廣藿香FPPS 重組蛋白表達及互作蛋白篩選分析

鐘李婷 陳秀珍 唐云 李俊仁 王小兵 劉彥婷 周璇璇 詹若挺 陳立凱

（廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心 嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學）國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣州 510006）

廣藿香（Pogostemon cablin（Blanco）Benth.）為原產(chǎn)于菲律賓本土的唇形科植物，在中國的廣東和海南有較大面積種植［1］。廣藿香的干燥地上部分，為常用的芳香化濕中藥，其味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有芳香化濁、發(fā)表解暑、和中止嘔的作用［2］。廣藿香中存在多種活性成分，其中，廣藿香醇作為一種天然的倍半萜，為廣藿香揮發(fā)油的主要成分。目前，廣藿香的倍半萜合成途徑研究較為清楚，其中，合成途徑下游的廣藿香法尼基焦磷酸酶（Fentanyl pyrophosphatase of patchouli，PatFPPS）催化生成法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP），F(xiàn)PP 又作為底物，最終催化生成萜類化合物廣藿香醇［3-4］。因此，PatFPPS 是廣藿香醇合成途徑的關(guān)鍵酶，是影響廣藿香藥效品質(zhì)的的重要調(diào)控位點。

在植物細胞中，合成酶經(jīng)常與其他蛋白互作結(jié)合，這些互作蛋白對酶的活性及功能起到重要影響，進而引起代謝物在含量和組成上的變化。另一方面，一些誘導子對萜類次生代謝具有顯著的調(diào)控，茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作為外源性植物激素，能顯著影響廣藿香醇的含量［5］，但是其具體的調(diào)節(jié)機制也未能得到解析。因此，開展廣藿香醇合成下游關(guān)鍵酶的蛋白表達，進一步篩選互作蛋白，比較外源激素誘導的差異變化，有助于進一步闡明廣藿香萜類藥效化合物的合成分子調(diào)控機制。

為快速篩選目的蛋白的互作蛋白，GST Pull-Down 是被證實可行高效的策略方法。其基本原理是將靶蛋白與GST 融合并親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，與總蛋白進行體外孵育，隨后捕獲與之相互作用的蛋白，洗脫結(jié)合物后聯(lián)合質(zhì)譜對互作蛋白進行鑒定［6］。趙文等［7］利用GST Pull-Down 聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，共篩選出31 個只在PID3 介導的抗稻瘟病反應中能與其特異結(jié)合的PID3 互作蛋白，這些互作蛋白包括受體激酶、LRR 類蛋白、ATP 酶、磷酸羧化酶和離子通道蛋白等，廣泛參與了調(diào)控細胞程序化死亡、脅迫防御反應、物質(zhì)與能量代謝和信號傳導等多個生物學過程。此外，SDR1 作為調(diào)控營養(yǎng)信號轉(zhuǎn)導和植物生長調(diào)節(jié)劑合成的關(guān)鍵酶，利用GST Pull-Down 技術(shù)亦篩選到1 個與其互作的蛋白［8］。

針對PatFPPS 的互作蛋白，國內(nèi)外至今尚未有相關(guān)報道。本研究擬利用GST Pull-Down 聯(lián)合質(zhì)譜的方法篩選鑒定PatFPPS 的互作蛋白，有助于進一步揭示廣藿香醇合成途徑酶蛋白的調(diào)節(jié)機理，以期促進廣藿香醇合成分子機制的理解，為提高廣藿香活性代謝成分產(chǎn)量及植物萜類代謝研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣藿香來源于廣州中醫(yī)藥大學藥用植物種質(zhì)資源圃。用300 μmol/L 茉莉酸甲酯對廣藿香幼苗進行處理，作為MeJA 處理組，并設(shè)置CK 對照組，對其葉片表面進行噴濕處理，8 h 后，純水沖洗并擦干，由葉柄處剪取葉片，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建 將陳立凱團隊課題組前期克隆得到的PatFPPS編碼區(qū)，進行PCR 擴增，片段以Infusion 的方法連接在pGEX-6P-1 載體上（EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切位點），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR 和菌液測序結(jié)果驗證后提取重組質(zhì)粒。

