新型H7N9 禽流感病毒NA 蛋白胞外區(qū)片段的生物信息學(xué)分析及其多克隆抗體制備

仇書(shū)興 殷星 蘇淑娟 殷俊磊 張家友 劉雪賀 賈坤義 楊曉明

（1. 新鄉(xiāng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453003；3. 國(guó)藥集團(tuán)中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100000）

2013 年3 月，中國(guó)首次報(bào)道人感染新型H7N9禽流感病毒病例，引起嚴(yán)重甚至致命呼吸道疾病。隨后，疫情迅速席卷中國(guó)大陸20 多個(gè)省、市、自治區(qū)，中國(guó)香港、中國(guó)臺(tái)灣、馬來(lái)西亞和加拿大等地陸續(xù)報(bào)道H7N9 禽流感病毒感染病例，截至2019年10 月2 日，共造成1 568 例感染、616 人死亡［1］。研究證實(shí)H7N9 禽流感病毒在第5 次和第6 次大流行期間，感染家禽和人類(lèi)且對(duì)雪貂和雞群的致病性增強(qiáng)［2-4］。因此，美國(guó)疾病預(yù)防和控制中心結(jié)合流感風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果，將H7N9 亞型禽流感病毒列為高風(fēng)險(xiǎn)病原［5］。流行病學(xué)調(diào)查表明大部分患者具有活禽接觸史，意味著活禽市場(chǎng)和新型H7N9 流感爆發(fā)存在著緊密的聯(lián)系［6］。目前，新型H7N9 病毒無(wú)法通過(guò)呼吸道、母嬰、血液等方式實(shí)現(xiàn)人-人之間的傳播［7］，但它具有與人類(lèi)感染相關(guān)的基因組成［8］，在少量非人源高致病H7N9 毒株中，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶抑制劑（Neuraminidase-inhibitor，NAI）抗性（NA中的R292K）和哺乳動(dòng)物適應(yīng)性突變（如PB2 中的E627K 和A588V）［9］。此外，H7N9 禽流感病毒人-人傳播突變動(dòng)力學(xué)模型分析表明，將來(lái)H7N9 病毒可以獲得人-人傳播的特征［10］。因此，對(duì)H7N9 禽流感病毒的研究工作亟需深入開(kāi)展，以避免給人類(lèi)健康造成威脅。

NA 是流感病毒主要囊膜纖突之一，天然NA 蛋白有4 個(gè)相同的單體組成四聚體，每種單體全長(zhǎng)約470 個(gè)氨基酸，并有胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、莖部區(qū)及頭部區(qū)4 個(gè)區(qū)域組成［11］。近來(lái)研究成果表明，NA 除了在病毒釋放中發(fā)揮作用，還有助于病毒與細(xì)胞糖蛋白唾液酸基團(tuán)結(jié)合，補(bǔ)充血凝素（Hemagglutinin，HA）的受體結(jié)合功能，提高NA 酶活性，并促進(jìn)病毒感染［12］。無(wú)論是自然突變還是通過(guò)遺傳修飾獲得的NA 活性位點(diǎn)突變體，其框架和催化殘基都可以在不同程度上改變病毒復(fù)制能力、感染性和對(duì)抗病毒抑制劑的敏感性［11，13］?？傊?，NA 在病毒吸附、侵入、釋放以及維持與HA 的功能平衡等方面起著重要的多功能作用［11］。

本研究以新型H7N9 禽流感病毒（安徽株）NA蛋白胞外區(qū)片段為研究對(duì)象，進(jìn)行基本理化性質(zhì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析。為了在E. coli中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，選取NA 蛋白胞外區(qū)序列并進(jìn)行密碼子優(yōu)化與合成。把構(gòu)建正確的pET28b-tN9 重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，將進(jìn)一步經(jīng)親和純化、SDS-PAGE檢測(cè)及質(zhì)譜鑒定的目標(biāo)蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，以期為N9 亞型禽流感病毒血清學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET28b（+）、E. coliDH5α 和E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞由新鄉(xiāng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存；E. coliRosetta 和E. coliArctic Express（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京鐘鼎生物公司；Fast Digest 限制性內(nèi)切酶Nco I 和Xho I 購(gòu)自Thermo Scientific 公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒和Solution I 購(gòu)自TAKARA 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK 公司；Ni Sepharose 6 FF、Sepharose 4B 純化填料購(gòu)自GE 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院提供；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 和DAB 顯色液購(gòu)自武漢博士德公司；TMB顯色液購(gòu)自碧云天公司；新西蘭大白兔購(gòu)自武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人用H7N9 滅活病毒原液（上海株）由上海生物制品研究所陳則研究員饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 新型H7N9 禽流感病毒NA 蛋白胞外區(qū)片段的生物學(xué)信息分析 參考相關(guān)文獻(xiàn)［14］，采用EXPASY系統(tǒng)的Protparam 程序分析新型H7N9 禽流感病毒（安徽株）NA 蛋白胞外區(qū)片段（truncated N9，tN9）理 化 特 征（https：//web.expasy.org/protparam/）；使用Protscale 程序Kyte&Doolittle 算法分析其疏水性（https：//web.expasy.org/protscale/）；使用SOPMA 軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用PHYRE2 protein fold recognition server（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預(yù)測(cè)全長(zhǎng)NA 蛋白和NA 蛋白胞外區(qū)片段三級(jí)結(jié)構(gòu)［15］，其PDB 文件用 VMD（Visual Molecular Dynamics）1.9.3軟件進(jìn)行可視化分析［16］。

