基于UPLC-QTOF-MS/MS 技術(shù)分析荷葉乙酸乙酯相中主要化學(xué)成分

張 露，王紅紅，楊斯涵，涂宗財(cái),2,*，李 軍，陳 娟，黃玉珠

（1.江西師范大學(xué) 國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330022；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）是蓮屬多年生根莖類水生植物，在中國(guó)、印度、韓國(guó)、泰國(guó)、日本等亞洲國(guó)家被廣泛種植。它不僅是一種觀賞植物，也是廣受歡迎的藥食兩用資源，藥典記載，荷葉是治療腹瀉、血尿、咯血、炎癥和發(fā)熱等疾病的重要中藥[1]。藥理學(xué)研究證明，荷葉提取物及其化學(xué)成分具有一系列保健效果，如降血糖[2]和降血脂[3]、抗癌[4]、抗肥胖癥[5]、抗真菌[6]、鎮(zhèn)靜安神和抗焦慮[7]、抗氧化等作用[8]。目前已在荷葉中發(fā)現(xiàn)的活性成分主要有多糖[9]、多酚[4]、黃酮[2]、生物堿[7]、有機(jī)酸[10]和megastigmanes[5]。但每年蓮子收獲后，除少部分用作食品烹飪、食品加工和保健品加工的原料外，大部分荷葉仍作為廢棄物丟棄，沒(méi)有得到有效的利用。

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是指大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類及核酸等的游離氨基與還原糖的醛基通過(guò)糖基化反應(yīng)生成的一大類穩(wěn)定化合物。人體中AGEs的積累在動(dòng)脈粥樣硬化、尿毒癥、阿爾茨海默病、白內(nèi)障、糖尿病并發(fā)癥等慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[11-12]。高蛋白、高油脂和高糖食品在熱加工和貯存過(guò)程中容易形成AGEs[13-14]。Jung等[15]研究發(fā)現(xiàn)，荷葉提取物能有效抑制牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-葡萄糖體系糖基化過(guò)程中AGEs的形成，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，荷葉提取物及其乙酸乙酯相通過(guò)抑制BSA聚集和構(gòu)象展開可有效抑制AGEs的形成[16]，但其具體活性成分仍有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）技術(shù)對(duì)荷葉乙酸乙酯相中的主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，以期為荷葉資源在食品加工和功能性食品開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮荷葉采自江西省贛州市石城縣；乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙醇、乙酸乙酯（均為分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UPLC LC30系統(tǒng)、Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×75 mm，2 μm） 日本Shimadzu公司；Hybrid QTOF-MS/MS系統(tǒng)（配有Shortcut to Peakview數(shù)據(jù)處理工作站） 美國(guó)AB Sciex公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本Eyela公司。

1.3 方法

1.3.1 荷葉乙酸乙酯相的制備

參照前期研究的方法制備荷葉乙酸乙酯相[16]。干荷葉粉末樣品按照1∶20（g/mL）的比例與90%乙醇溶液混勻，于500 W、50 ℃超聲處理30 min后，4 000 r/min離心8 min，收集上清液，沉淀再在相同條件下提取、離心2 次。合并上清液，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀。膏狀提取物用少量蒸餾水溶解后依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每個(gè)溶劑萃取3～4 次，合并相同萃取組分，將乙酸乙酯相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，于-20 ℃保存。HPLC分析前，將乙酸乙酯相用90%乙醇溶液溶解，配成1 mg/mL的溶液。

1.3.2 活性成分鑒定

1.3.2.1 色譜條件

采用UPLC LC30系統(tǒng)分離乙酸乙酯相中的化學(xué)成分，樣品過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔薄膜后上樣分析。UPLC條件：二極管陣列檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器；Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×75 mm，2 μm）；洗脫溶劑為0.1%甲酸（洗脫劑A）和乙腈（洗脫劑B）；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫：0 min，10% B；6 min，12% B；16 min，20% B；29 min，22% B；40 min，95% B；操作系統(tǒng)：AB Sciex Analyst?1.7.1工作站。

