基于液相色譜的鎮(zhèn)江香醋及其相關(guān)產(chǎn)品中四甲基吡嗪的分析方法

紀(jì)鳳娣，魯 緋，陶匯源，穆曉婷，李 東，夏 蓉,*

（1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

傳統(tǒng)的中國醋，也叫谷物醋，是中國人日常生活中重要的調(diào)味料，有3 000多年的悠久歷史。近十多年來，有報道稱醋有多種生理作用，如調(diào)節(jié)血糖和血壓、助消化、刺激食欲和促進鈣的吸收[1]。中國有四大著名的中式谷物醋，分別為山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川麩皮醋和福建紅曲醋。其中，鎮(zhèn)江香醋以糯米為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而成，以其獨特的風(fēng)味、悠久的生產(chǎn)歷史、豐富的產(chǎn)量和獨特的發(fā)酵工藝而備受推崇[2]。

四甲基吡嗪（又名川芎嗪）（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP），是中藥川芎中一種重要的生物活性物質(zhì)[3]。TMP具有藥理作用，被認(rèn)為是治療心腦血管疾病的有效藥物[4]。研究證明TMP也是醋等許多發(fā)酵食品和飲料中檢測到的一種主要的吡嗪類化合物[4]，其主要由釀造過程中的微生物代謝和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，是一種健康風(fēng)味成分，這是食醋的保健作用的依據(jù)。此外，TMP具有類似于炒堅果和烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對其他香味有顯著的烘托和疊加作用，通常也被認(rèn)為是一種安全的物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，作為呈堅果味和烤面包口味的食品配料成分[5-6]。

由于TMP是在食醋發(fā)酵過程中形成的化合物，因此可作為發(fā)酵過程的一個重要指標(biāo)，是優(yōu)化整個食醋生產(chǎn)的有效參數(shù)之一。近年來，人們對TMP的研究，以及對其他揮發(fā)性組分的研究，傳統(tǒng)上都是通過溶劑萃取[7-9]、蒸汽蒸餾[7-9]、超臨界流體萃取[10]或頂空固相微萃取[7,9,11-13]以及隨后的氣相色譜[14-15]或氣相色譜-質(zhì)譜[9-13,16-18]分析進行。液相色譜法[19-23]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[24-27]在TMP的分析測定中也有應(yīng)用，主要涉及中藥川芎及其制品[17-21]、生物樣品[20-22,24-27]和食品等[23,28-29]。相比液相色譜，在采用氣相色譜的分析測定中，樣品的前處理過程比較繁瑣，重復(fù)性相對較差，因此，對TMP的分析采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法，特別是超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法具有一定的優(yōu)勢。

本研究建立測定鎮(zhèn)江香醋及其相關(guān)產(chǎn)品中TMP含量的UPLC和HPLC分析方法，可以作為監(jiān)控食醋生產(chǎn)過程和相關(guān)產(chǎn)品中TMP參數(shù)的技術(shù)手段和理論依據(jù)，對指導(dǎo)生產(chǎn)和消費具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江香醋及相關(guān)產(chǎn)品由江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司提供。

四甲基吡嗪（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級） 美國Fisher Chemical公司；三氟乙酸（色譜級） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇、乙酸（均為分析純） 北京化工廠；氫氧化鈉（分析純） 西隴化工股份有限公司；實驗所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Accucore Vanquish系列UPLC儀（含高壓二元體系泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD）和Chromeleon 7.2 SR4色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)等）美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；FE28 pH計瑞士Mettler Toledo公司；CF16RX高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；MX-F渦旋混合器 北京聯(lián)合科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取香醋等樣品1 g，加水至5 mL，渦旋混勻后置于冰浴中冷卻，用氫氧化鈉固體顆粒調(diào)節(jié)其pH值為8.5左右，加入提取液（5%乙酸＋15%水＋80%乙醇）25 mL，混勻后在25～30 ℃水浴中超聲提取30 min；10 000 r/min離心10 min，用滴管將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，室溫下用上述提取液定容至刻度，混勻后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。

精密稱取TMP標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL作為儲備液，于-20 ℃避光保存，臨用前進行系列稀釋。