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，按照文獻(xiàn)方法［17］以GenScript Rare Codon Analysis 工具對(duì)NA 胞外區(qū)核苷酸序列（1 290 bp）進(jìn)行基因密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)，確認(rèn)目標(biāo)序列合框后由南京金斯瑞公司進(jìn)行合成。

1.2.2 目標(biāo)基因表達(dá)載體的構(gòu)建 目標(biāo)基因合成時(shí)，在5′端添加NcoI 酶切位點(diǎn)（CCATGG），在3′端刪除TAA 終止密碼子，添加X(jué)hoI 酶切位點(diǎn)（CTCGAG），合成后克隆至T 載體。以NcoI 和XhoI 雙酶切表達(dá)載體pET28b 和上述T 載體，凝膠回收目的序列，以Solution I 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素的LB 平板（終濃度為50 μg/mL），37℃培養(yǎng)16-20 h。以載體通用引物為擴(kuò)增引物，以重組單菌落為模板，進(jìn)行PCR鑒定，提取陽(yáng)性克隆送武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28b-tN9。

1.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、親和純化與質(zhì)譜鑒定 將pET28b-tN9 分別轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）、E.coliRosetta 和E. coliArctic Express（DE3）感 受 態(tài)細(xì)胞，挑取重組單菌落分別于50 mL 含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD 值達(dá)到0.5 時(shí)，以0.2 mmol/L 的IPTG 終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，E. coliBL21（DE3）、E. coliRosetta 重組菌分別在30℃和37℃條件下誘導(dǎo)5 h，E. coliArctic Express（DE3）在16℃溫度下誘導(dǎo)過(guò)夜。離心收集菌體進(jìn)行超聲破碎，分離上清和沉淀，以10% SDS-PAGE 分析蛋白的表達(dá)情況。

根據(jù)上步結(jié)果選取其中一種重組菌和誘導(dǎo)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包涵體形式表達(dá)的蛋白經(jīng)變性、復(fù)性后，參照相關(guān)文獻(xiàn)［18］用鎳柱親和層析法純化目標(biāo)蛋白，采用不同濃度咪唑溶液進(jìn)行洗脫，收集流穿液和洗脫液，以10% SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白純化情況。純化后蛋白濃縮并以SDS-PAGE 電泳檢測(cè)蛋白純度，將電泳后目標(biāo)條帶切割，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（Maldi-toftof）檢測(cè)［19］，以進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)蛋白。

1.2.4 動(dòng)物免疫與多克隆抗體制備 將驗(yàn)證正確的目的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合后，以多點(diǎn)皮下方式免疫新西蘭大白兔（400 μg/只）。免疫前經(jīng)耳緣靜脈采血并分離血清，用作陰性對(duì)照。每2 周免疫1 次，之后用相同劑量的重組蛋白與弗氏不完全佐劑配伍，第4 次免疫一周后采血大量制備抗血清，并準(zhǔn)備純化。結(jié)合文獻(xiàn)方法［20］，將重組目標(biāo)蛋白偶聯(lián)Sepharose 4B 制備成抗原親和純化層析柱，將所得抗血清與PBS 等量混合后緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸緩沖液洗脫，然后在PBS 中4℃透析過(guò)夜，進(jìn)行后續(xù)多克隆抗體檢測(cè)。

