新疆冷水魚(yú)腸道肉桿菌遺傳差異及抑菌特性分析

魏小晶，趙志霞，羅寶龍，張瑞蕊，張 艷，倪永清,*，周 紅,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

動(dòng)物腸道是一個(gè)開(kāi)放的生態(tài)系統(tǒng)，其中棲息著大量的微生物[1]。腸道微生物作為宿主消化系統(tǒng)的重要組成部分，在促進(jìn)宿主的食物消化、維持微生態(tài)平衡及調(diào)節(jié)免疫等方面起著不可替代的作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物與宿主之間形成了復(fù)雜而又相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)關(guān)系，確保宿主的健康和腸道微生物的平衡。此外，不同物種間或者同一物種不同群體之間，甚至是同一群體不同個(gè)體之間的腸道微生物結(jié)構(gòu)都有差異[4-5]。Cummings等[6]發(fā)現(xiàn)單胃動(dòng)物的腸道微生物與其生理代謝功能緊密相關(guān)。魚(yú)類作為一種獨(dú)特的脊椎單胃動(dòng)物，屬于變溫動(dòng)物，體溫隨水溫的變化而變化，其微生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成主要取決于食性和生存的水體環(huán)境[7]，也使得魚(yú)類腸道微生物明顯不同于陸生脊椎動(dòng)物。

近年來(lái)，有關(guān)魚(yú)類消化道微生物的研究開(kāi)始備受關(guān)注[8]，大部分集中于魚(yú)類食性、生存環(huán)境和腸道微生物的相關(guān)性研究。相對(duì)于人類和陸生高等脊椎動(dòng)物，由于魚(yú)類屬于變溫動(dòng)物，其生存的大部分水體環(huán)境溫度較低，為篩選到耐低溫的益生乳酸菌提供了良好的來(lái)源，尤其是產(chǎn)細(xì)菌素的耐低溫乳酸菌在食品的生物保鮮技術(shù)方面具有廣闊的市場(chǎng)前景。研究發(fā)現(xiàn)，部分乳酸菌除能代謝產(chǎn)生有機(jī)酸及過(guò)氧化氫等物質(zhì)外，還能產(chǎn)生細(xì)菌素類活性物質(zhì)[9]，能有效地抑制食品中病原菌及腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖[10-11]，這些具有抑菌特性的低溫乳酸菌在飼料行業(yè)及食品冷藏保鮮中極具應(yīng)用潛力[12]。有研究報(bào)道，魚(yú)類腸道不僅能分離得到Lactobacillus和Enterococcus，同時(shí)還分離出多種Canobacterium菌株[13]。Sugita等[14]從魚(yú)腸道分離出Aeromonas caviae、A. hydrophila、Pseudomonas spp.及Clostridium spp.等細(xì)菌對(duì)部分氣單胞菌屬及人源病原菌顯示不同程度的抗菌效果。目前，國(guó)內(nèi)外從水產(chǎn)品中分離篩選具有抑菌效果肉桿菌的研究也有報(bào)道，Ring等[15]從大西洋鮭魚(yú)、嘉魚(yú)等4 種魚(yú)腸道中篩選到7 株棲魚(yú)肉桿菌（C. piscicola）和3 株廣布肉桿菌（C. divergens），分析了它們對(duì)水產(chǎn)品致病菌的抗菌特性，研究表明這些肉桿菌能夠產(chǎn)生有效拮抗水產(chǎn)品中腐敗菌和致病菌的抗菌肽。然而，肉桿菌在帶給人們益處的同時(shí)也出現(xiàn)了一些亟待解決的問(wèn)題，如有些肉桿菌產(chǎn)生了抗生素耐藥性或自身存在天然耐藥性，肉桿菌耐藥性與食品安全性相關(guān)問(wèn)題逐步引起了人們的關(guān)注，益生肉桿菌的安全性評(píng)估已十分必要。

