嬰兒源動物雙歧桿菌消化道脅迫抗性及體外對免疫細胞活性影響的比較

萬 峰，孫思睿，侯雨佳，趙 桉，張 晟，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

雙歧桿菌是人體腸道菌群的重要組成部分，其數(shù)量與人體健康狀況密切相關(guān)。目前，大量的科學(xué)實驗已經(jīng)證明雙歧桿菌具有多種促進健康和預(yù)防疾病的益生及保健作用，如維持腸道菌群平衡、增強免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、控制內(nèi)毒素產(chǎn)生、降低血清膽固醇、延緩機體衰老及促進維生素代謝等作用[1-2]，被廣泛應(yīng)用于乳制品和微生態(tài)制劑生產(chǎn)中。含雙歧桿菌的功能性食品已成為當前許多國家優(yōu)先研究和發(fā)展的領(lǐng)域，旨在調(diào)整微生態(tài)平衡，預(yù)防腸道疾病，促進人體健康。

雙歧桿菌發(fā)揮益生作用的前提是以一定數(shù)量的活菌定植于腸道內(nèi)[3]。被攝食后，雙歧桿菌會面臨胃酸、膽汁酸及各種蛋白酶的脅迫。因此，能夠耐受腸道內(nèi)環(huán)境并在腸道定植的優(yōu)良雙歧桿菌對于應(yīng)用具有重要現(xiàn)實意義。在眾多益生作用中，免疫調(diào)節(jié)功能及機理一直備受關(guān)注，作為天然存在于結(jié)腸的優(yōu)勢菌群，雙歧桿菌的種類和數(shù)量變化直接或間接影響機體的免疫功能。雙歧桿菌一般通過黏附作用定植于腸道內(nèi)，與宿主細胞相互交流作用，進而影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和免疫功能狀態(tài)。因此，有學(xué)者認為雙歧桿菌的黏附能力是決定免疫調(diào)節(jié)活性的重要因素之一，可作為前期篩選或評價免疫性能的重要指標[4]；在體外研究中，常通過對免疫細胞的影響探討其免疫調(diào)節(jié)活性。

本研究以從3～6 個月健康嬰兒糞便自行分離鑒定的4 株動物雙歧桿菌乳亞種作為實驗菌株，比較其耐受性及黏附性能，并進一步分析具有優(yōu)良抗性和黏附性能的雙歧桿菌的免疫細胞調(diào)節(jié)活性。本實驗旨在獲得具有優(yōu)良性能及潛在益生特性的雙歧桿菌，為后續(xù)研究菌株的功能性成分及開發(fā)益生菌制品提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細胞株

4 株動物雙歧桿菌乳亞種H15-2、H20-9、H27-9、H34-21，動物雙歧桿菌BB12作為參考菌株。均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室。

Caco-2細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

改良MRS（mMRS）培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，K2PO42 g/L，MgSO4·H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。

細胞培養(yǎng)基：在完全培養(yǎng)基DMEM中添加10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液。0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

牛膽鹽、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；胎牛血清 加拿大Wisent公司；抗生素、Cell Counting kit-8（CCK-8）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Trypsin-EDTA 美國Gibco公司；與細胞培養(yǎng)相關(guān)的產(chǎn)品均購自美國Corning公司；刀豆蛋白ConA、中性紅 上海Biosharp公司；其他試劑均為國產(chǎn)生化分析純。

1.1.3 實驗用小鼠

小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院研究院實驗動物中心，為6～8 周齡的雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量約為19～21 g，清潔級。飼養(yǎng)室溫度為（23±2）℃，每天人工燈光照明12 h，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱 中國香港力康發(fā)展有限公司；UV-2401PC型紫外分光光度計 日本島津公司；BA300型倒置顯微鏡 廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；冷凍高速離心機 上海市離心機械研究所；GI54DWS型滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；Model 680型酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

取-20 ℃保藏的雙歧桿菌置于室溫融化，以融化液的3%接種于mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18～20 h。經(jīng)連續(xù)2～3 代液體培養(yǎng)，保證菌株的活力，方可進行實驗。

1.3.2 耐受性實驗

1.3.2.1 對酸和膽鹽的耐受性

參考文獻[5]所述方法略作修改。將離心洗滌后的菌體分別重懸在pH 2、pH 3的磷酸鹽緩沖液及質(zhì)量濃度為3 g/L膽鹽溶液中。酸耐受實驗在孵育0、1、3 h取樣，膽鹽耐受實驗在0、3 h取樣。存活率表示為孵育不同時間活菌數(shù)對數(shù)值與0 h時活菌數(shù)對數(shù)值的百分比。

