鯽魚魚鱗抗菌多肽的制備純化及其抑菌活性

顧晨濤，黃 灑，王雪燕，李明巖，施永清*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一種天然低分子質(zhì)量多肽，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起著重要的作用[1-2]，廣泛存在于細(xì)菌、植物、軟體動物、兩棲類動物、魚類、鳥類和哺乳動物等體內(nèi)，其具有活性強(qiáng)、功能廣泛、廣譜殺菌等特點(diǎn)[3]。由于其天然的抗菌性能和較弱的細(xì)菌耐藥性，是化學(xué)防腐劑、抗生素等防腐抗菌藥物很好的替代品[4-5]，正如乳酸鏈球菌素Nisin已成功作為天然食品防腐劑應(yīng)用于魚類等食品防腐保鮮領(lǐng)域中[6-7]。

魚類是水生動物群的主要組成部分，其中也存在著多種抗菌肽。關(guān)于魚類抗菌肽的相關(guān)報道很多，如Lin Weiju等[8]從石斑魚（Epinephelus coioides）中得到抗菌肽Epinecidin-1。研究表明魚類抗菌肽還具有獨(dú)特特性，如在極高鹽濃度下也能發(fā)揮作用[9]，所以魚類抗菌肽表現(xiàn)出良好的發(fā)展和應(yīng)用前景[10-12]。

我國是魚類養(yǎng)殖大國，而魚鱗作為魚的副產(chǎn)物，常被當(dāng)作廢棄物而丟棄，這不僅會導(dǎo)致環(huán)境污染，還會造成資源的大量浪費(fèi)，因此提高魚鱗綜合利用率就顯得尤為重要[13-14]。本研究以鯽魚魚鱗為原料，通過酶解法并分離純化得到鯽魚魚鱗抗菌多肽，這既充分利用了廢棄魚鱗資源，使低值的魚鱗高值化，也為以后進(jìn)一步開展此類研究或以此為基礎(chǔ)應(yīng)用于食品或醫(yī)藥行業(yè)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚魚鱗 杭州市海天農(nóng)貿(mào)市場；LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；胃蛋白酶（1∶3 000）美國Amresco公司；透析袋 上海源葉生物科技有限公司；Sephadex G-15、Sephadex G-50 上海寶曼生物科技有限公司；纖維素DEAE-52 英國Whatman公司；寬分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella choleraesuis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、黑曲霉（Aspergillus niger）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）、毛霉（Mucor wutungkiao），由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-18SI自控型手提式滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺 浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；普通玻璃層析柱（1.6 cm×20 cm、2.6 cm×20 cm、1.6 cm×60 cm）上海滬西分析儀器廠有限公司；BT100-2J精密蠕動泵保定蘭格恒流泵有限公司；HD-5電腦紫外檢測儀、SBS-100數(shù)控計滴自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Mini電泳儀、電泳槽、Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Spectra Max 190酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液的提取

將收集的新鮮鯽魚魚鱗用清水反復(fù)清洗，洗去魚鱗表面的黏液和銀屑等雜質(zhì)，于40 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干后冷藏備用。

取5 g干燥鯽魚魚鱗，用剪刀將其剪碎，然后加入0.5 mol/L NaOH溶液，液料比10∶1（mL/g），磁力攪拌3 h，每1.5 h換液一次，以除去魚鱗中的雜蛋白并使魚鱗結(jié)構(gòu)酥松，用蒸餾水清洗至中性。然后加入0.2 mol/L EDTA-2Na[15]，液料比15∶1（mL/g），超聲輔助脫鈣2 h，以除去魚鱗中的鈣鹽等礦物質(zhì)，使膠原蛋白較易溶出，用蒸餾水清洗至中性[16-17]。

取預(yù)處理后的鯽魚魚鱗，加入10%檸檬酸溶液[18]，液料比14∶1（mL/g），然后置于50 ℃恒溫水浴鍋中提取12 h。將提取的魚鱗膠原蛋白溶液調(diào)節(jié)至pH 1.5左右，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的胃蛋白酶，在37 ℃恒溫水浴振蕩2 h完成酶解[19]。酶解后將樣品置于80 ℃恒溫水浴鍋中10 min進(jìn)行滅酶處理[20]。滅酶后的樣品溶液在4 ℃、4 000 r/min離心20 min，得到的上清液即為澄清魚鱗抗菌多肽粗酶液。繼續(xù)將澄清粗酶液在40 ℃旋蒸濃縮至20 mL，即4 mL/g魚鱗，最終得到濃縮后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液，測得其pH值約為1.5，-40 ℃凍藏備用。