1.3.2.2 MS條件

采用Hybrid Q-TOFMS/MS系統(tǒng)獲得化合物的質(zhì)譜信息。MS條件：電噴霧離子源；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 500；碰撞氣為氦氣；輔助氣體和屏蔽氣體為氮?dú)?；噴霧電壓-4.5 kV；離子源溫度550.0 ℃；輔助氣和噴霧氣壓力50.0 psi；氣簾氣壓力35.0 psi；裂解電壓-80 V；MS碰撞能-10 eV；MS/MS碰撞能（-30±15）eV。采用Peakview?2.2軟件從基峰圖中得到化合物的保留時(shí)間、母離子、碎片離子等信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用PeakView軟件對(duì)樣品的wiff質(zhì)譜文件進(jìn)行處理，提取每個(gè)峰的m/z、保留時(shí)間、MS/MS碎片離子，并計(jì)算對(duì)應(yīng)的分子式和偏差。采用ChemDraw軟件繪制化合物的結(jié)構(gòu)圖和裂解規(guī)律圖，采用Origin 8.0繪制樣品的總離子流圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸乙酯相中化合物分析

荷葉中的主要活性成分為黃酮類化合物，其次為酚酸類，目前荷葉中已鑒定出的黃酮類化合物有39 種，包括黃酮醇類、黃酮類、花青素類、黃烷酮類、黃烷-3-醇類。根據(jù)黃酮苷元的組成，黃酮醇類分為楊梅黃酮、槲皮素、山柰酚和異鼠李素4 類；黃酮類包括香葉木素、丁香亭、芹黃素、木犀草素和金圣草素；花青素類包括矢車菊素、飛燕草色素、錦葵色素、矮牽牛素和芍藥素；黃烷酮類包括柚皮素和花旗松素。黃烷-3-醇類的單聚體包括兒茶素、表兒茶酸鼠李糖苷、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；黃烷-3-醇類的二聚體和多聚體分別為原花青素二聚體B1和(＋)-3,4,5,6,7,8-六羥基黃酮-3-醇；已鑒定出的酚酸為11 種，包括咖啡酸、原兒茶酸、綠原酸、肉桂酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、芥子酸、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸和香草酸[1,17]。

圖1 荷葉乙酸乙酯相的HPLC基峰色譜圖Fig. 1 HPLC base peak chromatograph spectra of the ethyl acetate fraction from lotus leaves

如圖1、表1所示，根據(jù)化合物的母離子、分子式、MS/MS碎片離子、保留時(shí)間等信息，并結(jié)合參考文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)（Chemspider和Metlin）對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定。與前期研究結(jié)果相似，黃酮類化合物為荷葉乙酸乙酯相中的主要化學(xué)成分，其次為酚酸[16]，本實(shí)驗(yàn)共從荷葉乙酸乙酯相中檢測(cè)到27 種黃酮類化合物、6 種酚酸類化合物、4 種有機(jī)酸、2 種脂肪酸和1 種氨基酸。

2.2 黃酮類化合物的鑒定

圖2 負(fù)離子模式下黃酮苷元（a）、黃酮-C-六碳糖苷（b）和黃酮-C-五碳糖苷（c）的特征MS/MS裂解規(guī)律Fig. 2 Characteristic MS/MS fragmentation patterns of flavone aglycone (a), flavone-C-hexoside (b) and flavone-C-pentoside (c) under negative ion mode

不同類型的黃酮苷元和黃酮糖苷在負(fù)離子模式有其特征裂解模式，黃酮苷元在負(fù)離子模式下的特征裂解規(guī)律如圖2a所示，A和B環(huán)左上方的數(shù)字表示斷裂鍵的位置，1,3A-和1,4A-產(chǎn)生的片段的分子質(zhì)量分別為119＋16n1和91＋16n1（n1為A環(huán)上羥基的數(shù)目）；1,3B-和1,4B-產(chǎn)生片段的分子質(zhì)量分別為101＋16n2和129＋16n2（n2為B和C環(huán)上羥基總數(shù)）；0,4B-產(chǎn)生的片段的分子質(zhì)量為145＋16n2；1,2B-產(chǎn)生的片段的分子質(zhì)量為74＋16n2。以槲皮素為例，1,3A-、1,4A-、1,3B-、1,4B-的分子質(zhì)量分別為151、123、149 u和177 u（A環(huán)2 個(gè)羥基、B環(huán)2 個(gè)羥基、C環(huán)1 個(gè)羥基）。另外，黃酮類更容易產(chǎn)生1,3A-和1,3B-碎片，而黃酮醇類傾向于產(chǎn)生1,2A-和1,2B-碎片[18]。