1.3.2.2 對模擬消化道環(huán)境的耐受性

采用本實驗室自行設(shè)計配制的消化液，體外模擬菌體經(jīng)歷消化道的過程[6]。按1.3.2.1節(jié)方法計算存活率。

1.3.3 黏附性實驗

1.3.3.1 菌株對Caco-2細胞的黏附實驗

細胞活化培養(yǎng)及實驗參考文獻[7]所述方法，通過計算每孔中黏附菌數(shù)與初始菌數(shù)的比值評價黏附能力的大小。

1.3.3.2 菌株對病原菌黏附Caco-2細胞的影響

分別采用競爭實驗、排斥實驗、替代實驗研究菌株對致病菌（大腸桿菌ATCC 25922及鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028）黏附Caco-2細胞的抑制作用。具體方法參照文獻[8]，通過計算每孔中未黏附到細胞的致病菌數(shù)與初始致病菌數(shù)的比值評價抑制黏附能力的大小。

1.3.4 菌株產(chǎn)胞外多糖含量的測定

1.3.4.1 標準曲線的繪制

標準曲線繪制方法參考文獻[9]。取2 mL各溶液于具塞試管中，加6%苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，于490 nm波長處測定吸光度，得標準回歸方程為：y=0.013 7x-0.005（R2=0.996 4）。y表示吸光度，x表示葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.3.4.2 多糖含量的測定

參考文獻[10]略作修改。將活化后的菌體接種至10 mL液體mMRS培養(yǎng)基中，100 ℃加熱滅酶15 min，加入1.7 mL質(zhì)量分數(shù)為80%的三氯乙酸溶液，12 000×g離心20 min收集上清液，加入2 倍體積95%冷乙醇溶液，4 ℃過夜離心取沉淀，蒸餾水溶解沉淀物，4 ℃透析48 h，苯酚-硫酸法測定胞外多糖含量。

1.3.5 菌株對免疫細胞活性的影響

1.3.5.1 脾淋巴細胞增殖實驗

脾淋巴細胞制備參照文獻[11]所述，最終調(diào)整細胞的濃度為2×106個/mL。在96 孔板中加入180 μL/孔的脾淋巴細胞懸液，每孔再加入20 μL 106、107、108CFU/mL的雙歧桿菌（即菌數(shù)-細胞數(shù)分別為1∶1、10∶1、100∶1）作為實驗組；空白對照組為200 μL細胞培養(yǎng)液；陰性對照組為180 μL脾淋巴細胞懸液加入20 μL細胞培養(yǎng)液；陽性對照組為180 μL的脾淋巴細胞懸液加入5 μg/mL ConA；雙歧桿菌對照組為180 μL的細胞培養(yǎng)液加入20 μL上述不同濃度的菌懸液。CCK-8法測定淋巴細胞增殖活性[12]。脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化值和增殖指數(shù)見式（1）、（2）：

式中：OD1、OD2、OD3、OD4分別為實驗組、陰性對照組、雙歧桿菌對照組、陽性對照組在酶標儀450 nm波長處的OD值。

1.3.5.2 腹腔巨噬細胞能量代謝水平的測定

巨噬細胞制備參照文獻[13]所述。在96 孔板中加入100 μL/孔的巨噬細胞懸液，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h使其完全貼壁后，用磷酸鹽緩沖液洗去未貼壁細胞。參照1.3.5.1節(jié)加樣及測定，以O(shè)D值表示腹腔巨噬細胞能量代謝水平。

1.3.5.3 腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的測定

參照1.3.5.2節(jié)得到巨噬細胞后，按1.3.5.1節(jié)向每孔中加入100 μL不同濃度的菌懸液，陰性對照加入100 μL細胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去上清液并在每孔加入100 μL中性紅溶液，按照文獻[14]所述方法測定其吞噬能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 4 株動物雙歧桿菌的耐受性