1.2.5 Western blotting 法鑒定多抗特異性 采用Western blotting 方法檢測(cè)抗體特異性。將純化的重組蛋白、pet28a 空載體誘導(dǎo)后產(chǎn)物和人用H7N9 滅活病毒原液（上海株），經(jīng)SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，以1% BSA 于37℃封閉1 h，PBST 洗滌3次，每次5 min；用制備的多克隆抗體（1∶3 000 稀釋?zhuān)┳鳛橐豢?，室溫孵? h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；加入1∶1 500 稀釋的山羊抗兔HRP-IgG，室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min，DAB 顯色并拍照留用。

1.2.6 間接ELISA 法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià) 將重組蛋白用包被液稀釋成3 μg/mL，每孔100 μL，4℃包被。次日棄去包被液，洗板3 次，每孔加入200 μL 封閉液，37℃恒溫孵育1 h，用于ELISA 檢測(cè)。制備的抗體按1∶500 倍比稀釋?zhuān)琀RP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 稀釋度為1∶2 000，顯色劑為T(mén)MB，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A450）值。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性血清對(duì)照，樣品A450值≥陰性對(duì)照A450值的2.1 倍判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 NA蛋白胞外區(qū)片段生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)Protparam 程序分析，tN9分子式為C2154H3283N623O674S27，分子質(zhì)量單位為49.6 Ku，理論等電點(diǎn)為6.56，半衰期為30 h（Mammalian）、＞20 h（Yeast）、＞10 h（Escherichia coli），不穩(wěn)定指數(shù)43.49，為不穩(wěn)定蛋白。應(yīng)用Protscale 構(gòu)建的疏水圖譜顯示，多肽鏈第270 位的Asp 具有最高的分值1.389，疏水性最強(qiáng)，第292 位的Pro 具有最低的分值-2.978，親水性最強(qiáng)，整體來(lái)看，該基因編碼蛋白為親水性蛋白。

以SOPMA 軟件預(yù)測(cè)該重組蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，其結(jié)果表明，α 螺旋（Alpha helix，縮寫(xiě)為h）占7.95%；β 折疊（Extended strand，縮寫(xiě)為e）占31.82%；β轉(zhuǎn)角（Beta turn，縮寫(xiě)為t）占7.73%；無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil，縮寫(xiě)為c）占52.50%，主要以無(wú)規(guī)則卷曲、β 折疊為主（圖1）。

圖1 SOPMA 軟件預(yù)測(cè)的tN9 二級(jí)結(jié)構(gòu)

將截短前后NA 蛋白序列提交至PHYRE2 服務(wù)器自動(dòng)建模，構(gòu)建了NA 蛋白截?cái)嗲昂蟮娜S結(jié)構(gòu)（圖2-A、圖2-B）。將PDB 文件用VMD 軟件進(jìn)行處理，并以黃色標(biāo)記出HIS 原子位置，比對(duì)分析顯示截短前后蛋白質(zhì)莖部區(qū)和頭部區(qū)結(jié)構(gòu)無(wú)顯著差異，刪除胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)不會(huì)影響NA 蛋白免疫原性，HIS tag 暴露于空間之外，可以用于后續(xù)蛋白純化（圖2-C、圖2-D）。

密碼子偏好性是影響蛋白表達(dá)的重要因素之一。經(jīng)在線稀有密碼子分析工具進(jìn)行密碼子優(yōu)化分析，結(jié)果表明tN9 編碼基因密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaptation index，CAI）為0.59，GC 含量為43.64%，密碼子使用頻率分布系數(shù)CFD 為13%。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，對(duì)tN9 序列稀有密碼子進(jìn)行同義替換后，CAI 指數(shù)為0.91，達(dá)到理想值范圍（0.8-1.0），GC 含量為58.55%，符合理想值區(qū)間（30%-70%），有利于后續(xù)蛋白的高效表達(dá)。使用序列處理在線工具 包（SMS，http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）對(duì)優(yōu)化前后的序列進(jìn)行比對(duì)（圖3）。

2.2 pET28b-tN9重組表達(dá)載體構(gòu)建

將靶基因與pET28b 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑選重組菌落進(jìn)行PCR鑒定，凝膠電泳顯示在1 500 bp 左右出現(xiàn)目標(biāo)條帶，與預(yù)期大小相符，陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組載體構(gòu)建成功（圖4）。

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

以IPTG 誘導(dǎo)3 種重組菌后，目標(biāo)蛋白均有表達(dá)，僅在Arictic 中有微弱的可溶性表達(dá)（圖5 泳道16），表達(dá)量較低，其余均為包涵體表達(dá)形式（圖5）。考慮到后續(xù)動(dòng)物免疫的抗原劑量要求，選擇重組E.coliBL21（DE3）為誘導(dǎo)菌株，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)，誘導(dǎo)條件為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。