荷葉中的黃酮糖苷主要是O-糖苷、C-糖苷和O-二糖苷?？梢酝ㄟ^(guò)分析這些化合物的HPLC-MS/MS碎片離子區(qū)分糖的取代位置和數(shù)目。對(duì)于O-糖苷類化合物，Y0-為基峰且有高強(qiáng)度或者較高的[Y0-H]-響應(yīng)時(shí)表明糖連接在3-OH位置。對(duì)于C-糖苷類化合物，負(fù)離子模式下會(huì)產(chǎn)生特征碎片離子[M-H-150]-、[M-H-120]-、[MH-90]-和[M-H-60]-[19]，六碳糖苷和五碳糖苷的糖部分在負(fù)離子模式下的特征裂解模式如圖2b、c所示。另外，C-糖苷類化合物在負(fù)離子模式下很難產(chǎn)生Y0-碎片，但苷元部分的分子質(zhì)量可以根據(jù)MS/MS碎片離子中豐富的0,2X-（[苷元＋42-H]-）和0,3X-（[苷元＋72-H]-）片段推測(cè)出來(lái)[20]。

本實(shí)驗(yàn)共從荷葉乙酸乙酯相中檢測(cè)到27 個(gè)黃酮類化合物。峰40的母離子為m/z 301.035 5（C15H10O7），其MS/MS離子m/z 273.040 4和m/z 245.045 6分別為母離子丟失1 個(gè)CO和2 個(gè)CO所產(chǎn)生，產(chǎn)物離子m/z 229.051 0、178.998 5、151.003 8、121.029 6和107.014 0對(duì)應(yīng)的片段分別為[M-CO-CO2-H]-、0,4B-、1,3A-、1,2B-和0,4A-，因此峰40鑒定為槲皮素。按照相同的推斷方法，峰37、38分別鑒定為二羥基黃酮和圣草酚[21]，圣草酚的MS/MS裂解途徑如圖3A所示。

表1 荷葉乙酸乙酯相中鑒定或初步鑒定的化學(xué)成分Table 1 Identification or tentative identification of chemical constituents in the ethyl acetate fraction of lotus leaves

峰17、19、20、21、22、24、26、32中均有特征碎片離子m/z301.04（Y0）和m/z300.03（[Y0-H]-），因此它們被鑒定為槲皮素-3-O-糖苷[22]。峰17（[M-H]-，m/z595.131 6）、峰19（[M-H]-，m/z609.146 3）、峰21（[M-H]-，477.067 8）和峰32（[M-H]-，m/z447.092 8）的苷元離子m/z301.04分別由其母離子脫去戊糖基己糖基（-294 Da）、鼠李糖基己糖基（-308 u）、葡萄糖醛酸基（-176 u）和鼠李糖基（-146 Da）部分所產(chǎn)生，因此峰17、19、21和32分別鑒定為槲皮素-3-O-戊糖基己糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。峰20、22鑒定為槲皮素-3-O-己糖苷，苷元離子m/z301.04為母離子中性丟失己糖基部分（-162 u）所產(chǎn)生。峰24、26的母離子[M-H]-均為m/z433.078（C20H18O11），MS/MS離子m/z301.04為母離子中性丟失戊糖基部分（-132 u）產(chǎn)生，因此峰24和峰26鑒定為槲皮素-3-O-戊糖苷。相似地，峰43、25、27和28分別鑒定為山柰酚、山柰酚-3-O-己糖苷、山柰酚-3-O-己糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖醛酸[23]。峰30的MS/MS產(chǎn)物離子m/z 299.055 3、285.039 2和255.028 2對(duì)應(yīng)的片段分別為[M-C6H10O5-H]-、[M-C6H10O5-CH2-H]-和[M-C6H10O5-CH2-CH2O-H]-，表明化合物中存在1 個(gè)六碳糖和甲基，因此峰30鑒定為山柰素-3-O-己糖苷。按照相同的推斷方法，峰36鑒定為二甲基槲皮素-3-O-己糖苷。

