基于電子鼻與GC-MS 對不同格瓦斯揮發(fā)性風(fēng)味成分差異分析

唐紅梅，李玉斌，王浩文，鄧 靜，劉 陽，劉乙志，劉 建，吳華昌,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.中國科學(xué)院成都分院，四川 成都 610041；3.四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610100；4.四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川 成都 610100）

格瓦斯是東歐國家傳統(tǒng)的非酒精軟飲料，其乙醇體積分?jǐn)?shù)低于1.2%[1]，主要由黑麥或干麥面包自然發(fā)酵而成[2]，具有醇香和面包香。格瓦斯采用有利的微生物組合（乳酸菌-酵母菌）發(fā)酵，所以富含豐富的B族維生素、乳酸、二氧化碳[3]。自然發(fā)酵的格瓦斯能量值比典型非酒精飲料低約1/2，對人體的影響與開菲爾相似[2]，具有開胃、助消化等功效。近年來，隨著消費(fèi)者對營養(yǎng)、功能性食品興趣的日益增加[4]，具有良好滋味與功能性[5]的格瓦斯具有巨大的開發(fā)前景與研究意義。但目前格瓦斯的研究多集中在發(fā)酵[6]、生產(chǎn)[7]、貯藏工藝[8]階段，對格瓦斯風(fēng)味研究較少，而且鮮見有對不同格瓦斯風(fēng)味物質(zhì)的差異分析。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）能檢測不同樣品中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，但對不同樣品整體風(fēng)味差異分析較繁瑣，而電子鼻能直接從整體上對樣品風(fēng)味進(jìn)行分析，兩者配合有利于從局部和整體上詳細(xì)地研究食品的風(fēng)味[9]。目前，電子鼻在食品應(yīng)用方面已有諸多研究。張娟等[10]利用電子鼻技術(shù)并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析方法，對牛肉中豬肉摻假進(jìn)行識別。易宇文等[11]以東坡肘子為對象，利用感官評價和電子鼻技術(shù)對其風(fēng)味特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者分析結(jié)果具有良好的一致性。Wang Min等[12]開發(fā)了一種小型電子鼻系統(tǒng)，可以實(shí)時地對冰箱食品的新鮮度進(jìn)行評估。Wei Xiaobao等[13]對比了GC-MS與電子鼻技術(shù)對摻假牡丹籽油的識別能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電子鼻結(jié)合線性判別分析更適用于牡丹籽油摻假的檢測。電子鼻結(jié)合GC-MS的技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品不同品種、品質(zhì)及貯存條件揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究，包括野生真菌[14]、中藥材[15]、白酒[16]、肉類[17]、水果[18]、蔬菜[19]等，這些研究很好地證明電子鼻結(jié)合GC-MS在鑒定食品風(fēng)味差異上具有良好的相關(guān)性與互補(bǔ)性。

本實(shí)驗(yàn)以電子鼻、GC-MS為主要技術(shù)手段，結(jié)合主成分分析，對自制青稞格瓦斯以及市售4 種格瓦斯的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行差異鑒定，以期為格瓦斯風(fēng)味的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自制青稞格瓦斯（Z），按文獻(xiàn)[20]制作；娃哈哈格瓦斯（W） 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；秋林格瓦斯（Q）天津秋林格瓦斯食品科技有限責(zé)任公司；巴巴耶夫格瓦斯（B） 俄羅斯紅色十月食品集團(tuán)；歐奇科娃（O）莫斯科歐奇可娃封閉式股份公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FOX 4000型電子鼻（帶Alpha SOFT V12軟件）法國Alpha MOS公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、HP 5890/5975 GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻測定[21]

樣品前處理：將5 種樣品用超聲波脫氣處理30 min，排除二氧化碳。脫氣完成后，每個樣品取5 份進(jìn)行平行測定，每份取1 mL，置于10 mL玻璃瓶中，頂空加熱5 min（加熱溫度為70 ℃），進(jìn)樣針吸取0.5 mL頂空氣體進(jìn)樣分析。