2.1.1 耐酸及膽鹽的能力

在不同pH值條件下，4 株動物雙歧桿菌存活率均差異顯著（P＜0.05）（表1），隨孵育時間的延長，活菌數(shù)逐漸下降。在pH 3條件下孵育3 h，除H27-9外，其余菌株存活率均在60%以上，其中H15-2（90.19%）的存活率顯著高于其他3 株菌（P＜0.05）。當在酸性更強的pH 2環(huán)境中孵育1 h后，4 株菌的存活率均大于60%，而孵育3 h后，除對照株BB12（57.31%）外，實驗菌株均檢測不到活菌。在質(zhì)量濃度為3 g/L膽鹽溶液中孵育3 h后，菌株存活率均大于60%，菌株H15-2（94.84%）存活率顯著高于其他受試菌株及對照株（P＜0.05）。

表1 動物雙歧桿菌在酸性及膽鹽條件下的存活率Table 1 Survival rates of B. animalis under acid and bile salt stress%

2.1.2 耐受模擬消化道環(huán)境的能力

為更好地模擬消化道環(huán)境，制備模擬口腔、胃液、腸液的消化液，如圖1所示，菌體在經(jīng)歷模擬唾液5 min、模擬胃液2 h、模擬腸液2 h的過程中，活菌數(shù)不斷下降，最終存活率仍保持在90%以上，表現(xiàn)出對模擬消化道環(huán)境較好的耐受性，但均顯著低于對照菌株BB12（P＜0.05）。受試的4 株菌中，H15-2（93.69%）的耐受性顯著高于其他3 株菌（P＜0.05）。3 種模擬消化液中，模擬唾液對菌體存活影響較小，后兩種消化液的影響更為顯著。

圖1 4 株動物雙歧桿菌經(jīng)模擬消化道環(huán)境后的存活率Fig. 1 Survival rates of four B. animalis after being exposed to simulated digestive tract environment

2.2 4 株動物雙歧桿菌的黏附力

2.2.1 對Caco-2細胞的黏附能力

雙歧桿菌的黏附能力是衡量其能否定植于腸上皮細胞進而發(fā)揮益生作用的重要指標。圖2表明，4 株雙歧桿菌中，僅H34-21的黏附率（1.31%）顯著低于其他3 株菌（P＜0.05），其余3 株菌的黏附率均大于或接近20%，與BB12（21.65%）無顯著性差異（P＞0.05），表現(xiàn)出較好的黏附能力，其中H15-2的黏附率高達27.59%。

圖2 4 株動物雙歧桿菌對Caco-2細胞的黏附能力Fig. 2 Adhesion capacities of four B. animalis to Caco-2 epithelial cells

2.2.2 對致病菌黏附Caco-2細胞的影響

4 株受試菌對兩株致病菌黏附Caco-2均有不同程度的抑制作用（表2），除H27-9及H34-21外，其他菌株對沙門氏菌的黏附抑制作用強于大腸桿菌。在3 種作用方式中，排斥作用＞競爭作用＞替代作用。菌株BB12對兩種致病菌的黏附抑制率顯著高于4 株受試菌（P＜0.05）。在競爭和排斥實驗中，H20-9、H27-9對兩種致病菌顯示出了明顯的抑制效果；在替代實驗中，H27-9、H15-2對沙門氏菌有較好的抑制作用。

表2 4 株動物雙歧桿菌對致病菌黏附Caco-2細胞的抑制率Table 2 Inhibition rates of four B. animalis against adhesion of pathogenic bacteria to Caco-2 cells

2.3 4 株動物雙歧桿菌產(chǎn)胞外多糖能力

圖3 動物雙歧桿菌胞外多糖的產(chǎn)量Fig. 3 EPS production of B. animalis

所有菌株均能合成胞外多糖且多糖產(chǎn)量均超過100 mg/L（圖3）。4 株受試菌產(chǎn)胞外多糖能力均顯著高于對照菌株BB12（P＜0.05），表現(xiàn)出較強的產(chǎn)胞外多糖能力，其中H15-2胞外多糖產(chǎn)量最高，達到121.87 mg/L。

2.4 動物雙歧桿菌H15-2對免疫細胞活性的影響

2.4.1 對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

根據(jù)黏附及脅迫抗性實驗結(jié)果，選擇動物雙歧桿菌H15-2進行體外免疫活性實驗，淋巴細胞轉(zhuǎn)化值可以直接反映淋巴細胞的活性大小，是衡量T淋巴細胞免疫功能的重要指標之一[15]。實驗結(jié)果表明，脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化值隨受試菌濃度增大而增加，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系（圖4A）。當菌數(shù)-細胞數(shù)比例為10∶1及100∶1時，菌株H15-2對淋巴細胞的轉(zhuǎn)化值顯著高于陽性對照組ConA（P＜0.05），表明H15-2可以調(diào)節(jié)脾淋巴細胞活性且在菌數(shù)大于107CFU/mL時效果更好。