1.3.2 抑菌活性測定

采用雙層牛津杯抑菌圈法[21]。在無菌條件下，取無菌培養(yǎng)皿，倒入約10 mL滅菌LB培養(yǎng)基，靜置待其凝固后，將滅菌牛津杯用無菌鑷子夾出，在酒精燈外焰迅速過火，垂直放置于培養(yǎng)基表面。另用移液槍吸取1 mL受試菌菌懸液（1×106CFU/mL），加入到100 mL冷卻至50 ℃左右的滅菌LB培養(yǎng)基中搖勻，制成混有受試菌的LB培養(yǎng)基，并取約20 mL倒入到培養(yǎng)皿中。靜置待其凝固后，用鑷子取出牛津杯，用移液槍吸取100 μL魚鱗抗菌多肽試樣加入到孔中。并添加生理鹽水、等pH值的鹽酸和50 μg/mL氯霉素溶液分別作為空白對照、陰性對照和陽性對照。將培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，以此評價鯽魚魚鱗抗菌多肽的抑菌活性。霉菌為PDA培養(yǎng)基，以0.1%山梨酸鉀溶液作為陽性對照，培養(yǎng)條件為28 ℃培養(yǎng)48 h，其他操作過程同細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，測量取平均值。

1.3.3 鯽魚魚鱗抗菌多肽的分離純化

1.3.3.1 透析

將濃縮后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液裝于截留分子質(zhì)量為3 000 Da的透析袋中，以蒸餾水為透析液，置于4 ℃冰箱中透析12 h，每4 h更換一次透析液。將透析后的抗菌多肽粗酶液冷凍干燥后備用。

1.3.3.2 Sephadex G-15凝膠過濾層析

將透析后的抗菌多肽粗酶液樣品經(jīng)Sephadex G-15凝膠過濾層析柱對樣品進(jìn)行粗分離[22]。樣品適當(dāng)濃度溶解后取4 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，上樣于經(jīng)超純水平衡后的Sephadex G-15凝膠過濾柱（1.6 cm×20 cm），用超純水進(jìn)行洗脫，流速為0.5 mL/min，自動部分收集器收集5 mL/管，用電腦紫外檢測儀檢測280 nm波長處吸光度并繪制洗脫曲線。收集各峰對應(yīng)組分，測定其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，將有抑菌性的組分冷凍干燥后進(jìn)行下一步分離。

1.3.3.3 Sephadex G-50凝膠過濾層析

取Sephadex G-15凝膠過濾層析后的凍干樣品，經(jīng)超純水溶解成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液后用0.45 μm濾膜過濾，取5 mL上樣于經(jīng)超純水平衡后的Sephadex G-50凝膠過濾柱（1.6 cm×60 cm），以超純水為流動相，控制流速0.5 mL/min。自動部分收集器每3 mL收集1 管，調(diào)整電腦紫外檢測儀靈敏度，在280 nm波長處檢測吸光度信號并繪制洗脫曲線。收集各洗脫峰對應(yīng)組分，裝入透析袋后用PEG20000濃縮[23]，分別測定各峰組分對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性。收集具有較好抑菌活性的峰組分，冷凍干燥后備用。

1.3.3.4 DEAE-52陰離子交換層析

取Sephadex G-50凝膠過濾層析后的凍干蛋白樣品，用0.02 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，配制成蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL的上樣液。0.22 μm濾膜過濾后，取10 mL蛋白液加樣于經(jīng)0.02 mol/L、pH 6.8的PBS平衡后的DEAE-52陰離子交換柱（2.6 cm×20 cm），先用PBS充分洗脫掉未被吸附的蛋白，然后用含0.1～0.5 mol/L NaCl的PBS分段梯度洗脫，流速為1 mL/min，自動部分收集器收集5 mL/管，調(diào)整紫外檢測儀靈敏度，檢測280 nm波長處吸光度信號，并繪制出相應(yīng)洗脫曲線[24]。收集各洗脫峰對應(yīng)的蛋白液，裝入透析袋后用PEG20000濃縮，分別測定各組分對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性，將有抑菌活性的峰組分冷凍干燥后置于干燥器中保存。

