新疆喀什地區(qū)維吾爾族母乳源雙歧桿菌分離篩選及其益生特性分析

趙志霞，許 翠，安美玲，魏小晶，廖 寧，倪永清*，張 艷*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

益生菌被定義為活性微生物，服用足夠量后可賦予宿主許多益生作用[1]。目前開發(fā)使用的益生菌中，雙歧桿菌（Bifidobacterium）是最常見的屬。1899年法國(guó)巴斯德研究院首次從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到動(dòng)物雙歧桿菌，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)分離出的此菌可以抑制導(dǎo)致腹瀉的蛋白水解菌，并且建議給患有該癥狀的嬰兒服用此雙歧桿菌[2]。目前，雙歧桿菌作為正常的腸道微生物區(qū)系中的重要成員，通過抑制胃腸道中潛在致病菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而誘導(dǎo)健康、促進(jìn)全身效應(yīng)而對(duì)宿主發(fā)揮有益作用[3-4]。最近研究表明，雙歧桿菌對(duì)人體健康產(chǎn)生積極的影響，包括預(yù)防感染性腹瀉[5]、改善乳糖不耐癥[6]、降低血清膽固醇[7]、免疫調(diào)節(jié)[8-10]和抗癌能力[11]。

研究顯示，雙歧桿菌是新生兒腸道的最早定植者，但喂養(yǎng)方式極大地影響嬰幼兒腸道中雙歧桿菌的定植[12]，早期母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒其腸道菌群中雙歧桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群。有研究認(rèn)為，母乳不僅為嬰幼兒提供了必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（碳水化合物、必需脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)）[13-14]，更重要的是母乳作為中間載體，通過母乳喂養(yǎng)將母親的雙歧桿菌等益生菌群轉(zhuǎn)移給了嬰幼兒[15]。因此，一般認(rèn)為母乳是嬰幼兒腸道中雙歧桿菌的主要來源[16]。Martín等[17]首次從母乳中分離出乳酸菌，此后有研究者從不同地區(qū)的母乳中分離出雙歧桿菌，例如Martín等[18]采集了23 位西班牙婦女的母乳樣品，從中分離出了B. breve、B. adolescentis和B. bifidum；Sallam等[19]采集了50 份埃及婦女的母乳樣品，最終僅從14 個(gè)樣品中分離到了雙歧桿菌。近期研究發(fā)現(xiàn)，母乳中雙歧桿菌種群的發(fā)生、豐度高低因民族群體的地域分布、飲食習(xí)慣、遺傳背景差異而顯著不同，甚至一些母乳中檢測(cè)不到雙歧桿菌的存在。

但對(duì)于嬰幼兒來說，母乳被認(rèn)為是最安全的食品，開發(fā)母乳中的益生雙歧桿菌作為功能食品，添加在嬰幼兒配方食品中對(duì)于促進(jìn)嬰幼兒健康成長(zhǎng)，輔助治療兒童過敏性疾病、腹瀉等具有巨大的潛力[20]。Arboleya等[21]通過一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了母乳來源雙歧桿菌的益生功能，可作為益生菌添加于新生兒奶粉配方中；從阿根廷母乳樣品中分離出了動(dòng)物雙歧乳亞種，經(jīng)過耐受性、安全性測(cè)試以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，篩選的雙歧桿菌對(duì)腸道微生物有一定的調(diào)控能力[22]。

新疆是我國(guó)眾多少數(shù)民族聚集區(qū)，維吾爾族有著獨(dú)特的文化習(xí)俗、飲食習(xí)慣以及相對(duì)封閉的生存環(huán)境，為母乳中益生菌資源的開發(fā)提供了豐富來源。本研究從新疆喀什地區(qū)健康的維吾爾族哺乳期婦女母乳中分離篩選雙歧桿菌，通過基因型和表型相結(jié)合的方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，了解民族群體中雙歧桿菌種群的發(fā)生；通過抑菌和模擬胃腸液耐受性實(shí)驗(yàn)篩選具有益生作用的優(yōu)良菌株，以期為特色嬰幼兒配方功能食品和其他益生菌產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

母乳樣品采集自新疆喀什市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)（克勒魯克鄉(xiāng)、克孜勒蘇鄉(xiāng)及伽師）不同哺乳期（初乳和常乳）的維吾爾族健康婦女。產(chǎn)婦皆為順產(chǎn)，且在生育之后無服用任何抗生素，無乳腺炎。