新疆額爾齊斯河是我國(guó)唯一注入北冰洋水系的外流河，常年水溫在20 ℃以下，其中多產(chǎn)冷水魚(yú)類，為研究冷水魚(yú)腸道低溫肉桿菌提供了可靠來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)從新疆冷水魚(yú)腸道中分離篩選低溫肉桿菌，對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，篩選明顯具有抑菌活性的肉桿菌，對(duì)該菌株發(fā)酵上清液中組分進(jìn)行分析和該菌株對(duì)部分藥物的敏感性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期為低溫肉桿菌作為益生素在魚(yú)類飼料添加劑方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為食品的低溫貯藏保鮮及肉桿菌的安全性評(píng)估提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自新疆額爾齊斯河流域的冷水魚(yú)包括河鱸（Perca fluviatilus）、紅尾魚(yú)（Rasbora borapetensis）、銀鯽（Carassius auratus gibelio）、鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi）、黑斑狗魚(yú)（Esox reicherti）、叉尾斗魚(yú)（Macropodus opercuiaris）及高體雅羅魚(yú)（Leuciscus baicalensis）。每種魚(yú)按年齡、體質(zhì)量標(biāo)記后置于4 ℃冰箱保藏，12 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物 上海捷瑞生物有限公司；Marker 天根生化科技（北京）有限公司；PCR Master Mix、ddH2O生工生物工程（上海）股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜上海興亞凈化材料廠；培養(yǎng)基（Elliker、MRS、LB）、抗生素 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes CGMCC 1.9136）、大腸桿菌（Escherichia coli EPEC O127:K63 CICC 10411）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CICC 21600） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TC-512 PCR儀 德國(guó)Biometra公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

將處理好的冷水魚(yú)腸道樣品依次按10 倍梯度稀釋，分別選取10-2、10-3、10-4和10-5梯度的菌懸液均勻涂布于MRS和Elliker培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度涂布3 個(gè)平板，分別置于無(wú)氧和有氧的條件下，16 ℃培養(yǎng)3～5 d。發(fā)現(xiàn)菌懸液稀釋度為10-3時(shí)平板上菌落均勻明顯，且菌落數(shù)在30～300 CFU/皿之間。挑取平板表面單一菌落進(jìn)行劃線分離，傳代劃線培養(yǎng)3～4 次直至純化，對(duì)每個(gè)菌株進(jìn)行鏡檢，革蘭氏染色以及接觸酶實(shí)驗(yàn)，從而達(dá)到對(duì)疑似乳酸菌的初步分離篩選，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株生理生化鑒定

按照Dong Xiuzhu等[16]方法進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并做空白對(duì)照。

1.3.3 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

將篩選得到的菌株活化后按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別設(shè)4、15、18、24、30、37 ℃ 6 個(gè)溫度梯度，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA的提取根據(jù)Justé等[17]改良后的十六烷基三甲基溴化銨方法進(jìn)行。采用16S rRNA通用引物27f（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海美吉公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果被提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)（BLAST），采用CLUSTAL X1.83軟件排列對(duì)齊序列[18]并采用MEAG v.5.0[19]軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.5 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（repetitive polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜分析

指紋圖譜采用兩種rep-PCR引物BOXAIR和（GTG）5（表1）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液、80 V電壓下電泳3 h，置于凝膠成像儀下拍照，將得到的指紋圖譜使用Gel ComparII（Applied Maths, sint-Martens-Latem，Belgium）凝膠分析軟件依據(jù)UPGMA進(jìn)行聚類分析。

表1 rep-PCR引物和PCR條件Table 1 Primer sequences and reaction conditions used in rep-PCR