淋巴增殖指數(shù)可以衡量菌體對脾淋巴細胞增殖作用的影響，即增殖指數(shù)大于1時表示促進增殖，增殖指數(shù)小于1時表示抑制增殖[16]。發(fā)現(xiàn)只有當H15-2菌體濃度為108CFU/mL時，脾淋巴細胞的增殖指數(shù)大于1且顯著高于陽性對照（P＜0.05）（圖4B），表明H15-2具有促進脾淋巴細胞增殖的作用。

圖4 動物雙歧桿菌H15-2對脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化值（A）和淋巴增殖指數(shù)（B）的影響Fig. 4 Effects of B. animalis H15-2 on transformation of splenic lymphocytes (A) and proliferation index (B)

2.4.2 對腹腔巨噬細胞能量代謝水平的影響

腹腔巨噬細胞能量代謝水平與H15-2菌體濃度表現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（圖5），當菌體與巨噬細胞的比例為10∶1及100∶1時，巨噬細胞能量代謝水平顯著高于陽性對照組ConA（P＜0.05）。表明動物雙歧桿菌H15-2可以調(diào)節(jié)巨噬細胞活性并促進其增殖，提高其能量代謝水平。

圖5 動物雙歧桿菌H15-2對腹腔巨噬細胞代謝能量水平的影響Fig. 5 Effect of B. animalis H15-2 on energy metabolism level in macrophages

2.4.3 對巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響

通過巨噬細胞吞噬中性紅的方法評價雙歧桿菌H15-2對巨噬細胞吞噬作用的影響，OD570nm值越高表示巨噬細胞的吞噬能力越強。當H15-2菌數(shù)-細胞數(shù)比例為10∶1及100∶1時，可以明顯提高巨噬細胞的吞噬作用（P＜0.05）（圖6），表明H15-2能夠提高巨噬細胞活性，增強其吞噬功能，且吞噬能力與菌體數(shù)量呈劑量依賴關(guān)系。

圖6 動物雙歧桿菌H15-2對腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響Fig. 6 Effect of B. animalis H15-2 on phagocytic activity of peritoneal macrophages

3 討論與結(jié)論

國際糧農(nóng)及世界衛(wèi)生組織[17]建議，益生菌在應(yīng)用前必須經(jīng)過一系列實驗評價以確保其到達腸道之后具有較高的存活率和定植能力進而發(fā)揮益生功能。在其建議的體外實驗中，特別強調(diào)對人工模擬消化道脅迫環(huán)境（胃酸和膽汁鹽）的耐受力以及對腸黏膜的黏附能力。因為黏附是益生菌發(fā)揮益生作用的先決條件，抵御消化道脅迫環(huán)境能力是其存活的保證。

雙歧桿菌被人體攝入后面臨高胃酸和高膽鹽環(huán)境。一般來說，胃液的pH值在3左右，但受飲食影響會有較大波動，極少情況下會達到2以下，小腸中膽鹽占0.03%～0.3%左右，食物通過胃的時間為1～2 h，通過小腸的時間則較短[18]。由于體內(nèi)實驗的復(fù)雜性和困難性，國內(nèi)外研究大多集中于酸脅迫、膽鹽脅迫等單一因素評價菌株對消化道環(huán)境的抗性進而篩選出耐受力較強的菌株。Matsumoto等[19]分析了9 種雙歧桿菌的耐酸性，研究發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌耐酸性較差，在pH 3條件下處理1 h活菌數(shù)顯著降低，pH 2條件下處理1 h無活菌檢出。與此結(jié)果相比，本實驗的4 株動物雙歧桿菌對酸有更好的耐受能力，經(jīng)pH 3和pH 2條件下孵育1 h后，仍有超過80%和60%的存活率，這可能是由于不同菌種間的差異造成的，Margolles等[20]報道動物雙歧桿菌較其他雙歧桿菌具有更強的耐酸能力。相似地，Charnchai等[21]從嬰兒糞便分離出的4 株動物雙歧桿菌在3 g/L質(zhì)量濃度膽鹽中孵育4 h后，菌株存活率在84%～90%之間。而本研究的菌株在相同膽鹽質(zhì)量濃度下處理3 h后存活率均大于60%，其中H15-2的存活率高達94.84%。此外，研究表明雙歧桿菌的耐酸機制主要與F0F1-ATPase酶活性有關(guān)，而具有膽鹽耐受力的菌株與其膽鹽水解酶、表層蛋白、細胞膜脂肪酸的構(gòu)成、胞外多糖等有關(guān)[20]。由此可見，本實驗的4 株動物雙歧桿菌均具備較好的耐酸、耐膽鹽能力。