1.3.2 色譜條件

UPLC條件：Accucore Vanquish C18＋色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）；柱溫40 ℃；檢測波長297 nm；流動相：甲醇和pH值為2.4的酸溶液（含1%的乙酸和0.05%的三氟乙酸）（25∶75，V/V）；流速0.3 mL/min；進樣體積5 μL。根據(jù)保留時間（配合紫外光譜）定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

H P L C條件：Z O R B A X S B-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；檢測波長297 nm；流動相：甲醇和pH值為2.4的酸溶液（含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）（25∶75，V/V）；流速0.8 mL/min；進樣體積5 μL。根據(jù)保留時間（配合紫外光譜）定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取一定量的TMP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL和50 μg/mL的TMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.3.2節(jié)色譜條件進行分析，以TMP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，進行線性回歸分析。相關(guān)系數(shù)R2大于0.999時進行樣品定量分析。

1.3.4 加標(biāo)樣品回收率的測定

準(zhǔn)確稱取1 g不含TMP的白醋樣品18 份，1～6號樣品加入100 μg的TMP，7～12號樣品加入200 μg的TMP，13～18號樣品加入1 000 μg的TMP，按照1.3.1節(jié)方法進行樣品的預(yù)處理，再按照1.3.2節(jié)色譜條件進行測定，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

如圖1所示，隨著混合溶劑中甲醇含量的減小和酸性溶液的增加，溶液pH值降低，TMP的最大吸收波長由282.32 nm和294.17 nm紅移至301.39 nm，而在乙腈和酸性溶液混合溶劑中，TMP在波長300 nm左右有一個最大吸收峰。Li Junbo等[30]報道在pH 1.5的HCl介質(zhì)中，TMP與12-鎢磷酸形成物質(zhì)的量比為3∶1的離子締合物，導(dǎo)致雙波長共振瑞利散射、二級散射和倍頻散射光譜顯著增強，并形成新的散射光譜。因此，推斷在不同pH值的酸性溶液中，TMP與酸性物質(zhì)的作用不同導(dǎo)致分子光譜的差異。結(jié)合參考文獻比較TMP在波長300、297[23]、295 nm[28]和278 nm[29]等幾個不同波長的色譜響應(yīng)，選擇采用297 nm作為檢測波長。

圖1 不同溶劑中TMP的紫外-可見光譜圖Fig. 1 Ultraviolet-visible spectra of tetramethylpyrazine in different solvents

2.2 流動相和色譜柱的選擇

考察不同流動相、pH值和流動相配比對TMP色譜行為的影響，同時對在UPLC法和在HPLC法中使用的色譜柱進行選擇。比較甲醇和水流動相、乙腈和水流動相、甲醇和乙酸溶液流動相、乙腈和乙酸溶液流動相以及甲醇＋乙酸和三氟乙酸溶液對實際樣品的分離效果，選擇甲醇＋乙酸和三氟乙酸溶液作為流動相，通過優(yōu)化兩相配比和調(diào)節(jié)pH值，確定以25%甲醇和75%酸性溶液（pH 2.4，含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）作為流動相。

比較UPLC法中，TMP在Accucore Vanquish C18＋色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分析柱上的色譜行為，考察2 種分離柱對實際樣品的分離效果，選擇Accucore Vanquish C18＋色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）作為UPLC法測定TMP的分離柱。

比較HPLC法中，TMP在ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜行為，考察2 種分離柱對實際樣品的分離效果，選擇ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為HPLC法測定TMP的分離柱。

2.3 提取方法的選擇

鎮(zhèn)江香醋中除了較高含量的乙酸外，還含有丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸以及沒食子酸、阿魏酸、咖啡?？鼘幩?、原兒茶酸和香草酸等酚酸類化合物[31-32]。TMP是一個含有1,4-二氮雜苯母環(huán)的化合物，分子結(jié)構(gòu)中有2 個電負(fù)性較大的N元素。推斷在酸性條件下，TMP在香醋樣品中可以和這些酸性或酚酸化合物通過超分子作用力如氫鍵形成不規(guī)則的聚集物或者締合物。因此，在提取香醋中TMP時使其游離出來，再以酸性溶劑提取會提高提取效率。實驗考察不同pH值條件下的提取效率，考察色譜峰峰面積與取樣量的比值，結(jié)果表明提取效果在樣品的pH 8.5～8.8時較好，考察酸性提取液（5%乙酸＋15%水＋80%乙醇）和提取液（20%水＋80%乙醇）對TMP的提取效果，最終選擇在樣品pH值為8.5條件下，以體積比為5∶15∶80的乙酸-水-乙醇作為提取液。

