轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定化及其在處理米糠廢水中的應(yīng)用

裴興武，汪 鴻，高子雯，袁泰增，高 明，姚 凱，潘明喆,*，于殿宇,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.湖北天星糧油股份有限公司，湖北 隨州 441300）

米糠是稻谷碾米加工過程中的主要副產(chǎn)物，約占整個糙米產(chǎn)量的8%～10%，我國年產(chǎn)米糠1 000萬 t以上[1]。國內(nèi)外研究表明米糠是最具開發(fā)潛力的一種高附加值的資源，它不僅有高含量的脂肪和蛋白質(zhì)，而且還含有抗微生物、抗癌和其他能促進健康的功能物質(zhì)[2]，如膳食纖維、維生素谷維素、礦物質(zhì)、植酸、蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶抑制劑、丹寧等。米糠中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為12%～15%[3]，其中賴氨酸含量比米胚乳中高，也比其他谷物米糠蛋白中的含量高。米糠蛋白的效價比為2.0～2.5（酪蛋白為2.5）[4]，蛋白消化率達90%，且米糠蛋白是低過敏性蛋白，是唯一可以免于過敏實驗的谷物蛋白。因而，米糠蛋白被認為是一種理想的嬰兒食品原料，并將其添加到對一些食物過敏的兒童膳食中[5-7]。雖然米糠的營養(yǎng)和藥理特性已被廣泛認可，但目前米糠濃縮蛋白和分離蛋白并沒有商品化，主要原因是米糠蛋白溶解性差[7-8]。因而，如何提高米糠蛋白的溶出得率和改善其功能特性，成為國內(nèi)外研究熱點。近年來，我國提取米糠蛋白的工作已在不少地區(qū)得到大規(guī)模開展。在米糠蛋白的生產(chǎn)中，會排放出大量米糠廢水，采用傳統(tǒng)的廢水處理工藝對米糠廢水的處理會使廢水中含有的多種營養(yǎng)物質(zhì)被浪費。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶，MTG；EC2.3.2.13）是一種能催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)（或多肽）之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物的聚合酶[9-11]，所以它可催化蛋白質(zhì)中多肽發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，從而使米糠廢水中蛋白分離出來[12]。經(jīng)MTG交聯(lián)形成的米糠蛋白聚合物具有良好的水溶性[13]、乳化性以及穩(wěn)定性[14]而廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)，它一方面改善食品的物性，另一方面優(yōu)化食品的質(zhì)構(gòu)和感官。Clare等[15]在花生蛋白粉中加入MTG，促使花生蛋白發(fā)生交聯(lián)，使蛋白溶解性得到改善，從而有利于消化吸收。劉穎等[16]利用MTG研究大豆11S球蛋白聚合效果，發(fā)現(xiàn)改善了聚合前的穩(wěn)定性，從37.78%提高到了79.28%。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，游離酶在高溫、過酸和過堿條件下容易變性失活，并且在實際生產(chǎn)中難以回收。酶的固定化技術(shù)很好的解決了很多問題，例如使酶的最適溫度范圍變寬，它也可以將酶從反應(yīng)產(chǎn)物中分離，提高重復(fù)使用性，從而提高反應(yīng)效率[17-19]。

分離膜不僅能夠?qū)怏w、有機物、各類生物制劑等進行有效的分離、濃縮和純化，而且還能作為固定化酶的載體，實現(xiàn)酶的膜固定化[20-21]。醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜具備良好的疏水性、吸附性以及化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點[22]，并且能將酶的催化特性和膜的優(yōu)良分離性能有機地結(jié)合起來，構(gòu)成酶膜生物反應(yīng)器[23]，在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。Merz等[24]使用蛋白水解酶制劑Flavourzyme?在酶膜反應(yīng)器中進行了原始食品級連續(xù)長期水解過程，在反應(yīng)器中酶被重復(fù)使用，與參考批處理相比，酶生產(chǎn)率提高了450%。Baldassarre等[25]利用連續(xù)膜酶生物反應(yīng)器將洋蔥皮酶解成果膠低聚糖，研究其水解性能，取得了良好的水解效果。Hang Hua等[26]研究酶膜反應(yīng)器與納米過濾膜系統(tǒng)相結(jié)合，研究菊粉轉(zhuǎn)化的高濃度DFA III，結(jié)果表明，EMR與NF膜結(jié)合的體系包含5 L的溶液體積，超濾和納米過濾膜的分子質(zhì)量截止值為5 kDa和150 Da，DFA III質(zhì)量濃度增加至約400 g/L。該系統(tǒng)可以提供穩(wěn)定的操作并且可以持續(xù)運行8 次，可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)。