檢測條件：載氣（合成干燥空氣）流速150 mL/min，數(shù)據(jù)采集時間120 s，延滯時間300 s。檢測結(jié)束后，以18 個傳感器的最大響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同傳感器對應(yīng)不同的敏感度物質(zhì)[22]。

1.3.2 頂空固相微萃取-GC-MS測定

頂空固相微萃取條件：準(zhǔn)確量取5 種市售格瓦斯樣品各8.0 mL及0.5 g氯化鈉于15 mL樣品瓶中，將老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入樣品瓶頂空部分，70 ℃平衡30 min、吸附15 min后，取出萃取頭并插入GC進(jìn)樣口，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)，解吸3 min。

GC-MS分析條件：HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量2 μL；進(jìn)樣采用不分流方式，載氣流速1.3 mL/min；升溫程序：初溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升到200 ℃，保持5 min，以25 ℃/min升到250 ℃，保持5 min。

由計算機(jī)質(zhì)譜系統(tǒng)NSIT與RTLPEST檢索未知化合物，匹配度大于700（最大1 000）且可能性大于40%的結(jié)果將予以報告，各成分相對含量的計算采用面積歸一化法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，Origin 9.0進(jìn)行相關(guān)圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻分析結(jié)果

由圖1可知，格瓦斯Z、O、B、Q具有相同的指紋圖譜，而格瓦斯W風(fēng)味強(qiáng)度較弱，響應(yīng)值在0～0.5之間，這可能是因?yàn)榍八恼呤侨樗峋c酵母菌共同發(fā)酵，生成酯類、醇類及有機(jī)酸類等易揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較多，而格瓦斯W是多種乳酸菌發(fā)酵，產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類較單一，主要是有機(jī)酸類。其中，格瓦斯W在傳感器LY2/G與其他格瓦斯差異最大，該傳感器主要對氨、胺類、碳氧類化合物敏感，其次是對乙醇及燃燒產(chǎn)物敏感傳感器P30/2與對乙醇、氨水、胺類化合物傳感器PA/2。格瓦斯Z、O、B、Q在傳感器LY2/G、P30/2、P30/1、PA/2上均表現(xiàn)出較高響應(yīng)值，這些傳感器主要對碳?xì)浠衔?、氨、胺類、乙醇敏感?/p>

圖1 5 種格瓦斯電子鼻指紋圖譜Fig. 1 Electronic nose fingerprints of five kvasses

2.2 GC-MS分析結(jié)果

圖2 5 種格瓦斯的GC-MS總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of five kvasses analyzed by GC-MS

由圖2、表1可知，格瓦斯的風(fēng)味主要由醇類、酯類、酸類、醛類物質(zhì)組成，4 種揮發(fā)性風(fēng)味成分總相對含量在73.12%～100%之間。其中，格瓦斯W風(fēng)味物質(zhì)以酯類物質(zhì)為主，相對含量為34.37%，其次是醇類及酸類物質(zhì)，醛類物質(zhì)相對含量最少，僅為0.76%，這可能與多種乳酸菌共同發(fā)酵有關(guān)；格瓦斯Z、Q、B、O風(fēng)味物質(zhì)以醇類為主，相對含量分別為82.41%、51.49%、81.04%、67.15%，其次是酸類物質(zhì)，酯類及醛類物質(zhì)含量均較低，可能是乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵所致，這與艾乃吐拉·馬合木提等[7]在研究乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵的紅棗格瓦斯風(fēng)味成分所得結(jié)論一致。

表1 5 種格瓦斯揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 1 Volatile flavor components identified in five kvasses