1.2.2 帶有GST 標簽的融合蛋白表達和純化 重組質(zhì)粒及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株，驗證成功的陽性菌落加入到5 mL 含羧芐5 μL 的液體LB 培養(yǎng)基中，225 r/min，37℃培養(yǎng)過夜。按照1∶100 稀釋擴大培養(yǎng)，取1 mL 菌液到100 mL 培養(yǎng)基，225 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6，分別加入IPTG 至終濃度為0.1、0.3、0.5 和1.0 mmol/L，16℃震蕩培養(yǎng)20 h。4 602×g離心5 min 收集菌體。加20 mL PBS（1 mmol/L PMSF）重懸菌體，高壓均質(zhì)機破碎3 次，每次30 s。破碎后的細胞13 523×g離心20 min，離心后取上清蛋白液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用10BP 預冷PBS 清洗GST 純化柱，其余上清蛋白液過GST 柱子，以10-15 cm/h 流出，用20BP預冷PB 洗脫雜蛋白，用提前配制的洗脫緩沖液（配制方法：0.154 g 還原性谷胱甘肽溶于50 mL 的50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脫目標蛋白。蛋白在10%的分離膠電泳，結(jié)束后用考馬斯亮藍染色液染色10 min，后用脫色液過夜脫色，更換2-3 次脫色液，直到條帶清晰。

1.2.3 廣藿香總蛋白的提取 根據(jù)試劑盒說明書，將凍存的廣藿香葉片組織轉(zhuǎn)移至5 mL 玻璃勻漿器，加入溶液A 和溶液B 混合液充分研磨后，渦旋震蕩60 s，6 010×g離心5 min，將下層含有可溶性總蛋白的水相吸出，備用。

1.2.4 驗證總蛋白不與GST 柱吸附 吸取2 mL 混懸谷胱甘肽樹脂到柱中，并用10 mL 的1×PBS（均加入蛋白酶抑制劑和DTT，保存于4℃）洗滌谷胱甘肽樹脂。加入提取的廣藿香總蛋白，使蛋白與樹脂完全融合。4℃放置60 min 后，流出的上清液作為總蛋白流出液。并用20 mL 的1×PBS 洗滌谷胱甘肽樹脂，將最后的流出液作為洗雜液。用提前配制洗脫緩沖液洗脫GST 柱，流出液作為洗脫液。將總蛋白流出液，洗雜液，洗脫液進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色。

1.2.5 驗證總蛋白不與GST 標簽吸附 將GST 標簽上清蛋白液加入到含有2 mL 混懸谷胱甘肽樹脂的平衡柱中，蛋白質(zhì)溶液進入柱子后，加入20 mL 體積的1×PBS 洗滌柱子。加入廣藿香總蛋白，使蛋白與樹脂完全融合，后續(xù)步驟按1.2.4 相應方法進行。

1.2.6 GST Pull-Down 試驗 將含有GST 融合蛋白的上清蛋白液加入到含有2 mL 混懸谷胱甘肽樹脂的平衡柱中，蛋白質(zhì)溶液進入柱子后，加入20 mL 的（冷）1×PBS 洗滌柱子。加入提取的廣藿香總蛋白，使蛋白與樹脂完全融合，4℃放置60 min 后。用20 mL的谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫GST 標簽融合蛋白和互作蛋白的復合蛋白，分別通過SDS-PAGE 分析所有樣品以確認靶蛋白的存在。將膠條切下，進行質(zhì)譜鑒定。

1.2.7 質(zhì)譜檢測和鑒定方法 膠條經(jīng)水洗、脫色、還原等過程進行蛋白酶解成肽段，用樣品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，充分振蕩渦旋，16 363×g，4℃離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至上樣管中，進行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：300 μm i.d. × 5 mm，packed with AccLaim PepMap RSLC C18，5 μm，100 A，nanoViper，流動相A：0.1%甲酸，流動相B：0.1%甲酸，80%乙腈，流速：300 nL/min，每個組分分析時間：60 min。B 流動相在0-5 min，5%；5-50 min，5%-90%；50-55 min，90%；55-60 min，90%-5%。