本實驗通過制備醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜，并將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行膜固定化，依據(jù)最佳條件制得固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜，對固定化酶膜進行表征分析。并且通過將制備好的固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜固定在不銹鋼網(wǎng)框上懸掛于燒杯中用來聚合米糠廢水中的蛋白質(zhì)。在一定轉(zhuǎn)速條件下，利用響應(yīng)面確定物料溫度、物料pH值、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、酶膜面積與底物含量的比例和反應(yīng)時間等最佳條件，并以蛋白聚合率為指標(biāo)，研究固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化米糠廢水中米糠蛋白聚合率的影響，為連續(xù)化保留米糠廢水中的蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠廢水（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.51%） 湖北天星糧油股份有限公司；微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 上海一鳴生物科技有限責(zé)任公司；N-α-CBZ-Gln-Gly 美國Sigma公司；醋酸纖維素 北京惠寶聯(lián)化科技有限公司；聚丙烯膜（孔徑0.1 μm） 鄭州華膜水處理器材有限公司；丙酮 河南富達化工產(chǎn)品有限公司；三氯乙酸、FeCl3·6H2O 威海恒邦化工公司；L-谷氨酸γ-單羥肟酸深圳市迪肯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-260紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；80-2高速離心機 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DF-1磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；SY-2-4恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；ZK-82B真空干燥箱 上海實驗儀器總廠；SHB-III T循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；PHS-3C精密酸度計瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜的制備

準(zhǔn)確稱取10 g醋酸纖維素充分溶解于200 mL丙酮中，等到一定時間形成均勻成型的膜液之后，再將聚乙烯緩慢放到膜液當(dāng)中，等到其自然成膜，然后用大量去離子水沖洗數(shù)次干燥備用[27]。

1.3.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定化

采用吸附與交聯(lián)相結(jié)合的固定化方法，取一定規(guī)格的醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜于燒杯中，加入質(zhì)量濃度15 mg/mL的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶液和pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，吸附3 h。再加入質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL的戊二醛進行交聯(lián)反應(yīng)，4 h后將膜取出，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗除去多余的酶液并干燥[28]，并將干燥好的固定化酶膜固定在不銹鋼網(wǎng)框上，浸入磷酸鹽緩沖液中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 掃描電鏡分析

采用掃描電鏡（放大倍數(shù)為5 000）分別對空白膜和酶固定化后的膜進行表面結(jié)構(gòu)特征檢測，然后進行比較。

1.3.4 固定化酶膜處理米糠廢水單因素試驗

將固定好酶膜的網(wǎng)框懸掛在1 000 mL的燒杯中，約在離杯口1/3處，將米糠廢水通入到燒杯中，在磁力攪拌的作用下與酶膜充分接觸2 h。分別選取物料溫度34～50 ℃，物料pH 5.5～7.5，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速95～155 r/min，酶膜面積與底物含量比例76∶1～84∶1（cm2/g），反應(yīng)時間0.5～2.5 h研究對酶解效果的影響，測定不同條件聚合前后的米糠廢水的蛋白質(zhì)含量，以蛋白聚合率為指標(biāo)，每組實驗平均做3 次。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

依據(jù)1.3.4節(jié)單因素試驗結(jié)果，在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken模型，分別對物料溫度（A）、物料pH值（B）、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速（C）、酶膜面積與底物含量比例（D）和反應(yīng)時間（E）5 個因素進行優(yōu)化，并以蛋白聚合率（Y）為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used in response surface analysis

1.3.6 固定化酶膜重復(fù)使用次數(shù)

在響應(yīng)面最佳條件下進行反應(yīng)，在每一次使用結(jié)束后取一部分酶膜進行酶活力測定，考察重復(fù)使用次數(shù)對酶膜相對酶活力的影響。

1.3.7 測定方法

1.3.7.1 載酶量測定

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶載酶量測定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法[29]。