2.4 目的蛋白親和純化與質(zhì)譜鑒定

圖2 NA 蛋白截短前（A、C）后（B、D）結(jié)構(gòu)比對(duì)

圖3 tN9 基因序列密碼子優(yōu)化前后比對(duì)

圖4 重組菌落PCR 鑒定

圖5 SDS-PAGE 檢測(cè)重組tN9 蛋白的表達(dá)

誘導(dǎo)結(jié)束后，將離心收獲的菌體進(jìn)行超聲破碎，以含8 mol/L 尿素的PBS 重懸沉淀，使之徹底溶解，并在含4 mol/L 尿素、2 mol/L 尿素、1 mol/L 尿素的Buffer 中透析，然后上柱親和純化，并用100 mmol/L、150 mmol/L 和250 mmol/L 的咪唑梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定（圖6-A）?；旌咸荻认疵摌悠?，以BSA 標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，SDSPAGE 分析其純度不低于85%。切膠后目標(biāo)條帶（圖6-B）進(jìn)行串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到的蛋白質(zhì)匹配得分為455，分子質(zhì)量49 524u，等電點(diǎn)（Isoelectric point，PI）6.56，匹配度21%（圖7）。

圖6 SDS-PAGE 檢測(cè)tN9 重組蛋白親和純化產(chǎn)物

2.5 Western blotting法鑒定多抗特異性

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明，于圖8 泳道1和3，50 kD 左右位置各出現(xiàn)一條蛋白條帶（tN9 分子量49.6 kD，全長(zhǎng)NA 分子量51.8 kD），表明制備的抗體能與經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的重組蛋白和天然新型H7N9 禽流感病毒（上海株）發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

2.6 多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)

將tN9 蛋白免疫兔子制備的抗體進(jìn)行1∶500 倍比稀釋?zhuān)g接ELISA 法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示效價(jià)為1∶25 6000（圖9）。

3 討 論

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，新型H7N9 禽流感病毒是H7N3 禽流感病毒、HX（2或11）N9 流感病毒和H9N2禽流感病毒的重配株。該病毒HA 基因來(lái)自鴨源H7N3 病毒，NA 基因來(lái)自于候鳥(niǎo)源HX（2或11）N9 病毒，其余的6 個(gè)基因（PB2、PB1、PA、NP、M 和NS）來(lái)自H9N2 病毒［6］。經(jīng)過(guò)多亞型病毒重配后，賦予了H7N9 病毒新的流行特征：對(duì)人和哺乳動(dòng)物具有高致病性，但對(duì)包括雞在內(nèi)的家禽一般具有低致病性；具有截短的NA 蛋白，莖部缺失5 個(gè)氨基酸；部分人源H7N9 病毒分離株在受體結(jié)合位點(diǎn)HA 中存在天然Q226L 突變、PB2 蛋白在第627 和701 位置具有Lys 和Asn 突變；鳥(niǎo)源H7N9 分離株P(guān)B2 蛋白在第627 和701 位置保留Glu 和Asp，這些新特征對(duì)于H7N9 禽流感病毒在哺乳動(dòng)物宿主上呼吸道進(jìn)行復(fù)制是非常重要的［6］。

圖7 tN9 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果

圖8 Western blotting 鑒定tN9 多克隆抗體免疫反應(yīng)性

圖9 ELISA 檢測(cè)tN9 蛋白多克隆抗體效價(jià)

流感病毒基因易發(fā)生抗原漂移、抗原轉(zhuǎn)換，從而可能導(dǎo)致流感爆發(fā)，NA 基因是流感病毒基因組突變率較高的基因［21］。在一些H7N9 臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了與耐藥性相關(guān)的NA 氨基酸突變位點(diǎn)，NAR292K，研究表明H7N9 分離株NA 的R292K 取代，對(duì)奧司他韋和帕拉米韋產(chǎn)生高度耐藥性，對(duì)扎那米韋產(chǎn)生部分耐藥性。而且，耐藥突變位點(diǎn)的H7N9病毒株，在人體的病毒復(fù)制能力、對(duì)小鼠的毒力和在豚鼠間的傳播能力，與未發(fā)生突變的病毒株相比沒(méi)有差別［22］。NA 作為受體破壞酶，可以切割α 2-3 和α 2-6 連接唾液酸，釋放病毒顆粒［23］，為了進(jìn)一步確定NA 在病毒受體結(jié)合中的可能作用，對(duì)人畜共患H7N9 病毒株的N9 NA 比對(duì)、分析，結(jié)果證實(shí)N9 NA 具有與唾液酸結(jié)合的活性血細(xì)胞吸附（Hemadsorption，Hb）位點(diǎn)，其不尋常的唾液酸酶位點(diǎn)動(dòng)力學(xué)特征，可增強(qiáng)病毒與唾液酸受體類(lèi)似物的整體結(jié)合能力，尤其是增強(qiáng)和人α 2，6-連接唾液酸相似受體的結(jié)合［24］。因此，亟需深入開(kāi)展對(duì)N9蛋白結(jié)構(gòu)突變和受體功能活性的研究。