分離后的肽段使用質(zhì)譜儀進行在線檢測，分析其氨基酸序列。利用MASCOT 軟件在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索，檢索參數(shù)如下：固定修飾（Fixed modifications）：Carbamidomethyl（C）、可變修飾（Variable modifications）：Oxidation（M）、酶（Enzyme）：Trypsin、遺漏酶切位點（Maximum missed cleavages）：2、一級質(zhì)譜誤差（Peptide mass tolerance）：20 ppm、二級質(zhì)譜誤差（Fragment Mass Tolerance）：0.6 Da、肽段/碎片離子質(zhì)量數(shù)（Mass values）：Monoisotopic（單同位素）、顯著性閾值（Significance threshold）：0.05。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的誘導表達

通過不同濃度IPTG 誘導，并提取和純化蛋白。結(jié)果（圖1）表明，純化后的蛋白條帶清晰且單一，與預測的PatFPPS（66 kD）蛋白大小一致，說明該原核表達體系適用于PatFPPS 的表達，純化效果較好。

圖1 不同濃度IPTG 誘導的細胞破碎上清蛋白及純化后的GST-FPPS 融合蛋白

2.2 總蛋白不與GST柱吸附驗證分析

利用廣藿香葉片總蛋白驗證與GST 柱吸附情況（圖2）發(fā)現(xiàn)，CK 組和MeJA 組總蛋白經(jīng)純化柱后的溶液含有大部分蛋白，PBS 清洗后，可將少部分殘留蛋白洗脫，而洗脫液中未發(fā)現(xiàn)蛋白條帶，表明總蛋白不與GST 柱相吸附。

圖2 驗證總蛋白不與GST 柱吸附的凝膠電泳圖

2.3 總蛋白不與GST標簽吸附驗證分析

進一步驗證總蛋白是否與GST 標簽結(jié)合（圖3）發(fā)現(xiàn)，CK 組和MeJA 組總蛋白過吸附有GST 標簽的純化柱后的溶液含有大部分總蛋白，經(jīng)PBS 清洗后，溶液中未發(fā)現(xiàn)有條帶。而經(jīng)過洗脫液洗脫后，能明顯看到與GST 標簽（26 kD）大小一致條帶，且未有其他雜條帶，表明總蛋白不與GST 標簽吸附。

圖3 驗證總蛋白不與GST 標簽吸附的凝膠電泳圖

2.4 利用GST Pull-Down聯(lián)合質(zhì)譜篩選互作蛋白

利用GST Pull-Down 技術(shù)對PatFPPS 互作蛋白進行篩選（圖4）。PatFPPS 蛋白純化后的純度較高，并且CK 組及MeJA 組葉片提取的總蛋白在40 kD 左右較為集中。將篩選得到的CK 組及MeJA 組的互作蛋白膠條切下進行LC-MS/MS 鑒定，獲得PatFPPS的候選互作蛋白信息。

圖4 利用GST Pull-Down 技術(shù)得到的PatFPPS 互作蛋白凝膠電泳圖

利用LC-MS/MS 質(zhì)譜技術(shù)鑒定分析互作蛋白序列，通過篩選質(zhì)譜中鑒定到的肽段匹配數(shù)≥2 或者1（總肽段數(shù)等于1）的蛋白，分別得到表1 所示的候選蛋白。

在PatFPPS Pull-Down 鑒 定 結(jié) 果 中，CK 組和MeJA 組中共同鑒定得到的候選蛋白分別有14個，包括AKM21345.1（核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶）和ANO53386.1（甘油醛-3-磷酸脫氫酶A）等具有酶活特性，此外，還篩選得到一些floricaula（AIC82084.1）、肌動蛋白（APU50940.1）和微管蛋白（AVW82638.1）等。而MeJA 處理后，還鑒定得到熱休克蛋白（AKT44364.1）、細胞色素P450（AJD25213.1）、MYB 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（AGN52117.1）和堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（AKN09649.1）等。