續(xù)表1

5 種格瓦斯中均檢測出3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯。其中，3-甲基-1-丁醇在格瓦斯Z、W、Q、B、O相對含量分別為19.38%、2.39%、15.87%、22.43%、21.95%，3-甲基-1-丁醇又稱異戊醇，該醇是雜油醇或高級醇的主要成分，具有苦杏仁味，是意大利Grappa的主要香氣成分[23]，在葡萄酒中也有檢出[24]。苯乙醇在格瓦斯Z、W、Q、B、O相對含量分別為13.58%、15.01%、10.25%、23.12%、3.32%，其具有玫瑰與丁香花香氣，有先苦后甜的桃子樣味道[25]，其來源有兩條途徑：一部分來自于原料，另一部分來自于L-苯丙氨酸經(jīng)釀酒酵母中脫氨酶、脫羧酶、還原酶作用產(chǎn)生[26]，在發(fā)酵、熟化過程中可與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)或被氧化為醛類物質(zhì)，導(dǎo)致含量降低。乙酸乙酯在格瓦斯Z、W、Q、B、O相對含量分別為0.57%、31.34%、0.78%、0.36%、2.35%，其呈現(xiàn)水果香、花香，在葡萄酒、啤酒、白酒中均有檢出，在白酒中含量最高[27]，該物質(zhì)在發(fā)酵中主要由醇與酸發(fā)生酯化反應(yīng)產(chǎn)生，貯存中則主要發(fā)生支鏈酯的酯化反應(yīng)和高濃度直鏈酯的水解反應(yīng)。

格瓦斯W共檢測出13 種物質(zhì)，其揮發(fā)性成分以乙酸乙酯、山梨酸、苯乙醇、2-乙?；秽珵橹?，相對含量分別為31.34%、18.49%、15.01%、13.95%，其中2-乙?；秽哂刑鹣闩c焦糖香，是咖啡、土豆的風(fēng)味成分之一，但其閾值高達(dá)1 000 μg/L[26]，山梨酸為飲料中的防腐劑。格瓦斯Z檢測出16 種物質(zhì)，主要揮發(fā)性成分為乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、辛酸，相對含量分別為45.93%、19.38%、13.58%、9.40%，其中辛酸具有山羊臭與奶酪香[28-29]，但閾值極高。格瓦斯Q共檢測出

17 種物質(zhì)，主要揮發(fā)性風(fēng)味成分為乙醇、山梨酸、3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙醇，相對含量分別為24.65%、22.28%、15.87%、13.23%、10.25%。格瓦斯B共檢測出16 種物質(zhì)，主要揮發(fā)性風(fēng)味成分為乙醇、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇，相對含量分別為35.24%、23.12%、22.43%。格瓦斯O共檢測出16 種物質(zhì)，主要揮發(fā)性風(fēng)味成分為乙醇、3-甲基-1-丁醇，相對含量分別為41.08%、21.95%。

2.3 電子鼻與GC-MS主成分分析

2.3.1 電子鼻主成分分析結(jié)果

圖3 5 種格瓦斯電子鼻主成分分析Fig. 3 PCA plot of electronic nose data for five kvasses

利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對5 種格瓦斯電子鼻最大響應(yīng)值及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成進(jìn)行主成分分析，如圖3所示，5 種格瓦斯對18 個傳感器的電子鼻最大響應(yīng)值進(jìn)行降維處理后，得到2 個主成分，第1主成分方差貢獻(xiàn)率為96.88%，第2主成分方差貢獻(xiàn)率為1.92%，累計方差貢獻(xiàn)率為98.8%，主成分1、2包含樣品的大部分信息。由圖3可知，5 種格瓦斯以風(fēng)味不同區(qū)分開，沿著第1主成分方向，格瓦斯Z、O、B、Q較為靠近，而格瓦斯W距其他4 種較遠(yuǎn)，即風(fēng)味上存在差異，這種差異由18 個傳感器共同決定，這與圖1所得結(jié)論一致。沿著第2主成分方向，格瓦斯Z、O、B、Q得以區(qū)分，且Z距離O、B較近與Q距離較遠(yuǎn)，這種差異主要由LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、P30/1決定。由電子鼻主成分分析結(jié)果可知：從5 種格瓦斯整體特征風(fēng)味層面分析，格瓦斯Z與格瓦斯W、Q風(fēng)味差異較大，與格瓦斯O、B風(fēng)味更為接近。