采用凱氏定氮法分別測定固定化前后的醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜的蛋白質(zhì)含量，以及清洗固定化酶膜所用磷酸鹽緩沖溶液中的蛋白含量。根據(jù)公式（1）計算載酶量：

式中：C0為固定化之前酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C為固定化之后酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cw為沖洗固定化酶膜之后，所用磷酸鹽緩沖溶液中的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為固定化實驗所用酶溶液體積/mL；Vw為沖洗固定化酶膜之后，所用磷酸鹽緩沖溶液體積/mL；W為浸入酶溶液中的膜面積/cm2。

1.3.7.2 酶活力測定

采用Folk等[30]的分光異羥肟酸分析法進行測定。一個酶活力單位表示為：37 ℃時1 min催化1 μmol N-α-CBZ-Gln-Gly生成單羥肟酸所消耗酶量，單位為U/g。相對酶活力：每組中所測酶活力與該組中測得的最高酶活力二者的相對百分比表示。

1.3.7.3 蛋白質(zhì)含量測定

采用GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法測定。

1.3.7.4 蛋白質(zhì)聚合率測定

廢水處理前蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度記為C1/（mg/mL），廢水處理后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度記為C2/（mg/mL），并利用公式（2）計算蛋白質(zhì)聚合率：

1.3.7.5 酶膜面積的計算

根據(jù)預(yù)實驗，需添加酶與蛋白比為1.1 U/g，酶膜經(jīng)裁剪為長方形形狀，并且根據(jù)公式（3）計算酶膜面積：

式中：S為酶膜面積/cm2；V為廢水樣體積/mL；A為酶膜的酶活/（U/g）；B為酶膜單位面積載酶量/（mg/cm2）。

1.3.7.6 其他成分測定

化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）測定：采用Cr法測定廢水中COD值；生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）測定：根據(jù)測定的COD值，采用稀釋接種法測定廢水中BOD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)處理用Origin 2017軟件來整理與分析，用SPSS 17.0進行單因素方差分析，響應(yīng)面用Design-Expert 8.0.6軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶膜的酶載量以及酶活力

依據(jù)1.3.7節(jié)中相關(guān)酶載量以及酶活力測定的方法，測得單位面積酶載量為0.81 mg/cm2，酶活力為17.6 U/g。固定化酶的活力相較于游離酶的活力有所降低，主要是因為固定化過程會損傷一定的酶活。

2.2 酶膜的掃描電鏡

分別對制得的空白膜及固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜做掃描電鏡，結(jié)果如圖1所示。

圖1 微孔膜和固定化酶膜電鏡掃描圖Fig. 1 Scanning electron microscopy images of microporous membrane and enzyme-immobilized membrane

從圖1a可以看出，空白醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜呈現(xiàn)纖維狀，纖維相互錯亂交叉，排列不規(guī)則，但表面很平整光滑、致密、均勻，代表穩(wěn)定性好[28]。從圖1b可看出，此時酶蛋白固定化后的膜表面由于交聯(lián)了蛋白的基團，存在一些顆?；驁F狀的物體而顯得有些粗糙，而且這些顆粒大小不一，形狀各異，附著在纖維表面，并且纖維表面大部分被酶覆蓋[31]?？梢哉f明MTG已經(jīng)固定在醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜上。

2.3 酶膜處理米糠廢水的單因素試驗

將固定有酶膜的網(wǎng)框懸掛在燒杯中，控制米糠廢水的反應(yīng)pH 6.5、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速125 r/min、酶膜面積與底物含量比例80∶1（cm2/g）、反應(yīng)時間1.5 h。

2.3.1 物料溫度對蛋白聚合率的影響

圖2 物料溫度對蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 2 Effect of material temperature on protein polymerization rate

由圖2可知，蛋白聚合率隨溫度變化的趨勢為先快速增高后趨于平穩(wěn)。當(dāng)物料溫度小于42 ℃時，蛋白聚合率很明顯地隨物料溫度的升高而升高，說明酶膜活性隨溫度的升高不斷增強，與廢水中的蛋白充分聚合，從而分離下來。但物料溫度升至42 ℃時蛋白聚合率達到65%，溫度繼續(xù)升高蛋白聚合率趨勢穩(wěn)定，并沒有顯著變化，可能是此時的蛋白發(fā)生變性[32]，蛋白聚合率變化趨勢不明顯。因此本實驗把物料溫度確定在42 ℃左右。