3 討論

廣藿香作為具有重要經(jīng)濟價值的藥用植物，作為大宗常用中藥材在臨床廣泛應用，此外還在香料工業(yè)等用作原料制造各種化妝品和口腔衛(wèi)生產(chǎn)品［9］，工業(yè)價值顯著。而廣藿香醇、廣藿香酮作為主要的活性藥用組成成分，在廣藿香揮發(fā)油中占60%以上［10］，并且廣藿香醇含量已經(jīng)明確作為藥典中廣藿香質(zhì)量標準的指標。探明廣藿香主要有效成分的合成機制，為廣藿香萜類代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)，同時也為植物揮發(fā)性萜類代謝研究提供有價值的參考。

目前，未有針對廣藿香醇合成途徑關(guān)鍵酶PatFPPS 的互作蛋白研究報道，僅局限于酶基因的分離克隆、酶學功能和代謝工程應用等?；プ鞯鞍椎暮Y選主要有酵母雙雜交和GST Pull-Down 技術(shù)，而利用該技術(shù)，無需在構(gòu)建基因文庫的基礎(chǔ)上實現(xiàn)較高通量的分子篩選。前人也通過此技術(shù)從水稻中分離得到一個抗稻瘟病相關(guān)蛋白的新互作蛋白，該蛋白可以降解稻瘟病病菌細胞壁從而產(chǎn)生抗性［11］。

利用GST Pull-Down 技術(shù)，PatFPPS 篩選了多個候選互作單白，其中，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶、floricaula、肌動蛋白和微管蛋白在CK 組及MeJA組均檢測到。Floricaula（FLO/LFY）是一種花分生組織特異性表達的同源異型基因，分別自金魚草（Antirrhinum majus）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分離得到，控制頂端分生組織向花分生組織轉(zhuǎn)變，同時控制花器官發(fā)育ABC 模型中后續(xù)同源異型基因的表達［12-13］。而肌動蛋白作為細胞的組成結(jié)構(gòu)成分，在許多基本細胞過程中也起作用，如繁殖、發(fā)育和對非生物和生物刺激的響應［14］。結(jié)果中，篩選得到的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶作為羧化酶參與光合作用，并與植物的抗逆有關(guān)［15］。研究表明，植物激素脫落酸（ABA）能與核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶結(jié)合，從而產(chǎn)生弱抑制作用［16］。LeNCED1 作為編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）小亞基的啟動子基因，提高LeNCED1 的表達，可以產(chǎn)生具有更高水平的ABA 積累的植物，并能影響萜類化合物葉綠素和類胡蘿卜素含量［17］。而本研究表明MeJA 誘導后，鑒別得到較多核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，但是否有影響作用尚未研究。

表1 LC-MS/MS 鑒定PatFPPS GST Pull-Down 候選互作蛋白

MeJA 誘導后，還鑒別獲得到1 個堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（bHLH）。其結(jié)構(gòu)域大概包含了60 個氨基酸，由一個堿性氨基酸區(qū)和一個螺旋-環(huán)-螺旋（HLH region）區(qū)組成，為一個轉(zhuǎn)錄因子特有的結(jié)構(gòu)域。bHLH 不僅普遍參與包括光形態(tài)發(fā)生，光信號轉(zhuǎn)導和次級代謝等植物生長和代謝過程，也在植物對脅迫的反應中起重要作用［18］。許多研究證明，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與JA 誘導的防御信號調(diào)控，還響應JA 信號在萜類合成中的調(diào)控作用［19-20］。這些蛋白都具有多種生物學功能，可能響應JA 信號參與萜類合成，但其作用機制還需進一步的研究。

綜上所述，這些篩選的互作蛋白可能與PatFPPS互作來調(diào)節(jié)萜類通路的下游關(guān)鍵酶從而影響萜類化合物的合成，并可能與MeJA 的誘導調(diào)控有一定關(guān)聯(lián)。下一步可繼續(xù)利用其他方法驗證這些候選的互作蛋白，并且進行功能研究，深入地了解其調(diào)節(jié)機理。

4 結(jié)論

成功表達并純化得到PatFPPS 大量可溶性重組蛋白，經(jīng)鑒定，獲得多個候選互作蛋白，包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶、floricaula、肌動蛋白、堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子等蛋白。