本實驗除考慮菌株對酸及膽鹽的耐受性外，還通過體外連續(xù)模擬消化道環(huán)境評價其耐受性。由于消化道是一個完整體系并且其中存在各種消化酶，因而較單純的酸性及膽鹽環(huán)境，連續(xù)模擬消化道環(huán)境更能反映菌體通過腸道的真實情況。李軍等[22]通過連續(xù)模擬胃液、十二指腸液、小腸液觀察動物雙歧桿菌RH對整個消化道逆環(huán)境的耐受性，存活率依次為90%、76%、73%；Madureira等[23]采用體外連續(xù)4 步模擬消化道（口腔、胃、十二指腸、回腸）評價菌株的耐受能力，動物雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)值僅下降1 個數(shù)量級。本實驗室自行設(shè)計的連續(xù)模擬消化道環(huán)境與這些實驗類似，但本實驗的4 株動物雙歧桿菌在歷經(jīng)模擬消化道后仍有90%的存活率，且活菌數(shù)對數(shù)值下降不到1 個數(shù)量級，H15-2存活率高達96.7%，這表明本實驗4 株動物雙歧桿菌具有較強的抗消化道脅迫能力。較單純的酸性環(huán)境，菌株在模擬消化道環(huán)境中的存活率更高，這可能是由于蛋白酶的存在降低了酸性環(huán)境的極化程度，從而在一定程度上保護了菌體細胞[24]。而胃液較腸液對菌株的影響更為顯著主要是因為pH值對菌體存活影響更為顯著。由于條件限制，本方法未能模擬胃腸蠕動及pH值的動態(tài)變化，有一定缺陷和不足，但仍可作為前期篩選耐受性優(yōu)良菌株的重要依據(jù)。

雙歧桿菌經(jīng)口攝入人體后，除能夠經(jīng)歷消化道脅迫環(huán)境以較高活菌濃度進入腸道，還要具備較好的黏附定植能力，才能發(fā)揮其最大的生理活性。黏附是細菌與宿主細胞相互作用的第1步，也是細菌定植的必要條件。早期研究表明，使用Caco-2細胞體外評價雙歧桿菌黏附能力的結(jié)果與體內(nèi)黏附腸上皮細胞水平有一定的相關(guān)性[25]。Xu等[26]測定了8 種益生菌的表面性質(zhì)及對Caco-2細胞的黏附性能，黏附率最高的為鼠李糖乳桿菌LGG（23.2%），其次是長雙歧桿菌（20%）；Arboleya等[27]采用熒光標記法分析了來源于母乳中的雙歧桿菌對人腸黏膜的黏附能力，其中長雙歧桿菌的黏附率高達50%。與Xu等[26]所應(yīng)用的菌株比較，本實驗的雙歧桿菌H15-2的黏附率高于商業(yè)菌株LGG和BB12，可達27%，具有較強的黏附性能。而相較Arboleya等[27]的實驗，H15-2的黏附能力略差，這主要是由于Arboleya等[27]采用熒光標記法評價黏附能力，該方法可以反映死菌對細胞的黏附情況；而本實驗則采用了平板菌落計數(shù)法，評價的是存活菌體的黏附。由此可見，黏附模型不同，菌株生境來源以及種屬不同，雙歧桿菌的黏附能力存在較大差異[28]。目前，關(guān)于雙歧桿菌的黏附機理尚未完全清楚，大部分學(xué)者認為，雙歧桿菌發(fā)揮其黏附功能大多與其表面的脂磷壁酸、多糖和表層蛋白等有關(guān)[29]。