1.3.4 鯽魚魚鱗抗菌多肽SDS-PAGE分析

將純化后鯽魚魚鱗抗菌多肽和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[25]。采用分離膠15%，濃縮膠5%。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker上樣量5 μL，純化后的蛋白樣品上樣量10 μL。加入電泳緩沖液后，調(diào)節(jié)初始電壓80 V開始電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料指示前沿到達(dá)分離膠時，電壓升至130 V，跑至分離膠底部時電泳結(jié)束。電泳后于水平搖床，先將凝膠置于固定液中固定30 min，然后在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色2 h，再用脫色液進(jìn)行脫色處理，中間更換兩次脫色液直至條帶清晰可見。利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分子質(zhì)量分析。

1.3.5 鯽魚魚鱗抗菌多肽廣譜抑菌活性測定

將分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽進(jìn)行廣譜抑菌活性測定分析[26]。采用雙層牛津杯抑菌圈法，分別測試其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌，對大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、假單胞菌、希瓦氏菌等革蘭氏陰性菌，以及對黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、毛霉等真菌的抑菌性能。

1.3.6 鯽魚魚鱗抗菌多肽MIC測定

采用二倍稀釋法[27-28]測定鯽魚魚鱗抗菌多肽對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、 假單胞菌、希瓦氏菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

取新鮮活化的各細(xì)菌菌懸液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋至1×106CFU/mL，然后依次加入96 孔板的第1～12孔，每孔100 μL。配制質(zhì)量濃度為1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL的抗菌多肽溶液，然后取各質(zhì)量濃度的抗菌多肽溶液100 μL分別加入到第2～11孔中，各孔抗菌多肽質(zhì)量濃度即降為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL。其中第1孔添加等量空白LB液體培養(yǎng)基，第12孔添加等量50 μg/mL氯霉素溶液，分別作為陰性對照和陽性對照。37 ℃培養(yǎng)20 h后，用酶標(biāo)儀測定各孔600 nm波長處OD值，并根據(jù)下式計算抑菌率：

式中：Y為抑菌率；X樣為待測樣品；X陰為陰性對照；X陽為陽性對照。將抑菌率Y大于95%的最小質(zhì)量濃度定義為該菌的MIC[29]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用Image Lab 5.2.1進(jìn)行電泳凝膠成像和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液抑菌活性測定

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，測定鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液的抑菌活性，結(jié)果如表1所示。

表1 鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of enzymatic hydrolysate of crucian carp scales

由表1可知，鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液具有很好的抑菌活性，抑菌效果也顯著好于陽性對照組。可能是由于濃縮后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液較黏稠，濃度較高，并且濃縮后的粗酶液呈輕微黃色，故需對鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液進(jìn)一步分離純化。

2.2 Sephadex G-15凝膠過濾層析結(jié)果分析

由圖1a可知，透析后的鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液經(jīng)Sephadex G-15分離后出現(xiàn)兩個吸收峰，分別對兩個峰按順序標(biāo)號為A和B，并以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為受試菌進(jìn)行抑菌活性測定，如圖1b所示，其中0為空白對照，結(jié)果顯示僅A組分有明顯抑菌活性，所以取A組分進(jìn)行下一步分離純化。

2.3 Sephadex G-50凝膠過濾層析

從圖2a可知，粗分離后的A樣品溶液經(jīng)過Sephadex G-50凝膠柱后，產(chǎn)生4 個紫外吸收峰，分別對其標(biāo)號為Aa、Ab、Ac、Ad。再分別對4 個峰組分濃縮后進(jìn)行抑菌活性測定，如圖2b所示，其中0為空白對照，Aa與Ab并未出現(xiàn)抑菌圈，說明該蛋白組分無抑菌活性，Ac與Ad均有抑菌圈出現(xiàn)，但考慮Ad抑菌圈較小抑菌效果不明顯，故選擇抑菌活性更強(qiáng)的Ac組分進(jìn)行下一步分離純化。

圖2 Sephadex G-50凝膠過濾層析洗脫圖譜（a）及各洗脫峰組分抑菌活性（b）Fig. 2 Elution curve from Sephadex G-50 gel filtration chromatography (a)and antimicrobial activity of all elution peaks (b)