考察超聲提取時間對提取效率的影響，平行稱取同一樣品3 份，按照上述方法處理后再分別超聲處理20、30 min和40 min，計算峰面積與取樣量的比值，結(jié)果表明超聲提取時間為30 min和40 min的提取效果無顯著差異，而超聲提取時間為20 min的提取效果稍差。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇超聲處理時間為30 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和精密度結(jié)果

圖2 TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 2 UPLC and HPLC chromatograms of TMP standard solution

分別將不同質(zhì)量濃度的TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液按UPLC和HPLC色譜條件進行測定，如圖2所示。UPLC法分離TMP的保留時間為1.6 min左右，HPLC法分離TMP的保留時間為9.7 min左右。由表1可知，TMP質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的相關(guān)性。以10 μg/mL的TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進樣8 次進行精密度實驗，TMP測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），分別為0.018%（UPLC法）和0.035%（HPLC法），均小于3%，表明精密度滿足方法學(xué)定量的要求。

表1 TMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍Table 1 Linear ranges of standard curves of UPLC and HPLC for TMP

2.5 方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性實驗結(jié)果

選擇不含TMP的白醋樣品進行加標(biāo)回收實驗。在上述優(yōu)化后的實驗條件下，分別對100、200 μg和1 000 μg添加水平的樣品進行測定，結(jié)果如表2、圖3所示。平均回收率在87.9%以上。

表2 回收率實驗結(jié)果Table 2 Results of recovery tests

圖3 白醋樣品和加標(biāo)樣品色譜圖Fig. 3 UPLC and HPLC chromatograms of unspiked and spiked samples

2.6 方法的檢出限和定量限結(jié)果

根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》對檢出限和定量限的規(guī)定，以3 倍的信噪比確定方法的檢出限，以10 倍的信噪比確定方法的定量限。UPLC法測定TMP的檢出限為0.000 3 g/kg，定量限為0.001 g/kg，HPLC法測定TMP的檢出限為0.008 g/kg，定量限為0.025 g/kg。結(jié)果證明，相比HPLC法，UPLC法具有更高的檢測靈敏度。

2.7 樣品中TMP的含量測定結(jié)果

鎮(zhèn)江香醋、鎮(zhèn)江陳醋和醋粉中TPM含量分別為0.147、0.294 g/kg和0.250 g/kg，而白醋中不含TMP，結(jié)果如表3、圖4所示。

表3 樣品中TMP含量Table 3 TMP contents in real samples

圖4 鎮(zhèn)江香醋樣品的色譜圖Fig. 4 UPLC and HPLC chromatograms of Zhenjiang vinegar sample

3 結(jié) 論

建立適用于食醋中TMP的分析方法對于食醋及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和市場監(jiān)管是極其重要的。本研究建立測定鎮(zhèn)江香醋及其相關(guān)產(chǎn)品中TMP含量測定的UPLC法和HPLC法。采用酸性乙醇溶液提取TMP，采用C18色譜柱分離，柱溫40 ℃，以25%甲醇和75%酸性溶液（pH 2.4，含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）作為流動相，在UPLC法中流動相流速0.3 mL/min，在HPLC法中流動相流速0.8 mL/min，紫外檢測器297 nm進行檢測，2 種方法重復(fù)測定結(jié)果的RSD均小于3%，回收率在87.9%以上，UPLC法TMP的檢出限為0.000 3 g/kg，定量限為0.001 g/kg，HPLC法TMP的檢出限為0.008 g/kg，定量限為0.025 g/kg。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，2 種分析方法準(zhǔn)確性好，均適用于食醋及其相關(guān)制品中TMP的含量測定。UPLC法的靈敏度高，分析速度快，HPLC法適用范圍更廣泛，可以作為有效控制食醋及相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)，具有一定的理論意義和應(yīng)用價值。