采集母乳樣品時(shí)首先要將產(chǎn)婦乳頭以及乳房乳暈用肥皂水和無菌水清洗，手戴無菌手套手動(dòng)將母乳樣品收集在裝有厭氧菌保護(hù)劑的無菌管中，擠出來的第1滴母乳被丟棄。采集之后的采樣管用封口膜封口，放入-20 ℃的車載冰箱里運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

指示菌包括購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存管理中心的致瀉大腸埃希氏菌（Escherichia coli O127:K63 CICC 10411）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium CICC 10420）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（E. coli O78:K80 CICC 10421）、出血性大腸埃希氏菌（E. coli O157:H7 CICC 21530）、單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes CGMCC 1.9136）、血清型腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica CGMCC 1.10754）以及前期實(shí)驗(yàn)室從母乳中篩選出來的條件致病菌蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus JM57）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis HM69）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis JM92）。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

分菌培養(yǎng)基為添加了0.5% L-半胱氨酸的改良MRS（deMan Rogosa Sharpe agar）培養(yǎng)基；HM69和JM92用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)CICC 10411、CICC 10420、CICC 10421、CICC 21530及JM57；PYG培養(yǎng)基用于培養(yǎng)CGMCC 1.9136；TSA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)CGMCC 1.10754。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ddH2O 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR所需引物 上海捷瑞生物有限公司；Marker天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG520厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)DWS公司；Fresco21高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；TC-512 PCR儀 英國(guó)Techne公司；凝膠成像系統(tǒng) 法國(guó)Vilber公司；PowerPac Universal水平電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 雙歧桿菌的分離純化

在采集管底部吸取100 μL母乳樣品，用添加有0.5% L-半胱氨酸的生理鹽水梯度稀釋至101、102、103，吸取100 μL各稀釋液于分菌培養(yǎng)基進(jìn)行涂布，涂布好的平皿放于厭氧箱中，37 ℃厭氧（10% H2，10% CO2和80% N2）培養(yǎng)48 h，用相差顯微鏡對(duì)單菌落進(jìn)行鏡檢，剔除球菌，保留桿菌，對(duì)所有桿菌連續(xù)轉(zhuǎn)接劃線培養(yǎng)3 次，挑單菌落于3 mL改良的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，部分純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，初步篩選得到疑似雙歧桿菌菌株。另一部分純培養(yǎng)物5 600 r/min離心10 min，棄上清液并加入新鮮的培養(yǎng)液重懸，補(bǔ)充70%的滅菌甘油，冷凍保藏于-80 ℃冰箱。

1.3.2 基于分子生物學(xué)方法的菌株鑒定

1.3.2.1 DNA提取及多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜分析

使用苯酚-氯仿-玻璃珠擊打的方法提取菌株DNA[23]。采用單引物GTG5（5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’）對(duì)分離的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，包括：PCR Master Mix 12.5 μL，引物GTG5（10 μmol/L）1.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性7 min；35 次循環(huán)（94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，65 ℃延伸8 min），最后72 ℃延伸16 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/100 mL瓊脂糖凝膠，在0.5×TAE Buffer中80 V/cm電壓下電泳檢測(cè)1.3 h。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果并拍照，用軟件Gel Compar II對(duì)DNA圖譜進(jìn)行聚類分析。DNA帶型完全一致的菌株通常被認(rèn)為屬于同一物種，可據(jù)此將分離所得菌株歸為若干種系型，并從每組中選取至少1 株代表菌株進(jìn)一步測(cè)序分析。

1.3.2.2 16S rRNA基因擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)rep-PCR指紋圖譜分析去重后，從每個(gè)種系型選取2～3 株代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析。采用擴(kuò)增引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）[24]進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系及程序參照Yu Jie等[25]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物純化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，序列同源性分析利用BLAST在線進(jìn)行。在MAGE 7.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 雙歧桿菌的表型特征

1.3.3.1 常規(guī)的生理生化實(shí)驗(yàn)

甲基紅實(shí)驗(yàn)、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)的具體方法參照文獻(xiàn)[26]。