此外，雙歧桿菌黏附能力與對病原微生物的黏附抑制作用密切相關(guān)，這是由于具有較好黏附能力的菌株可以通過競爭黏附受體、爭奪營養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、增強免疫應(yīng)答等方式抑制腸道致病菌的黏附[30]。本研究中的4 株動物雙歧桿菌可以通過競爭、排除和替換方式抑制致病菌的黏附，從而起到保護宿主細胞的作用，菌株H20-9和H27-9對沙門氏菌和大腸桿菌黏附抑制率最高可分別達75.04%和66.5%。Candela等[31]采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法研究了4 種益生菌對腸道致病菌沙門氏菌和大腸桿菌黏附Caco-2細胞的影響，結(jié)果顯示所有菌株對沙門氏菌的黏附抑制率均高于大腸桿菌，本實驗中2 株菌（H15-2和H20-9）與其結(jié)果類似，另2 株菌則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。Candela等[31]實驗的1 株動物雙歧桿菌對沙門氏菌及大腸桿菌黏附抑制率分別達88%和44%，本實驗4 株動物雙歧桿菌對兩者的抑制率分別在10%～75%和8%～67%之間，相比較，本實驗中的動物雙歧桿菌對沙門氏菌抑制效果略差，但部分菌株（H27-9、H20-9）對大腸桿菌的抑制效果較好。這種差異一方面源于菌株的不同，另一方面是由于評價方法不同，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法反映死、活菌體對細胞的黏附，而平板計數(shù)法只能反映活菌體的黏附。

作為益生菌分泌的一種生理活性物質(zhì)，胞外多糖被認為與菌體對消化道環(huán)境耐受性、腸黏膜黏附力及免疫調(diào)節(jié)活性等具有相關(guān)性。Hidalgocantabrana等[32]報道高產(chǎn)胞外多糖的雙歧桿菌能增加其在胃腸道的抗性，Ruasmadiedo等[33]實驗結(jié)果則表明胞外多糖的存在可以增加益生菌對腸黏膜的黏附性。本實驗中，胞外多糖最高的H15-2同樣具有最強的耐受性和黏附能力，推測三者可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，但耐受性較強的BB12胞外多糖產(chǎn)量卻最低。因此，本研究胞外多糖合成相關(guān)結(jié)果與其他實驗結(jié)果的相關(guān)性并不明顯，且具體對耐受性及黏附性的貢獻度尚未得知，需要更加深入研究其機制以證實三者間的聯(lián)系。此外，有研究指出與消化道逆環(huán)境耐受能力高度相關(guān)的多糖為莢膜多糖[34]，而本實驗測得粗多糖為黏液多糖，因此仍需要進一步實驗探究其相關(guān)性。雙歧桿菌合成胞外多糖的量通常較低，一般平均在每升幾十到幾百毫克不等[35]。本實驗的4 株動物雙歧桿菌胞外多糖平均產(chǎn)量在120 mg/L左右，顯著高于對照株BB12。雙歧桿菌的胞外多糖還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇等作用[36]，可作為前期篩選具有益生特性菌株的重要指標之一。

體外評價雙歧桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用，大多采用機體主要的免疫細胞，如脾淋巴細胞、巨噬細胞等反映益生菌對免疫功能的影響。淋巴細胞可以反映細胞免疫功能的強弱，而巨噬細胞則在非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[37]。李艾黎等[16]發(fā)現(xiàn)無論是活性乳桿菌還是熱致死乳桿菌對于小鼠脾淋巴細胞增殖均有一定的促進作用，這種作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，將雙歧桿菌的劑量提高10 倍（即細菌數(shù)-細胞數(shù)比例為100∶1），發(fā)現(xiàn)具有良好耐受性及黏附性的雙歧桿菌H15-2對淋巴細胞和巨噬細胞增殖都有明顯促進作用，在一定程度上可以增強巨噬細胞的吞噬能力，對兩種免疫細胞的調(diào)節(jié)效果呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。而范志紅等[38]研究則表明高濃度的菌體（＞109CFU/mL）對巨噬細胞活性有抑制作用，但具體原因尚不清楚，且益生菌到達腸道前活菌數(shù)仍會有損失，因此本實驗僅限于體外研究，在體內(nèi)具體的有效劑量仍需進一步探索研究。目前，對于雙歧桿菌免疫調(diào)節(jié)作用機理的研究還不透徹，但普遍認為雙歧桿菌菌體表面成分，如肽聚糖、脂磷壁酸、表層蛋白等，或分泌至菌體外的可溶性物質(zhì)，如抗菌物質(zhì)、胞外多糖及分泌蛋白等，能通過M細胞進入集合淋巴結(jié)，激活T細胞和B細胞，從而調(diào)節(jié)和增強機體的免疫力[39]。

綜上所述，動物雙歧桿菌H15-2具有良好的耐受性、黏附力及產(chǎn)胞外多糖能力，并且具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，可作為具有益生功能的菌株進行深入研究和開發(fā)。