圖3 圣草酚（A）、異鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸（B）和4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat（C）的MS/MS裂解途徑Fig. 3 Possible MS/MS fragmentation patterns of eriodictyol (A),isorhamnetin-3-O-glucuronide (B) and 4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat (C)

峰2 9、3 1、3 5和3 9的母離子[M-H]-分別為m/z 477.103 4（C22H22O12）、m/z 491.083 8（C22H20O13）、m/z 609.146 9（C27H30O16）和m/z 477.104 3（C22H22O12），其共同的產(chǎn)物離子315.05分別由母離子中的己糖基、糖醛酸基、戊糖基己糖基和己糖基部分?jǐn)嗔阉a(chǎn)生。另外，MS/MS特征碎片離子m/z 315.05（Y0-）、314.04（[Y0-H]-）、301.04（[Y0-CH2-H]-）、299.020 7（[Y0-CH3-H]-）表明這些化合物的苷元為異鼠李素，且糖部分鏈接在3 位羥基。因此，峰29、31、35和39分別鑒定為異鼠李素-3-O-己糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸（圖3B）、異鼠李素-3-O-戊糖基己糖苷和異鼠李素-3-O-己糖苷[24]。峰16的母離子[M-H]-為m/z 479.082 9（C21H20O13），其MS/MS產(chǎn)物離子m/z 317.029 4和m/z 316.022 4表明苷元部分為四羥基黃酮，分子式為C15H10O8，且六碳糖連接在3-OH，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，荷葉中存在楊梅素-3-O-葡萄糖苷[10]，因此峰16鑒定為楊梅素-3-O-葡萄糖苷。

本研究從荷葉乙酸乙酯相中檢測(cè)到5 個(gè)黃烷-3-醇類化合物。通過(guò)與文獻(xiàn)中的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較，峰8和峰9分別鑒定為兒茶素和表兒茶素[25]，這2 個(gè)化合物已在荷葉中鑒定[5,17]。峰7和峰15鑒定原花青素二聚體[26]。峰34的母離子[M-H]-為m/z 591.150 8（C31H28O12），其MS/MS產(chǎn)物離子m/z 439.102[M-C7H4O4-H]-和m/z 289.069 9 [M-C7H4O4-C5H8O4-H]-為母離子中的沒(méi)食子酰基和五碳糖部分相繼斷裂所產(chǎn)生，碎片離子m/z 289.069 9、245.080 2、215.071 5表明化合物中存在兒茶素結(jié)構(gòu)，因此峰34鑒定為沒(méi)食子酰兒茶素-戊碳糖苷。

2.3 酚酸類化合物鑒定

共鑒定出6 個(gè)酚酸類化合物（峰1、4、6、11、13和14）。峰1、4、6和14的母離子[M-H]-分別為m/z 169.014 3（C7H6O5）、153.019 4（C7H6O4）、137.024 5（C7H6O3）和m/z 163.040 1（C9H8O3），特征MS/MS碎片離子m/z 125.024 5、109.028 5、109.020 6和119.050 3分別為母離子丟失44、44、18 u和44 u所產(chǎn)生，通過(guò)與文獻(xiàn)比較，峰1、4、6和14分別鑒定為沒(méi)食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)香豆酸[22]。其中，原兒茶酸、對(duì)香豆酸和對(duì)羥基苯甲酸已在荷葉中鑒定[17]。峰11鑒定為二羥基香豆素[27]，MS/MS碎片離子m/z 149.023 7、133.028 3、105.033 2分別為母離子丟失1 個(gè)H2O、1 個(gè)CO2和1 個(gè)CO2＋H2O形成。峰13鑒定為阿魏酸[28]，碎片離子m/z 149.097 4和133.065 6分別由母離子相繼丟失1 個(gè)CO2和1 個(gè)CH4所產(chǎn)生。