1.3.3.2 碳水化合物代謝譜

按文獻(xiàn)[27]的方法測(cè)試15 株雙歧桿菌對(duì)16 種碳源的利用實(shí)驗(yàn)，其中16 種碳源包括：?jiǎn)翁牵ò⒗恰⒛咎?、核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖），雙糖（蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、蜜二糖），三糖（棉子糖），多糖（淀粉），單糖衍生物（甘露醇、山梨糖醇）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并做空白對(duì)照。

1.3.4 雙歧桿菌的益生特性

1.3.4.1 雙歧桿菌抑制病原菌實(shí)驗(yàn)

將保藏的雙歧桿菌菌株以1%接種量接入改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，即得無細(xì)胞上清液（cell-free supernatants，CFS），以常見的6 種腸道致病菌及從母乳中篩選出的條件致病菌為指示菌，參照劉冬梅等[28]方法測(cè)定分離菌株的抑菌活性，配制各種指示菌所需的固體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，冷卻到60 ℃左右，吸取20 mL培養(yǎng)基加入放置好的平皿中，待其凝固后，取100 μL濃度為105CFU/mL的指示菌在平板上涂布均勻，隨后每個(gè)培養(yǎng)皿中等距離放入4 個(gè)已滅菌的牛津杯，向每個(gè)牛津杯中加入200 μL CFS，以不加菌的MRS培養(yǎng)基作空白對(duì)照，放置4 ℃冰箱擴(kuò)散6 h，然后在37 ℃培養(yǎng)24 h，若有抑菌圈出現(xiàn)，說明該菌株具有抑菌活性，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。每株菌做3 個(gè)平行，取平均值。

1.3.4.2 胃腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

125 mmol/L NaCl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3和3 g/L胃蛋白酶，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 2.5，制成模擬胃液；45 mmol/L NaCl、1 g/L胰蛋白酶、3 g/L牛膽鹽，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 8.0，制成模擬腸液[21]。

將活化之后的雙歧桿菌按2%接種量接入改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，無菌條件下取5 mL菌液離心，棄上清液；用無菌生理鹽水將菌體洗滌2 次，用500 μL生理鹽水重懸菌體。將100 μL菌懸液加入900 μL模擬胃液中，在37 ℃厭氧條件下放置90 min，取樣稀釋涂平板，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行；另取100 μL菌懸液，向其中加入900 μL模擬腸液，37 ℃厭氧條件下放置180 min，取樣，平板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行；實(shí)驗(yàn)對(duì)照為100 μL菌懸液中加入900 μL無菌生理鹽水，放置在37 ℃的厭氧箱中，分別在90 min和180 min后取樣稀釋涂平板，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，做3 次平行實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果，按下式計(jì)算存活率[29]：

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌分離及鑒定結(jié)果

不同來源的15 份母乳中，鏡檢結(jié)果有167 株為桿狀，經(jīng)革蘭氏染色及過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，有56 株表現(xiàn)為革蘭氏陽(yáng)性、過氧化氫酶陰性，疑似為乳酸菌。

圖1 基于16S rRNA基因序列的雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Bifidobacterium strains based on the 16S rRNA gene sequences

經(jīng)rep-PCR去重，挑取得到的29 株代表菌株經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST在線比對(duì)，有15 株雙歧桿菌分離自10 份母乳樣品中，13 株屬Lactobacillus，1 株屬Propionibacterium。將15 株雙歧桿菌與同源菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，12 株雙歧桿菌被劃分為3 個(gè)分支，其中B. pseudocatenulatum構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的大分支；B. breve和B. longum親緣關(guān)系較近，分布在同一個(gè)大分支上；B. longum subsp. infantis和B. longum subsp. longum在同一個(gè)分支上，相似度達(dá)到86%。在GTG5-PCR指紋圖譜（圖2）中，15 株雙歧桿菌被分為8 種基因型，其中B. longum subsp. infantis有2 種基因型，MK49和MK138基因型在85%的水平上相似；2 株B. breve的基因型在80%的水平上相似；2 株B. longum subsp. longum的基因型相似度較低，為65%；8 株B. pseudocatenulatum有4 種基因型，MY72-1、MY72-2和MY86-1基因型相似度達(dá)到100%，MY86-2和MY92基因型相同，另外MY75-1和MY78-2基因型相同，與MY81的基因型在80%的水平上相似。由此可以看出，16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹只能區(qū)分到種水平，而GTG5-PCR指紋圖譜可以區(qū)分到菌株水平。

