)液:82 μL Volume of Nucleofector Solution 和18 μL Volume of Supplement 混勻備用。收集細(xì)胞,加入上述混勻的電轉(zhuǎn)液,輕輕吹打混勻,再加入4 μg 質(zhì)粒,立即將混合液轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)完成后加入完全培養(yǎng)基,將電轉(zhuǎn)液和細(xì)胞吸至預(yù)平衡好的6 孔板中,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h 后使用熒光倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察,并取細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。

    1.2.4 CHO-K1-S2-FSH 單克隆細(xì)胞篩選 將細(xì)胞以每孔2 000 個(gè)接種至96 孔培養(yǎng)板,加入400 μg/mL G418 進(jìn)行初步篩選。15 d 后觀察,尋找形成細(xì)胞群落的孔,并取細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA 檢測(cè),將初篩得到的細(xì)胞命名為CHO-K1-S2-FSH。之后將初篩后的細(xì)胞接種至24 孔培養(yǎng)板,并加入400 μg/mL G418 加壓培養(yǎng)。待視野中細(xì)胞匯合度達(dá)到約90%后,用不含G418 的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,按1 個(gè)細(xì)胞每孔接種于96 孔培養(yǎng)板中,第2 天進(jìn)行觀察,對(duì)狀態(tài)良好的細(xì)胞再次進(jìn)行加藥篩選。培養(yǎng)7 d左右再次進(jìn)行觀察,得到單克隆細(xì)胞。經(jīng)ELISA 試劑盒檢測(cè),將FSH 表達(dá)量高的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并凍存。其余孔細(xì)胞合為一瓶,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并凍存。

    1.2.5 單克隆細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng) 將成功篩選得到的FSH 表達(dá)量高的單克隆細(xì)胞以5×105個(gè)/mL的接種量在生物反應(yīng)器上放大培養(yǎng),培養(yǎng)總體積為3 L。參數(shù)設(shè)置為:pH 值7.2,溫度37℃,溶氧40%,轉(zhuǎn)速160 r/min。白天為自動(dòng)控制溶氧即dO2保持在40%左右,夜間采取培養(yǎng)液表面通空氣的方法,防止細(xì)胞缺氧。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,每間隔12 h 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并吸取1 mL 細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA 檢測(cè),測(cè)定FSH 濃度,直至檢測(cè)到細(xì)胞中FSH 表達(dá)量開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)時(shí)即可停止培養(yǎng),并收取細(xì)胞上清于-20℃保存。

    1.2.6 重組綿羊FSH 蛋白超濾 將10 kD 的膜包安裝在超濾設(shè)備上,通入0.1 mol/L 的NaOH 將膜包清洗20 min,然后用純水繼續(xù)清洗10 min,通入1.2.5中收取的含有重組綿羊FSH 的上清運(yùn)行20 min,收集濾過(guò)部分與未濾過(guò)部分,并做好標(biāo)記。通入純水清洗10 min,更換為0.1 mol/L NaOH 清洗20 min,最后封住管路,使0.1 mol/L NaOH 充滿整個(gè)膜包。

    1.2.7 重組綿羊FSH 小鼠試驗(yàn) 經(jīng)BLAST 比對(duì)本研究設(shè)計(jì)的重組綿羊FSH 蛋白與小鼠FSH 蛋白的同源性可達(dá)85%,因此選擇小鼠對(duì)重組綿羊FSH 蛋白的生物活性進(jìn)行檢測(cè)。共分為5 組:200 ng/mL 小鼠FSH 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照組(PC),生理鹽水作為陰性對(duì)照組(NC),50 ng/mL 重組綿羊FSH組,100 ng/mL 重組綿羊FSH 組,200 ng/mL 重組綿羊FSH 組。采取皮下多次注射的方法免疫小鼠,注射一次后,間隔48 h 再次進(jìn)行注射,72 h 后進(jìn)行眼球采血,收集到的血樣4 000 r/min 離心5 min,獲取血清,用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中LH 和孕酮(Progesterone,Pg)含量。隨后解剖獲取小鼠卵巢,于體式顯微鏡下進(jìn)行拍照并稱重,比較各組之間的差異。

    1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,采用單因素ANOVAs 進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)。

    2 結(jié)果

    2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα的酶切、測(cè)序驗(yàn)證

    重 組 質(zhì) 粒pcDNA3.1-FSHβα 經(jīng) 雙 酶 切 鑒 定(BamH I/EcoR I),得到798 bp 的插入片段和5 428 bp 的載體片段,酶切后的目的基因的大小和載體的大小均符合預(yù)期(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中FSH 的核苷酸序列同源性為100%,說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 的雙酶切驗(yàn)證