2.3.2 物料pH值對蛋白聚合率的影響

圖3 物料pH值對蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 3 Effect of material pH on protein polymerization rate

由圖3可知，蛋白聚合率隨pH值的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)pH值為5.5～6.5之間時蛋白聚合率隨pH值的升高而升高，pH值為6.5時蛋白聚合率最高達68%，而當(dāng)pH值繼續(xù)升高，蛋白聚合率下降。由此可見，在強酸、強堿性條件下會破壞酶的活性位點，從而使酶失活[33]，不利于酶膜發(fā)揮聚合作用，對米糠蛋白的聚合效果較差。從而得知酶膜的最佳反應(yīng)pH值在中性條件附近，所以選取pH值在6.5左右。

2.3.3 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速對蛋白聚合率的影響

圖4 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 4 Effect of rotor speed on protein polymerization rate

由圖4可知，當(dāng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速時，蛋白聚合率呈現(xiàn)先較上升后下降的趨勢。當(dāng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速在95～125 r/min時，蛋白聚合率隨轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速的增大而增大，因為適當(dāng)?shù)臄嚢栊Ч梢允箯U水中的蛋白與酶膜充分接觸，從而提高聚合率。當(dāng)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速大于125 r/min時，隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速的增大，蛋白聚合率反而下降，強力的攪拌使得廢水中的蛋還未與酶膜充分接觸聚合，從而造成聚合率降低。所以，將轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速確定在125 r/min附近。

2.3.4 酶膜面積與底物含量比例對蛋白聚合率的影響

由圖5可知，蛋白質(zhì)聚合率隨其比例的增大呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)比例小于80∶1 （cm2/g）時，隨著酶膜面積的增大，會提供更多的聚合位點聚合廢水中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)聚合率相應(yīng)地提高。當(dāng)比例大于80∶1（cm2/g）時，此時廢水中的蛋白質(zhì)含量一定，過多的酶膜面積起不到聚合蛋白質(zhì)的作用，從而造成酶膜的浪費。所以，選擇酶膜面積與底物含量比例在80∶1（cm2/g）左右。

圖5 酶膜面積與底物含量的比例對蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 5 Effect of ratio between enzyme-loaded membrane area andsubstrate amount on protein polymerization rate

2.3.5 反應(yīng)時間對蛋白聚合率的影響

圖6 反應(yīng)時間對蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 6 Effect of reaction time on protein polymerization rate

由圖6可知，蛋白質(zhì)聚合率隨反應(yīng)時間的增大呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。當(dāng)反應(yīng)時間在1.5 h之前，因為反應(yīng)未達到充分，樣品中蛋白并沒有被全部聚合，所以出現(xiàn)隨時間延長而增大的現(xiàn)象。當(dāng)反應(yīng)時間在1.5 h之后，樣品中蛋白被聚合完全，蛋白聚合率趨于平穩(wěn)，繼續(xù)增大反應(yīng)時間并不能取得更好的效果，所以，選取反應(yīng)時間在1.5 h左右。

2.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計設(shè)定A（物料溫度）、B（物料pH）、C（轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速）、D（酶膜面積與底物含量比例）、E（反應(yīng)時間）分別是影響因素，Y（蛋白聚合率）為響應(yīng)值得到5因素3水平設(shè)計與結(jié)果，如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design in terms of coded values with results for response surface analysis

續(xù)表2

2.4.2 模型方差與分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對2.4.1節(jié)中實驗結(jié)果進行方差分析，得到回歸線方程為：

由表3可知，回歸模型中以蛋白聚合率為響應(yīng)值的F值為71.05，P＜0.000 1，表明在利用回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著，說明得到的回歸方程可靠[34]。通過方差分析失擬項大于0.05，表明此差異不顯著，說明回歸區(qū)域內(nèi)擬合良好，該模型選擇正確。多元相關(guān)系數(shù)R2=98.27%＞0.8，表明在此模型中各個因素和響應(yīng)值之間相關(guān)性好[35]，可以通過此模型分析和預(yù)測蛋白聚合率。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.4.3 交互參數(shù)的等高線圖

圖7 交互參數(shù)對蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 7 Response surface plots showing the interactive effect of various parameters on protein polymerization rate