2.3.2 GC-MS主成分分析結(jié)果

對5 種格瓦斯GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理后，得到3 個主成分，第1主成分方差貢獻(xiàn)率為34.59%，第2主成分方差貢獻(xiàn)率為28.20%，第3主成分方差貢獻(xiàn)率為21.35%，累計方差貢獻(xiàn)率為84.14%，3 個主成分基本上包含樣品的大部分信息。由表2可知，乙醇、山梨酸、苯乙醛在第1主成分具有較大載荷，分別為0.25、-0.27、0.26，乙酸苯乙酯在第2主成分具有較大載荷，為0.25，苯甲醛在第3主成分具有較大載荷，為0.25。說明乙醇、山梨酸、苯乙醛、乙酸苯乙酯、苯甲醛對格瓦斯風(fēng)味差異區(qū)分有重要影響。

表2 GC-MS特征向量矩陣Table 2 Eigenvector matrix of first three principal components

由圖4可知，5 種格瓦斯以風(fēng)味不同區(qū)分開，沿著第1主成分方向，格瓦斯W、Q較為靠近，格瓦斯O、B、Z接近，即國內(nèi)、國外格瓦斯在乙醇、山梨酸、苯乙醛3 種風(fēng)味物質(zhì)上存在差異。國內(nèi)格瓦斯W、Q乙醇相對含量在35%～45%之間，且含有18%～22%的山梨酸，不含有苯乙醛，該物質(zhì)具有風(fēng)信子香味[30]；國外格瓦斯O、B以及格瓦斯Z，乙醇相對含量在0%～25%之間，且含有0.74%～1.49%的苯乙醛，不含山梨酸。沿著第2主成分方向，格瓦斯B、W、Q接近，其他2 種較為分散，即在乙酸苯乙酯上存在差異，該物質(zhì)具有花香和蜜香[31]，在B、W相對含量為0.6%，Z中相對含量在1.67%左右，其他2 種格瓦斯不含該物質(zhì)。沿著第3主成分方向，格瓦斯O、B、Z接近，其他2 種較為分散，即在苯甲醛上存在差異，該物質(zhì)具有苦杏仁味[32]，在O、B、Z中相對含量在0.75%～3.14%之間，Q中相對含量為13.23%，W中不含該物質(zhì)。綜上所述，格瓦斯B、O、Z風(fēng)味接近，W與Q較為分散，這種差異可能是由乙醇、山梨酸、苯乙醛、乙酸苯乙酯、苯甲醛相對含量不同所致。

圖4 5 種格瓦斯GC-MS主成分分析Fig. 4 PCA plot of GC-MS results for five kvasses

3 結(jié) 論

采用電子鼻，結(jié)合主成分分析，對青稞格瓦斯（Z）、俄羅斯格瓦斯（O、B）、國內(nèi)格瓦斯（Q、W）的揮發(fā)性風(fēng)味成分差異分析可知：從5 種格瓦斯整體特征風(fēng)味層面分析，格瓦斯Z與格瓦斯Q、W風(fēng)味差異較大，與格瓦斯O、B風(fēng)味更為接近。但格瓦斯Z與格瓦斯O、B間存在微小差異，主要因LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、P30/1響應(yīng)值不同，即乙醇、氨、碳?xì)浠衔锖坎煌隆?/p>

利用頂空固相微萃取進(jìn)樣，經(jīng)GC-MS進(jìn)一步分析可知：格瓦斯Z與格瓦斯O、B風(fēng)味更為接近，但與格瓦斯Q、W有較大差異，這一結(jié)果與電子鼻分析結(jié)果一致。乙醇、山梨酸、苯乙醛、乙酸苯乙酯、苯甲醛等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在5 種格瓦斯中的相對含量不同，可能會導(dǎo)致風(fēng)味呈現(xiàn)差異。本實(shí)驗(yàn)從局部和整體對5 種格瓦斯的風(fēng)味進(jìn)行差異分析，為不同格瓦斯的風(fēng)味分析提供參考。