    2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα蛋白表達(dá)檢測(cè)

    重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 電轉(zhuǎn)染至CHOK1-S2 細(xì)胞中,同期設(shè)置pmaxGFP 作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h 后,使用熒光倒置顯微鏡對(duì)試驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48 h 后對(duì)照組綠色熒光信號(hào)很強(qiáng),表明此次轉(zhuǎn)染效率達(dá)標(biāo)(圖2),試驗(yàn)組細(xì)胞上清經(jīng)ELISA 檢測(cè)有重組FSH 的表達(dá),表達(dá)量為130.16 ng/mL。說(shuō)明重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα 在CHO-K1-S2 細(xì)胞中成功分泌表達(dá)。

    圖2 轉(zhuǎn)染48 h 后的CHO-K1-S2 細(xì)胞

    2.3 CHO-K1-S2-FSH單克隆細(xì)胞篩選

    使 用400 μg/mL G418 加 壓 篩 選CHO-K1-S2-FSH 單克隆細(xì)胞,具體方法見1.2.4,經(jīng)過(guò)篩選得到19 株單克隆細(xì)胞,分別命名為M-FSH-βα-B31A7,M-FSH-βα-B31A8,M-FSH-βα-B31B3,M-FSHβα-B31B4,M-FSH-βα-B31B6,M-FSH-βα-B31B8,M-FSH-βα-B31C6,M-FSH-βα-B31C7,M-FSHβα-B31D7,M-FSH-βα-B31E8,M-FSH-βα-B31F6,M-FSH-βα-B31F8,M-FSH-βα-B31G7,M-FSH-βα-B31G10,M-FSH-βα-B32B3,M-FSH-βα-B32B8,M-FSH-βα-B32C2,M-FSH-βα-B32G3(圖3)。并 對(duì)單克隆細(xì)胞的上清液進(jìn)行ELISA 檢測(cè)(表1),篩選出蛋白高表達(dá)的單克隆細(xì)胞,最終我們選擇單克隆細(xì)胞CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    圖3 單克隆細(xì)胞

    2.4 單克隆細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)

    將CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 單克隆細(xì)胞進(jìn)行生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng),每間隔12 h 測(cè)定細(xì)胞密度和FSH 濃度,結(jié)果見圖4。此次培養(yǎng)周期中,細(xì)胞沒有出現(xiàn)泡沫過(guò)多和細(xì)胞結(jié)團(tuán)的現(xiàn)象,當(dāng)培養(yǎng)到72 h時(shí),表達(dá)的蛋白量出現(xiàn)下降趨勢(shì),此時(shí)細(xì)胞密度為3.87×106個(gè)cells/mL,蛋白表達(dá)量為297.97 ng/mL。此時(shí)進(jìn)行收樣,獲取重組綿羊FSH。

    表1 單克隆細(xì)胞上清中FSH 的ELISA 檢測(cè)

    圖4 CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 5L 生物反應(yīng)器培養(yǎng)

    2.5 重組綿羊FSH蛋白超濾

    對(duì)制備的重組綿羊FSH 進(jìn)行10 kD 膜包超濾,超濾濃縮液進(jìn)行ELISA 檢測(cè),F(xiàn)SH 濃度為531 ng/mL,提高了1.78 倍,且濃度達(dá)到注射濃度。

    2.6 重組FSH對(duì)小鼠卵巢重量的影響

    使用體式顯微鏡對(duì)小鼠卵巢進(jìn)行觀察并拍照(圖5),然后對(duì)卵巢進(jìn)行稱重,試驗(yàn)組小鼠卵巢重量較陰性對(duì)照組明顯增加且差異顯著(圖6),說(shuō)明注射一定劑量的重組綿羊FSH 蛋白可以促進(jìn)卵巢生長(zhǎng)。

    2.7 小鼠孕酮Pg及黃體生成激素LH的ELISA檢測(cè)

    圖5 小鼠卵巢(10×)

    圖6 各組間小鼠卵巢重量

    將采集到的各組小鼠血清用孕酮Pg 和黃體生成激素LH 的ELISA 試劑盒分別進(jìn)行檢測(cè),由結(jié)果可知(圖7-A、7-B),注射一定劑量的重組綿羊FSH(FSH 濃度≥50 ng/mL)可以顯著增加小鼠體內(nèi)孕酮Pg 和黃體生成激素LH 的含量,各試驗(yàn)組之間不呈劑量依賴性,且與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異不顯著。