2.4 有機(jī)酸和其他類型化合物

共從荷葉乙酸乙酯相中檢測(cè)到4 個(gè)有機(jī)酸類化合物（峰3、5、12和23）、2 個(gè)脂肪酸（峰41和42）和1 個(gè)氨基酸（峰2）。峰3的母離子[M-H]-為m/z 184.061 5，其計(jì)算分子式為C8H10NO4，產(chǎn)物離子m/z 140.071 8、124.040 1和112.039 7分別對(duì)應(yīng)母離子丟失CO2、CO2＋CH4和CO2＋C2H4后所產(chǎn)生的碎片，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)構(gòu)式和MS/MS碎片信息進(jìn)行匹對(duì)，峰3推測(cè)為4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat，其MS/MS裂解規(guī)律如圖3C所示。采用相同的鑒定方法，峰5鑒定為homomevalonic acid，產(chǎn)物離子m/z 117.054 3[M-CO2-H]-和m/z 99.044 0[M-CO2-H2O-H]-表明化合物的結(jié)構(gòu)中至少存在1 個(gè)羧基和1 個(gè)羥基。峰12鑒定為庚二酸，產(chǎn)物離子m/z 141.055 6和m/z 115.076 9分別由母離子丟失1 個(gè)H2O和1 個(gè)CO2所產(chǎn)生。

峰23的母離子[M-H]-為m/z 187.097 5，碎片離子m/z 169.086 5和m/z 125.097 0分別由母離子相繼丟失1 個(gè)H2O和1 個(gè)CO2產(chǎn)生，其MS和MS/MS碎片信息與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的一致，因此峰23鑒定為壬二酸。通過(guò)與文獻(xiàn)中化合物的裂解模式比較，峰2（[M-H]-m/z 131.034 8，C4H7N2O3）鑒定為天冬酰胺[30]。

峰41和峰42的分子式相差2 個(gè)氫原子，且具有相似的產(chǎn)物離子。化合物41的母離子[M-H]-為m/z 327.218 0，MS/MS離子m/z 309.207 1和m/z 291.196 7分別是母離子失去1 個(gè)H2O和2 個(gè)H2O所產(chǎn)生，碎片離子m/z 229.144 5和m/z 211.118 1依次是C12—C13鍵裂解和裂解形成的碎片再脫去1 個(gè)水分子所產(chǎn)生，碎片離子m/z 171.103 0是由C9—C10鍵斷裂所產(chǎn)生，根據(jù)Zhang Lu等[31]報(bào)道，化合物41鑒定為9,12,13-三羥基十八碳癸二烯酸。同理，峰42鑒定為9,12,13-三羥基十八碳癸烯酸，其裂解途徑如圖4所示。

圖4 9,12,13-三羥基十八碳癸烯酸的MS/MS裂解模式Fig. 4 Possible MS/MS fragmentation pattern of 9,12,13-trihydroxyoctadecenoic acid

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)荷葉乙酸乙酯相中的主要化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。根據(jù)色譜峰的母離子、碎片離子、分子式和質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，共從荷葉乙酸乙酯相中鑒定出40 種化合物，包括27 種黃酮類化合物、6 種酚酸、4 種有機(jī)酸、2 種脂肪酸和1 種氨基酸。其中黃酮類化合物以槲皮素、槲皮素糖苷、山柰酚、山柰酚糖苷、異鼠李素糖苷和黃酮-3-O-醇類為主，二羥基香豆素、9,12,13-三羥基十八碳癸二烯酸和9,12,13-三羥基十八碳癸烯酸為首次在荷葉中鑒定。同時(shí)描述了圣草酚、異鼠李素-3-O-葡萄糖醛酸、4-(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)butanoat和9,12,13-三羥基十八碳癸烯酸在負(fù)離子模式下的MS/MS裂解規(guī)律。本研究可為進(jìn)一步探究荷葉乙酸乙酯相抑制AGEs形成的功效物質(zhì)基礎(chǔ)，以及其他生物活性的研究提供理論依據(jù)。