1.3.6 菌株無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備及抑菌活性菌株的初篩

將分離到的菌株活化后，按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，16 ℃振蕩培養(yǎng)48 h后，取2 mL發(fā)酵液離心（12 000×g，10 min，4 ℃）獲得上清液，并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾得到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用牛津杯法[20]對(duì)乳酸菌進(jìn)行抑菌活性的初篩。將指示菌株大腸桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL指示菌培養(yǎng)液于無(wú)菌生理鹽水中連續(xù)梯度稀釋，得到濃度約為106～107CFU/mL的稀釋液。取100 μL菌懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)基表面，將牛津杯輕輕按壓于其上，再向杯中加入200 μL無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，以不加菌的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，4 ℃預(yù)擴(kuò)散3 h后，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，測(cè)定抑菌圈直徑，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行，求平均值以確定抑菌能力。

1.3.7 對(duì)無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的處理

以單核細(xì)胞性李斯特菌作為指示菌，對(duì)乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液進(jìn)行以下處理：調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH 6.5后加入過(guò)氧化氫酶（質(zhì)量濃度為5 μg/mL），37 ℃水浴2 h；為明確無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)，向上清液中分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶（質(zhì)量濃度為1 mg/mL），37 ℃水浴2 h。以未經(jīng)任何處理的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液為空白對(duì)照進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平行測(cè)定3 次取平均值。

1.3.8 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)CLSI（2012）[21]，采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)肉桿菌進(jìn)行15 種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。吸取150 μL濃度為107～108CFU/mL的肉桿菌菌懸液，使用無(wú)菌棉簽將其均勻涂布于MRS瓊脂平板表面，待培養(yǎng)基表面干燥以后將藥片貼于其上，37 ℃倒置培養(yǎng)36 h，觀察抑菌結(jié)果，檢測(cè)抑菌圈直徑，每種抗生素藥片3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS 17.0軟件對(duì)糖發(fā)酵代謝情況進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析；采用Gel Compar II凝膠分析軟件進(jìn)行指紋圖譜聚類分析，熱圖的繪制采用Heml 1.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與鑒定

從7 種冷水魚(yú)腸道樣品中共分離出48 株純培養(yǎng)物，通過(guò)肉眼觀察菌落大小、顏色，鏡檢菌落形態(tài)以及革蘭氏染色和接觸酶實(shí)驗(yàn)確定疑似乳酸菌，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行16S rRNA序列分析，最終確定有15 株為肉桿菌，其中麥芽香肉桿菌（C. maltaromaticum）4 株，廣布肉桿菌（C. d i v e r g e n s）1 0 株，未鑒定的肉桿菌屬（Carnobacteriumsp.） 1 株。

2.2 菌株生理生化鑒定

根據(jù)Dong Xiuzhu等[16]的方法對(duì)15 株肉桿菌進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，糖發(fā)酵代謝結(jié)果使用SPSS軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，根據(jù)糖發(fā)酵代謝情況（表2）可以將肉桿菌菌株聚為7 類，其中菌株E-BYC-2、E-BYC-1和E-BYC-4聚在一起，碳源代謝情況相似，且僅能利用4 種糖類作為碳源，碳源利用率較低；菌株M17-HWYC-3和E-HBGC-4聚為一類，可以利用6 種糖類作為碳源，BS-JYC-3和E-HLM-6也聚在一起，可以利用7 種糖類，碳源利用率較高，而菌株E-BYC-3獨(dú)自成一分支，可以利用所有的糖、醇為碳源，菌株對(duì)碳源的不同利用情況可能與魚(yú)的不同種類及生活習(xí)性有關(guān)。將15 株肉桿菌分別置于不同溫度梯度下培養(yǎng)，最終結(jié)果表明菌株的最適生長(zhǎng)溫度為24～30 ℃，生長(zhǎng)溫度范圍為4～37 ℃，屬于耐冷菌范疇[22]，故從冷水魚(yú)腸道分離到15 株肉桿菌屬于低溫乳酸菌。