目前，流感病毒疫苗的有效成分主要基于HA蛋白，研究表明NA 可能也具備良好的免疫原性［25］。研究人員制備了基于NA 的重組病毒樣顆粒疫苗，免疫N1 NA VLPs 的雪貂產(chǎn)生高滴度的血清NA 抑制抗體（NA-inhibition，NI），可以保護(hù)雪貂免受致死劑量的病毒侵襲，這為基于NA 疫苗的開(kāi)發(fā)提供了支持［26］。目前，尚無(wú)關(guān)于N9 NA 作為疫苗標(biāo)靶的報(bào)道，試推測(cè)N9 蛋白可能同樣存在病毒特異性抗原表位，誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體?？傊?，NA 在病毒侵入、釋放、小分子藥物作用標(biāo)靶和免疫原性方面發(fā)揮多重重要功效［25］，因此，深入研究NA 的結(jié)構(gòu)和功能、NA 在流感感染和復(fù)制周期中的復(fù)雜作用，特別是H7N9 病毒HA 和NA 糖蛋白如何各自發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)功能平衡以維持病毒適應(yīng)性等方面具有重要意義［11］，然而目前尚無(wú)針對(duì)N9 蛋白的特異性抗體，這一定程度上限制了對(duì)N9 蛋白的深入研究。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們對(duì)流感病毒的研究日益深入，但對(duì)HA 糖蛋白的研究較多，對(duì)NA 的報(bào)道較少，僅有在酵母［27］、哺乳動(dòng)物細(xì)胞［28］和昆蟲(chóng)細(xì)胞［29］等中可溶性表達(dá)H5N1 病毒和H1N1 病毒NA 單體和四聚體的報(bào)道，對(duì)于N9 的表達(dá)和純化，Margine 等［30］以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化NA蛋白，而關(guān)于N9 基因原核表達(dá)及免疫原性的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)基因重組方法，利用pET28b表達(dá)tN9 蛋白，IPTG 誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE 鑒定，基本以包涵體形式存在。吳艷菊等［31］、萬(wàn)潤(rùn)等［21］分別以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H5N1 亞型和H6N6 亞型流感病毒的NA，表達(dá)蛋白均以包涵體形式存在，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究表達(dá)的安徽株H7N9 流感病毒tN9 包涵體經(jīng)變性、復(fù)性后制備的多抗，Western blotting 顯示其與人用H7N9 禽流感病毒（上海株）結(jié)合較弱（H7N9 禽流感病毒全病毒上樣量5 μL），以H7N9 禽流感病毒（上海株）作為包被抗原，ELISA 檢測(cè)效價(jià)僅為1∶2 000（H7N9 禽流感病毒全病毒以1∶1 000 稀釋包被，該部分?jǐn)?shù)據(jù)未顯示），可能的主要原因?yàn)椋篘A 蛋白的含量本身不高（無(wú)法準(zhǔn)確定量H7N9 全病毒中的NA 含量）；以當(dāng)前的包涵體蛋白變性、復(fù)性工藝獲得的目標(biāo)蛋白與天然蛋白可能存在一定的結(jié)構(gòu)和功能差異；上海株H7N9 禽流感病毒NA 氨基酸存在突變［32］（上海株N9 是K294，安徽株N9 是R294），從而影響了二者之間的結(jié)合活性。

4 結(jié)論

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)新型H7N9 禽流感病毒NA 蛋白胞外區(qū)抗原進(jìn)行預(yù)測(cè)，刪除NA 胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)并對(duì)截?cái)嗪蟮钠芜M(jìn)行原核表達(dá)及多克隆抗體制備。純化的tN9 蛋白具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)兔子產(chǎn)生高水平免疫反應(yīng)，所制備的特異性多克隆抗體具有較高的效價(jià)，可用于開(kāi)展NA蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究，也可用于建立H7N9 禽流感病毒血清學(xué)檢測(cè)方法，為進(jìn)一步探討NA 蛋白特性、H7N9 病毒對(duì)人和動(dòng)物的感染機(jī)制以及新型疫苗的開(kāi)發(fā)提供了條件。