2.4 DEAE-52陰離子交換層析

圖3 DEAE-52陰離子交換層析洗脫圖譜（a）及各洗脫峰組分抑菌活性（b）Fig. 3 Elution curve from DEAE-52 anion-exchange chromatography (a)and antimicrobial activity of all elution peaks (b)

由圖3a可知，將Sephadex G-50分離后的Ac組分上樣于纖維素DEAE-52陰離子交換柱，先用PBS洗脫未被吸附的蛋白。然后分別用含0.1、0.3 mol/L和0.5 mol/L NaCl的PBS階段洗脫，共出現(xiàn)3 個洗脫峰，分別標(biāo)注為AcI、AcII和AcIII，濃縮后分別測定各抑菌活性。如圖3b所示，0為空白對照，僅AcIII有抑菌圈表現(xiàn)出其抑菌活性，故將AcIII確定為分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽并凍干保存。

2.5 SDS-PAGE結(jié)果

將經(jīng)過透析，Sephadex G-15、Sephadex G-50和DEAE-52層析柱分離純化后得到的鯽魚魚鱗抗菌多肽AcIII組分樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4。

圖4 鯽魚魚鱗抗菌多肽SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE pattern of purified antimicrobial peptide

由圖4可知，分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽AcIII只顯示出單一條帶，說明鯽魚魚鱗抗菌多肽AcIII已達(dá)到電泳級純。利用凝膠成像系統(tǒng)軟件分析得出其分子質(zhì)量約為20.1 kDa。

2.6 鯽魚魚鱗抗菌多肽廣譜抑菌活性效果

圖5 鯽魚魚鱗抗菌多肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌和霉菌的抑菌活性Fig. 5 Antibacterial activities of antimicrobial peptide AcIII against G+ bacteria, G- bacteria and molds

由圖5可知，鯽魚魚鱗抗菌多肽對所有受試細(xì)菌與霉菌均有較好的抑菌作用，與各陽性對照間均存在顯著性差異（P＜0.05）。其對細(xì)菌的抑菌圈直徑都能達(dá)到20 mm以上，其中對革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌有最大抑菌圈，直徑為24.31 mm，顯著大于Li Tao等[30]從非洲鯰魚（Clarias gariepinus）副產(chǎn)物中得到的抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑（8.34 mm和6.13 mm）。對霉菌的抑菌效果相對細(xì)菌較弱，但抑菌圈直徑也均能達(dá)到15 mm以上，其中對毛霉有最大抑菌圈，直徑為19.98 mm。由此可得，鯽魚魚鱗抗菌多肽具有很好的廣譜抑菌活性。

2.7 鯽魚魚鱗抗菌多肽MIC測定結(jié)果

表2 鯽魚魚鱗抗菌多肽對各細(xì)菌的MICTable 2 MICs of antimicrobial peptide AcIII against bacteria

由表2可知，鯽魚魚鱗抗菌多肽對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、副溶血性弧菌、假單胞菌和希瓦氏菌的MIC為16 μg/mL，對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC為32 μg/mL，相較于Li Chunlei等[31]發(fā)現(xiàn)的AI-hemocidin 2抗菌多肽對革蘭氏陽性和陰性菌的MIC為37.5～300 μg/mL，其具有更高的抑菌活性。

3 結(jié) 論

本研究利用鯽魚魚鱗為基礎(chǔ)原料，通過預(yù)處理后酸提酶解等過程獲得鯽魚魚鱗抗菌多肽粗酶液，并經(jīng)過透析，Sephadex G-15、Sephadex G-50凝膠過濾柱層析和纖維素DEAE-52陰離子交換柱層析對其進(jìn)行分離純化，最后得到一個具有較強(qiáng)抑菌活性的蛋白組分AcIII。該組分SDS-PAGE顯示為單一條帶，表明其已達(dá)到電泳純級，分析得其分子質(zhì)量約為20.1 kDa。同時通過測定分離純化后的鯽魚魚鱗抗菌多肽對多種細(xì)菌和霉菌的抑菌活性和MIC，證明其具有很好的廣譜抑菌活性，且對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、副溶血性弧菌、假單胞菌和希瓦氏菌的MIC為16 μg/mL，對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC為32 μg/mL。這為進(jìn)一步利用鯽魚魚鱗抗菌多肽在醫(yī)藥或食品方面開發(fā)天然抗菌藥物、防腐保鮮劑等提供了一定的科研基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。