交互項的交互曲線越陡，表明越顯著，并且形成的曲面為較為規(guī)則的形態(tài)[36]。由圖7可知，物料溫度、物料pH值、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、酶膜面積與底物含量的比例以及反應(yīng)時間5 個變量在交互時，控制3 個變量恒定，隨著其他2 個變量的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在交互結(jié)果中，AD、BC顯示極顯著，AB、AC、BD顯著，即物料溫度和酶膜面積與底物含量的比例、物料pH值和轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速之間交互極顯著，而物料溫度和物料pH值、物料溫度和轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、物料pH值和酶膜面積與底物含量的比例之間交互顯著。通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到最佳條件為物料溫度42.9 ℃、物料pH 6.60、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速123.7 r/min、酶膜面積與底物含量的比例80.23∶1（cm2/g）、反應(yīng)時間1.81 h，在此條件下得到蛋白質(zhì)聚合率為70.1%。根據(jù)實際情況得出整理值，整理值為物料溫度43 ℃、物料pH 6.6、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速124 r/min、酶膜面積與底物含量的比例80∶1（cm2/g）、反應(yīng)時間1.8 h。在此整理條件下，做3 次平行試驗，蛋白質(zhì)聚合率平均值為70%，進一步說明此回歸模型建立良好，與實際值相吻合，可以用來分析和預(yù)測蛋白質(zhì)聚合率。

2.5 酶膜的重復(fù)使用次數(shù)

在2.4節(jié)響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件下考察重復(fù)使用次數(shù)對固定化酶膜的相對酶活力的影響，如圖8所示。

圖8 酶膜的相對酶活力隨使用次數(shù)變化Fig. 8 Change in relative enzymatic activity of enzyme-loaded membrane after repeated use

由圖8可知，酶膜的相對酶活力呈現(xiàn)隨操作次數(shù)的增加而降低的趨勢，經(jīng)10 次使用后，相對酶活力為51.5%。這可能是由于隨著操作次數(shù)的增加，酶膜受到一定程度的機械損傷，致使相對酶活力降低。部分破損、部分固定化酶脫落等現(xiàn)象的出現(xiàn)，也會降低固定化酶的活性。酶本身的失活和酶活力低也會致使固定化酶活力降低。但在圖中可以看出，酶膜在重復(fù)使用5 次后，相對酶活力仍可保持在74.3%以上。

2.6 主要指標(biāo)對比

表4 米糠廢水處理前后成分含量對比Table 4 Comparison of protein content, COD and BOD of rice bran wastewater before and after treatment with MTG-loaded membrane

米糠廢水中主要指標(biāo)在處理前后有一定的變化，成分變化如表4所示。處理后比處理前蛋白質(zhì)、COD值和BOD值各個指標(biāo)均有相對顯著幅度的下降，表明此次實驗良好，利用醋酸纖維素-聚丙烯膜固定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對米糠廢水中蛋白的聚合起到了良好的效果。

3 結(jié) 論

本實驗首先制備了醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶固定在復(fù)合膜上，制得了固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜，其單位面積酶載量為0.81 mg/cm2，并對酶膜進行表征分析。然后將酶膜固定在網(wǎng)框上并懸掛于燒杯中，用來聚合米糠廢水中的蛋白質(zhì)，以米糠廢水中的蛋白質(zhì)聚合率為指標(biāo)，分別考察物料溫度、物料pH值、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速以及酶膜面積對蛋白質(zhì)聚合率的影響，并利用響應(yīng)面對各個條件進行優(yōu)化，得到最佳條件。在物料溫度43 ℃、pH 6.6、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速124 r/min、酶膜面積與底物含量比例80∶1（cm2/g）、反應(yīng)時間1.8 h條件下，蛋白質(zhì)聚合率可達70%，表明本實驗有效保留了米糠廢水中的蛋白質(zhì)含量，相應(yīng)米糠廢水中相關(guān)指標(biāo)也有所降低：COD值為3 859 mg/L，BOD為1 982 mg/L。與此同時，對酶膜重復(fù)使用性進行了實驗，在使用5 次后，酶膜的相對酶活力為74.3%。本實驗為之后利用酶膜降低米糠廢水中蛋白質(zhì)含量從而保留更多營養(yǎng)物質(zhì)提供一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。