    3 討論

    基因工程手段表達(dá)FSH 的關(guān)鍵是糖基化修飾,F(xiàn)SH 只有經(jīng)過(guò)糖基化修飾才具有生物活性[15]。如果使用原核表達(dá)FSH,蛋白能夠成功表達(dá),但是表達(dá)產(chǎn)物存在以下幾點(diǎn)問題:(1)表達(dá)產(chǎn)物是包涵體,不利于獲取蛋白;(2)在變性和復(fù)性過(guò)程中,二硫鍵不能全部復(fù)原,會(huì)影響空間構(gòu)象;(3)原核生物無(wú)糖基化修飾功能。所以FSH 的表達(dá)不能選用原核表達(dá),只能選用真核表達(dá)系統(tǒng)。人類試管嬰兒技術(shù)中,果納芬(Gonal-F)和普麗康(Puregon)是最常見的促排卵藥物,它們均運(yùn)用了基因工程技術(shù),將促卵泡激素FSH 的基因?qū)隒HO 細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行制備,并且目前上市的大部分復(fù)雜蛋白藥物均由CHO 細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)[16-19]。在真核表達(dá)系統(tǒng)中,表達(dá)雙亞基結(jié)構(gòu)的蛋白有兩種方案:(1)將兩種亞基的基因分別構(gòu)建在兩個(gè)載體上進(jìn)行蛋白的表達(dá);(2)將兩種亞基的基因構(gòu)建在同一個(gè)載體上進(jìn)行蛋白的表達(dá)。果納芬采用的是第一種方案,即將α 亞基基因構(gòu)建在攜帶DHFR 的表達(dá)載體上,β 亞基基因構(gòu)建在正常表達(dá)載體上,然后共轉(zhuǎn)染至DHFR 缺陷型CHO 細(xì)胞中,使用MTX 進(jìn)行單克隆細(xì)胞的篩選,從而篩選出表達(dá)量高、遺傳穩(wěn)定的重組人FSH 表達(dá)細(xì)胞。普麗康采用的則是第2 種方案,即將α 和β 兩個(gè)亞基構(gòu)建在同一載體pBR327上,該表達(dá)載體上攜帶有G418 抗性基因和MT-IIA基因,然后轉(zhuǎn)染至CHO 細(xì)胞后使用G418 進(jìn)行篩選,從而獲取生產(chǎn)所用的細(xì)胞[20]。

    圖7 小鼠生殖激素的檢測(cè)結(jié)果

    本研究采用第2 種方案進(jìn)行重組綿羊FSH 的制備,同時(shí)為了增強(qiáng)真核基因的翻譯效率,在信號(hào)肽序列前加入Kozark 序列,并用N4 核苷酸序列作為L(zhǎng)inker 來(lái)連接FSH-β 和FSH-α。構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至CHO 細(xì)胞后,采用G418 加壓篩選獲取了高表達(dá)綿羊重組FSH 蛋白的工程細(xì)胞。將生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)并超濾濃縮后獲得的重組FSH 免疫小鼠測(cè)定其生物活性,結(jié)果顯示,當(dāng)注射重組FSH后,小鼠卵巢重量增加,孕酮和黃體生成素均上調(diào),但是重組FSH 無(wú)明顯的濃度依賴性,當(dāng)濃度大于50 ng/mL 時(shí),重組FSH 已經(jīng)顯著促進(jìn)了孕酮和黃體生成素的產(chǎn)生。FSH 一直在動(dòng)物超數(shù)排卵、胚胎移植、繁殖育種和相關(guān)疾病治療上有廣闊的應(yīng)用前景,并且由于目前我國(guó)畜用FSH 生產(chǎn)成本極高,因此重組綿羊FSH 將對(duì)工業(yè)化應(yīng)用具有重大意義。

    4 結(jié)論

    本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FSHβα,并實(shí)現(xiàn)其在全懸浮CHO-K1-S2 細(xì)胞中分泌表達(dá),經(jīng)單克隆篩選獲得FSH 表達(dá)量高的細(xì)胞株,然后利用生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),收集上清超濾濃縮后獲得重組綿羊FSH;之后將制備的重組綿羊FSH 免疫雌鼠,結(jié)果顯示注射重組綿羊FSH 后小鼠卵巢體積增大、重量增加,并且小鼠血清中的黃體生成素LH和孕酮Pg 含量均顯著上調(diào)。這些結(jié)果均證明重組綿羊FSH 對(duì)小鼠具有一定的生物活性。

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