圖2 雙歧桿菌菌株的GTG5-PCR聚類圖譜Fig. 2 GTG5-PCR clustering map of Bifidobacterium strains

2.2 雙歧桿菌的表型特征

4 項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所檢測(cè)菌株都不能產(chǎn)硝酸鹽還原酶，不能將硝酸鹽還原為有害的亞硝酸鹽；所有雙歧桿菌均不能分解精氨酸產(chǎn)生氨氣（表1）。不同雙歧桿菌的糖代謝結(jié)果見表2，15 株測(cè)試菌株都可以代謝葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖和蔗糖；沒有菌株能代謝甘露醇；3 個(gè)種中，只有8 株B. pseudocatenulatum能利用山梨醇；3 株B. longum subsp. infantis對(duì)碳源的利用能力與其他種（包括一個(gè)亞種）的菌株相比存在很大的差異，相對(duì)其他菌株可利用的碳水化合物少，只能利用6 種；由糖代謝聚類圖可知，對(duì)于基因型相同的菌株，其碳水化合物利用能力基本相同。例如3 株B. longum subsp.infantis構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的分支；2 株B. breve對(duì)碳水化合物的利用能力相同；2 株longum subsp. longum在95%的水平上對(duì)碳源的利用能力相似；8 株B. pseudocatenulatum在糖代謝聚類分析中被分為4 個(gè)小分支，其中MY72-1和MY72-2基因型相同，對(duì)碳源的利用能力也相同；MY81與MY92基因型存在差異，但是對(duì)碳源的利用能力卻相同，在Gueimonde等[30]的研究中也存在類似情況。

表1 雙歧桿菌菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of Bifidobacterium strains

表2 雙歧桿菌的碳水化合物發(fā)酵譜Table 2 Carbohydrate fermentation profile of Bifidobacteria

2.3 益生特性分析

2.3.1 抑菌特性

通過牛津杯法測(cè)定不同雙歧桿菌上清液對(duì)致病菌的抑制能力（表3）。實(shí)驗(yàn)菌株都可以抑制產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌和單核細(xì)胞性李斯特菌；除菌株MY86-1和MY72-2之外，其余B. pseudocatenulatum菌株抑菌能力都較強(qiáng)，尤其菌株MY81、MY75-1、MY92及MY72-1可以抑制實(shí)驗(yàn)中的所有腸道致病菌，而且對(duì)母乳源條件致病菌也有很好的抑制能力，抑菌譜廣；相對(duì)而言，兩株B. breve抑菌能力都相對(duì)較弱，盡管MY16比MY83抑菌能力稍強(qiáng)；而B. longumsubsp.infantis與B. longumsubsp.longum菌株之間的抑菌能力存在著明顯差異，B. longumsubsp.longum的抑菌能力相對(duì)較強(qiáng)。

表3 雙歧桿菌菌株對(duì)指示菌的抑菌直徑Table 3 Antibacterial activity of Bifidobacterium strains against indicator pathogensmm

2.3.2 耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 雙歧桿菌經(jīng)模擬胃腸液處理后的存活率Table 4 Survival rate of bifidobacterial strains in simulated gastrointestinal juices

通過模擬胃腸液計(jì)算存活率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)雙歧桿菌菌株的耐受能力，結(jié)果見表4?；旧纤袦y(cè)試菌株對(duì)模擬胃液都有一定的耐受能力，其中MY92在模擬胃液中具有最強(qiáng)的穩(wěn)定性，經(jīng)90 min保溫處理后存活率達(dá)到了20.37%，其次是MY75-1，經(jīng)處理存活率為1.157%，其他測(cè)試菌株的存活率都低于1.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模擬腸液對(duì)菌株存活率的影響比模擬胃液更明顯。所有測(cè)試菌株與模擬腸液保溫培養(yǎng)180 min之后，存活率都低于1.0%。菌株MK49、MY83、MY72-1等的存活率低于0.000 1%，被認(rèn)為不能耐受腸液。只有MY92經(jīng)模擬腸液處理后存活率仍然達(dá)到0.302%，相比其他測(cè)試菌株耐腸液能力最強(qiáng)。綜合模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MY92是耐受能力最優(yōu)的測(cè)試菌株。