表2 肉桿菌糖發(fā)酵代謝譜Table 2 Sugar metabolism spectra of 15 Carnobacterium strains

2.3 基于rep-PCR指紋圖譜分析

圖1 基于rep-PCR擴(kuò)增的15 株肉桿菌的聚類圖Fig. 1 Dendrogram of 15 Carnobacterium strains according to their genetic profile obtained by rep-PCR

對(duì)15 株肉桿菌進(jìn)行rep-PCR指紋圖譜分析，采用Gel Compar II軟件將兩種不同引物對(duì)應(yīng)的指紋圖譜進(jìn)行聚類，由BOX-PCR和（GTG）5-PCR指紋聚類圖（圖1）可以清晰看出，15 株肉桿菌的指紋圖譜帶型較豐富，能夠反映菌株在種水平上的遺傳差異。其中BOX-PCR指紋圖譜的條帶主要集中在400～5 000 bp范圍內(nèi)，包括3～10 個(gè)明顯的亮帶，大多數(shù)產(chǎn)物的條帶數(shù)多于5 條，并有一些弱帶；（GTG）5-PCR指紋圖譜在350～5 000 bp范圍內(nèi)并有1～12 個(gè)相對(duì)明顯的條帶。比較由2 種不同引物產(chǎn)生的指紋圖譜可知，大多數(shù)PCR產(chǎn)物條帶在350～5 000 bp之間。

由圖1可知，在45%的相似性水平上，所有的菌株被聚類成4 簇，Cluster I由4 株C. maltaromaticum組成，其中菌株M17-GYM-3、M17-GYM-2和EB2-4的帶型相似，而菌株M17-HWYC-4的帶型與它們相差較大，尤其是（GTG）5-PCR擴(kuò)增的指紋圖譜條帶更為明顯。Cluster II和Cluster III都由C. divergens組成，在60%的相似性水平上均可被進(jìn)一步劃分為2 個(gè)小組，且每一小組指紋圖譜帶型相近。Cluster IV僅由1 株肉桿菌屬Carnobacteriumspp.組成，菌株E-BYC-3與其他菌株的帶型相差最大，獨(dú)自成一組。帶型統(tǒng)計(jì)顯示，4 株C. maltaromaticum有2 種帶型，10 株C. divergens有4 種帶型，Carnobacteriumspp.僅有1 種帶型。本實(shí)驗(yàn)中15 株肉桿菌遺傳多樣性豐富，這些肉桿菌種間具有明顯的差異，種內(nèi)帶型多樣，存在極高的遺傳多態(tài)性。

2.4 抑菌活性菌株的篩選

采用牛津杯法對(duì)15 株肉桿菌進(jìn)行抑菌活性的初篩，其中8 株肉桿菌對(duì)大腸桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用（表3）。

表3 具有抑菌活性肉桿菌的初篩結(jié)果Table 3 Primary screening of Carnobacterium for antibacterial activity

2.5 肉桿菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的抑菌物質(zhì)分析

表4 肉桿菌菌株的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液不同處理后對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌抑菌活性的影響Table 4 Effect of exclusion of organic acids and hydrogen peroxide on the antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants ofCarnobacterium strains against L. monocytogenes

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、抗菌肽和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，為明確肉桿菌發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)組成，以單核細(xì)胞性李斯特菌為指示菌，初篩得到8 株肉桿菌對(duì)其均有較好的抑制作用。經(jīng)酸排除后，如表4所示，菌株M17-GYM-3的抑菌能力明顯下降，而其余菌株的發(fā)酵上清液均具有明顯的抑菌能力，表明有機(jī)酸可能對(duì)菌株M17-GYM-3抑菌能力的影響較大；肉桿菌發(fā)酵上清液經(jīng)排除酸和過(guò)氧化氫后，仍具有明顯的抑菌能力，表明過(guò)氧化氫對(duì)菌株發(fā)酵上清液中抑菌活性的影響較小，其中菌株M17-HWYC-4和E-HBGC-4對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌的抑菌效果最為明顯。