3 討論與結(jié)論

母乳是人類進(jìn)化過程中養(yǎng)育后代形成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)復(fù)雜的天然食品，是嬰幼兒發(fā)育關(guān)鍵階段最重要的營(yíng)養(yǎng)和能量來源。同時(shí)母乳提供了嬰兒免疫系統(tǒng)成熟、促進(jìn)代謝和認(rèn)知發(fā)育以及健康的腸道微生物定植所必須的各種生物活性成分[31]。研究發(fā)現(xiàn)，雖然母乳中金黃色葡萄球菌屬（Staphylococcus）和鏈球菌屬（Streptococcus）的豐度普遍最高，但雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬和腸球菌屬在母乳中的存在對(duì)嬰幼兒腸道的發(fā)育成熟起到至關(guān)重要的作用[13]。最近研究報(bào)道顯示，雖然母乳中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度普遍較低，但是鑒于母乳作為嬰幼兒天然的最優(yōu)營(yíng)養(yǎng)物，為安全益生菌菌株的篩選提供了最佳來源，從而對(duì)于嬰幼兒配方食品的開發(fā)具有極大的潛力。

數(shù)據(jù)顯示，母乳中雙歧桿菌的存在和物種豐富度具有明顯的地域性和人口群體差異性。比如，有人從西班牙初乳和成熟乳中分離到了B. longum、B. breve以及未鑒定的Bifidobacterium-like，其中B. longum是最常見的種類[32]。而Sallam等[19]從埃及婦女母乳中分離出了3 種雙歧桿菌，包括B. bifidum、B. breve及齒雙歧桿菌B. dentium，但與西班牙人母乳不同，B. bifidum是樣品中最常見的種。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B. pseudocatenulatum是喀什地區(qū)母乳中最常見的種，占分離菌株總數(shù)的53%。此外，對(duì)15 個(gè)母乳樣品的分菌結(jié)果顯示，有5 個(gè)樣品中沒有分離到任何雙歧桿菌，此種情況在其他地區(qū)的研究報(bào)道中也存在。例如有研究者采集了20 個(gè)西班牙馬德里健康婦女的母乳樣品，結(jié)果僅從3 個(gè)母乳中分離到B. breve、B. longum[15]；對(duì)28 份伊朗健康婦女的母乳樣品的分菌結(jié)果顯示，只有11 個(gè)樣品中分離到B. breve、B. longum及B. bifidum[33]。顯然，針對(duì)母乳中雙歧桿菌種群存在的地域差異性，對(duì)其原因需要開展更深入的探究。

首先，母乳中雙歧桿菌的存在雖然很重要，但相比腸道和口腔等體其他部位，細(xì)菌總豐度要低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。尤其是雙歧桿菌的絕對(duì)數(shù)量更低，活菌數(shù)約達(dá)1.4×103個(gè)/mL[34]；其次，雙歧桿菌為嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，對(duì)采樣條件要求較高，采樣過程嚴(yán)格厭氧條件保持的持久性以及菌株分離過程中培養(yǎng)基厭氧還原條件的維持也對(duì)雙歧桿菌的分離至關(guān)重要，也決定了能否有效分離到菌株。此外，對(duì)于不同哺乳階段母乳樣品雙歧桿菌的檢測(cè)結(jié)果也存在明顯的種類和豐度差異，甚至于有的樣品中沒有分離到雙歧桿菌，即使采用高通量測(cè)序技術(shù)，在一些母乳樣品中也沒有監(jiān)測(cè)到雙歧桿菌[35]。因此，對(duì)于母乳中雙歧桿菌的發(fā)生目前沒有一致的結(jié)論，需要更廣泛的取樣研究。

雙歧桿菌作為益生菌被廣泛研究開發(fā)用于微生態(tài)制劑，對(duì)常見腸道病原細(xì)菌的抑菌性能和胃腸液的耐受性是重要的篩選標(biāo)準(zhǔn)。Arboleya等[21]對(duì)7 株雙歧桿菌菌株的耐受性比較研究，菌株在模擬胃腸液中的最高存活率分別為74.5%及0.84%，而目前已經(jīng)市場(chǎng)化認(rèn)可的益生菌菌株B. lactis Bb12的耐受性存活率分別為74.5%和0.04%。本研究采用同樣的胃腸液實(shí)驗(yàn)，15 株菌株中最強(qiáng)耐受性菌株為B. pseudocatenulatum MY92，其在模擬胃液中的存活率比B. lactis Bb12低3 倍，但在模擬腸液中的存活率高出7 倍。Awasti等[36]從印度健康婦女母乳、成人糞便及嬰兒糞便中分離到B. pseudocatenulatum、B. breve和B. animalis的耐受性研究發(fā)現(xiàn)，所分離的B. pseudocatenulatum的耐受能力都相對(duì)較弱，而分離出來的3 株B. breve具有很強(qiáng)的耐受能力，其中耐受性最強(qiáng)的1 株在pH 2.0的MRS培養(yǎng)液中溫育2 h及在含有2%膽鹽的MRS培養(yǎng)液中溫育3 h后的存活率分別可達(dá)87%和63%，這一研究結(jié)果與本研究耐受性結(jié)果存在明顯的差異。而Haros等[37]對(duì)從意大利嬰兒糞便中分離出來的1 株B. pseudocatenulatum的耐受性研究后發(fā)現(xiàn)，此菌株耐受能力較強(qiáng)，在含有4%膽鹽的磷酸鹽緩沖溶液中溫育6 h后，其存活率可達(dá)8.05%。因此，雙歧桿菌的耐受性強(qiáng)弱沒有明顯的種依賴性，而具有菌株依賴性。同時(shí)，由于不同研究所采用的耐受液不同導(dǎo)致測(cè)試菌株的耐受能力無法進(jìn)行有效的比較。

統(tǒng)計(jì)顯示，引起嬰幼兒腹瀉的病原體中，大腸埃希氏菌（11%）及志賀氏菌（5%）是最常見的致病菌[38]。Eshaghi等[33]研究從母乳及嬰兒糞便分離出來的12 株雙歧桿菌代表菌株對(duì)4 種致病菌的抑菌結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別有3/4的雙歧桿菌菌株可以抑制大腸埃希氏菌及志賀氏痢疾桿菌，從而有效預(yù)防腹瀉；Delcaru等[39]從健康嬰兒腸道中分離到12 株雙歧桿菌，從3～5 歲腹瀉嬰幼兒腸道中分離出7 株腸道致病菌，其中包括致瀉大腸埃希氏菌和腸侵襲性大腸埃希氏菌，通過斑點(diǎn)法研究12 株雙歧桿菌對(duì)分離出來的腸道致病菌的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1/4的菌株可以有效抑制腸侵襲性大腸埃希氏菌，2/3的菌株對(duì)致瀉大腸埃希氏菌有抑菌活性。本研究抑菌結(jié)果顯示有2/3的測(cè)試菌株對(duì)致瀉大腸埃希氏菌沒有表現(xiàn)出抑菌活性，但所有測(cè)試菌株都對(duì)產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌有較強(qiáng)的抑菌能力，50%的菌株對(duì)出血性大腸埃希氏菌抑菌能力較強(qiáng)。其中綜合抑菌活性最強(qiáng)的菌株是B. pseudocatenulatum MY81和MY92，它們對(duì)條件致病菌蠟狀芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌也有明顯的抑菌性能，因此這些菌株對(duì)預(yù)防因大腸埃希氏菌引起的嬰兒腹瀉及因條件致病菌引起的疾病都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，最近已發(fā)表的關(guān)于嬰幼兒腹瀉研究報(bào)道顯示，輪狀病毒也是引起嬰兒腹瀉的主要原因，占到總腹瀉發(fā)生率20%左右。同樣有研究者報(bào)道，雙歧桿菌可以有效的預(yù)防輪狀病毒引起的腹瀉[5,40]，因此本研究將進(jìn)一步測(cè)試所分離雙歧桿菌對(duì)輪狀病毒的抑制能力。

本實(shí)驗(yàn)以新疆喀什地區(qū)維吾爾族母乳為研究對(duì)象，從中分離篩選到15 株可培養(yǎng)的雙歧桿菌菌株，并通過基因型和表型相結(jié)合的方法對(duì)分離出的雙歧桿菌進(jìn)行了研究。此外，對(duì)15 株雙歧桿菌菌株經(jīng)抑菌及模擬胃腸液實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，從母乳中分離出的雙歧桿菌菌株均具有良好的益生菌潛力，尤其是B. pseudocatenulatum MY92，可作為潛在益生菌菌株進(jìn)行系統(tǒng)的研究。