對(duì)8 株肉桿菌發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理。如表5所示，除菌株BS-JYC-3經(jīng)胰蛋白酶處理抑菌活性未喪失外，其余菌株通過(guò)3 種酶的酶解實(shí)驗(yàn)后抑菌能力完全喪失，即肉桿菌發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對(duì)蛋白酶敏感，具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)[23]，抑菌物質(zhì)組分中可能存在類細(xì)菌素。

表5 3 種蛋白酶處理肉桿菌菌株發(fā)酵上清液后對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌抑菌活性的影響Table 5 Effect of digestion with three proteases on the antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants of Carnobacterium strains against L. monocytogenes

2.6 抑菌活性肉桿菌菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 基于16S rRNA序列肉桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of Carnobacterium based on 16S rRNA gene sequence

將8 株具有抑菌活性肉桿菌的16S rRNA部分基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取序列相似性高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2，該8 株乳酸菌菌株均屬于肉桿菌屬。其中菌株E-HLM-6、E-BYC-2、BS-JYC-3和E-BYC-1與C. divergens的序列相似性達(dá)99%，M-TZM-3、M17-HWYC-3、E-HBGC-4在同一分枝，與C. divergens親緣關(guān)系較近，菌株M17-GYM-3與已知種C. maltaromaticum的序列相似性達(dá)99%以上。

2.7 抗生素耐藥性分析

如圖3所示，8 個(gè)菌株對(duì)氨芐西林、米諾環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)敏感，對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、利福平、替考拉寧表現(xiàn)中度敏感，而所有的菌株對(duì)阿米卡星、氨曲南、苯唑西林、萬(wàn)古霉素和左氧氟沙星等幾種抗生素表現(xiàn)耐藥。

圖4 可以直觀反映8 株肉桿菌產(chǎn)生的抗生素抑菌圈直徑大小，宏觀反映乳酸菌的抗生素耐藥情況。顏色從藍(lán)色向綠色、黃色和紅色的漸變過(guò)程代表了抗生素抑菌圈直徑從小到大的遞增過(guò)程。從熱圖整體分析，藍(lán)色區(qū)域主要集中在苯唑西林、阿米卡星、萬(wàn)古霉素、替考拉寧、左氧氟沙星和氨曲南6 種抗生素中，表明這些抗生素對(duì)幾乎所有的菌株無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，即表現(xiàn)耐藥；而圖中多數(shù)顏色主要集中分布在綠色到紅色的漸變過(guò)程中，表明大部分菌株的抑菌圈直徑呈依次增大的趨勢(shì)，即抗生素耐藥情況呈中度敏感或敏感。從熱圖橫向分析，其中菌株M-TZM-3中紅色區(qū)域出現(xiàn)最多，表明有多種抗生素產(chǎn)生的抑菌圈直徑最大；菌株E-BYC-2和E-BYC-1的顏色區(qū)域分布相似，即它們的耐藥表型相近。從縱向分析，同種類型的抗生素耐藥性也可能不同，如青霉素類中苯唑西林所占的藍(lán)色區(qū)域遠(yuǎn)多于青霉素和氨芐西林，即苯唑西林耐藥性遠(yuǎn)大于青霉素和氨芐西林。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，能有效抑制食品中腐敗菌及致病菌的生長(zhǎng)，在開(kāi)發(fā)低溫微生物源生物保鮮劑方面極具應(yīng)用潛力[24]。分子生物學(xué)方法被越來(lái)越多地應(yīng)用于乳酸菌的分離與鑒定，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合乳酸菌的傳統(tǒng)分離鑒定方法，最終確定有15 株乳酸菌為肉桿菌。根據(jù)Morita[22]對(duì)耐冷菌的定義，15 株肉桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為24～30 ℃，屬于耐冷菌的范疇。本實(shí)驗(yàn)分離到的15 株肉桿菌，其中C. maltaromaticum 4 株，C. divergens 10 株，Carnobacterium spp. 1 株。rep-PCR指紋技術(shù)是一種快速、易于操作和可重復(fù)性的工具，具備高的分辨能力，可用于區(qū)分在種、亞種及菌株水平上的多種與食品相關(guān)的乳酸菌[25]。Gevers[25]和?vec[26]等采用該指紋圖譜技術(shù)研究了乳酸菌的遺傳分化，（GTG）5-PCR被發(fā)現(xiàn)是最適合乳酸菌高分辨率的鑒定方法，為更準(zhǔn)確地反映15 株肉桿菌菌株間的遺傳多樣性，本研究采用BOXAIR和（GTG）5兩種不同引物的rep-PCR指紋圖譜技術(shù)對(duì)篩選到的肉桿菌進(jìn)行遺傳差異性分析，發(fā)現(xiàn)15 株低溫肉桿菌種間具有明顯的差異，種內(nèi)帶型多樣，存在極高的遺傳多態(tài)性，與Bello等[27]的研究結(jié)果一致。

Martin-Visscher等[28]研究表明C. maltaromaticum UAL307發(fā)酵液的有效成分為IIa類細(xì)菌素，陳琳等[29]從植物乳桿菌KLDS1.0391的發(fā)酵液中截留出了細(xì)菌素，Tulini等[30]從魚(yú)中篩選出的C. maltaromaticum C2所產(chǎn)抗菌肽等物質(zhì)能有效抑制腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)從新疆冷水魚(yú)腸道中分離得到的每株肉桿菌進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，初篩得到8 株肉桿菌對(duì)病原菌有明顯的抑菌活性，從系統(tǒng)發(fā)育來(lái)看，7 株屬于C. divergens、1 株屬于C. maltaromaticum。以單核細(xì)胞性李斯特菌為指示菌，通過(guò)酸排除、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)及蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)最終確定肉桿菌的抑菌物質(zhì)成分中可能存在類細(xì)菌素。因此，對(duì)新疆冷水魚(yú)腸道中低溫肉桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的進(jìn)一步深入研究是非常關(guān)鍵的。

盡管致病性乳酸菌并不多見(jiàn)，但耐藥性問(wèn)題是乳酸菌在應(yīng)用安全方面的首要問(wèn)題[31]，菌株對(duì)抗生素的敏感性也是最主要的安全特性[32]。Liu Chang等[33]對(duì)46 株乳桿菌研究耐藥性發(fā)現(xiàn)這些菌株對(duì)氯霉素、紅霉素、四環(huán)素敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素、鏈霉素、慶大霉素耐藥。Temmerman等[34]對(duì)187 株乳酸菌檢測(cè)耐藥性，發(fā)現(xiàn)有30 株嗜熱鏈球菌對(duì)四環(huán)素、紅霉素、青霉素和氯霉素敏感，對(duì)卡那霉素、萬(wàn)古霉素耐藥。本研究采用紙片擴(kuò)散法對(duì)8 株具有抑菌活性的肉桿菌進(jìn)行15 種抗生素敏感性測(cè)定，結(jié)果表明，所有菌株對(duì)氨芐西林、米諾環(huán)素和氯霉素表現(xiàn)敏感，而對(duì)阿米卡星、氨曲南、苯唑西林、萬(wàn)古霉素和左氧氟沙星等幾種抗生素表現(xiàn)耐藥，這可能與魚(yú)類的生活習(xí)性、食物鏈及魚(yú)類生活的水體環(huán)境被污染等原因有關(guān)，也可能是部分菌株本身存在天然耐藥性[35]。后續(xù)將會(huì)對(duì)更多低溫肉桿菌的產(chǎn)細(xì)菌素特性及耐藥基因進(jìn)行更深入研究，以期為低溫肉桿菌作為益生素在魚(yú)類飼料添加劑方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為食品防腐保鮮技術(shù)及肉桿菌的安全性評(píng)估提供一定的參考依據(jù)。