富硒平菇多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)代謝的研究

郭 蕓，李海濤，趙玉明，馬 玲

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院 食品工程系，山西 太原 030031；2.山西省生物研究所，山西 太原 030006；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

富硒平菇多糖是從富硒平菇中提取出的一種含硒平菇多糖，是一種高分子多糖類的活性物質(zhì)，因其具有硒，所以生物功能活性較普通平菇多糖大大提高。有關(guān)硒多糖較高的抗氧化、提高免疫、抗腫瘤功能活性的報(bào)道很多[1-4]。一般的微生物不能直接利用多糖作為碳源，而益生菌可以利用其進(jìn)行生長(zhǎng)代謝并產(chǎn)生對(duì)人體有益的短鏈脂肪酸，從而發(fā)揮益生元的功效。有關(guān)多糖促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)代謝的報(bào)道較多，劉麗莎等[5]對(duì)白術(shù)多糖對(duì)益生菌的促生長(zhǎng)作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolesentis）、動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的促生長(zhǎng)效果最佳。趙玉萍[6]對(duì)真菌多糖促進(jìn)鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）生長(zhǎng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為15 g/L的真菌多糖可以顯著促進(jìn)鼠李糖乳桿菌的增殖，其活菌數(shù)最大可達(dá)到3.08×1010個(gè)/mL，能夠使發(fā)酵周期提前2～3 h。TADAYONI M 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，橡子粗多糖與菊粉相比可以顯著促進(jìn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A7的生長(zhǎng)。WANG X等[8]研究報(bào)道，油菜籽多糖可以促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)（雙歧桿菌（Bifidobacterium）、青春乳桿菌（Lactobacillus infantis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等），AKBARI-ALAVIJEH S等[9]研究發(fā)現(xiàn)，開(kāi)心果水溶性多糖促進(jìn)了植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）PTCC 1896和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的增殖，同時(shí)增加了乙酸、丙酸、丁酸的生成量。

本研究通過(guò)水提醇沉提取富硒平菇粗多糖，在植物乳桿菌和副干酪乳桿菌兩種益生菌培養(yǎng)中加入不同量的硒多糖，以菊粉為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)測(cè)定益生菌活菌數(shù)以及代謝過(guò)程中的產(chǎn)物，研究富硒平菇多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)代謝的影響，為富硒平菇多糖在益生菌中的應(yīng)用提供一些基礎(chǔ)理論，進(jìn)一步為開(kāi)發(fā)新型益生元、豐富益生菌代謝理論提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

平菇（硒含量37.81 mg/g干樣）、富硒平菇（硒含量622.47 mg/g干樣）：山西紫團(tuán)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨（生化試劑）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；牛肉浸膏、酵母膏（均為生化試劑）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水葡萄糖（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、無(wú)水乙酸鈉（均為分析純）：天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；菊粉（食品級(jí)）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酸化MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10g，酵母提取物5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.6。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP-9272恒溫培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；ST16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；FE28-Standard pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；CP114精密電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市城東新瑞儀器廠；1260 infinity型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 富硒平菇多糖的制備

將富硒平菇粉碎后按料水比1∶20（g∶mL）加入蒸餾水，在80 ℃條件下水浴攪拌提取3 h，抽濾后收集濾液，重復(fù)提取3次，將濾液合并后真空濃縮，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，4 000 r/min、10 min離心將沉淀取出，用適量水溶解后加入Sevag 溶液（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V）除蛋白，反復(fù)3次，用適量水溶解后對(duì)水透析48 h，冷凍干燥即得含硒粗多糖[10-11]，測(cè)得粗多糖硒含量為3.21 μg/g。普通平菇粗多糖按照同樣的方法提取，測(cè)得硒含量為0.38 μg/g。

1.3.2 富硒平菇多糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響

將植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別在MRS液體培養(yǎng)基中于37 ℃進(jìn)行活化，然后將活化好的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別以1%接種量（約106CFU/mL）接種于添加2%平菇多糖和0.5%、2.0%的富硒平菇多糖的無(wú)葡萄糖MRS培養(yǎng)基中，以添加2%菊粉作為陽(yáng)性對(duì)照，以添加2%葡萄糖的MRS作為普通對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h、48 h 后測(cè)定活菌數(shù)、pH以及有機(jī)酸生成量。

1.3.3 分析檢測(cè)

活菌數(shù)測(cè)定[12-13]：MRS 培養(yǎng)基，稀釋平板計(jì)數(shù)法；pH值的測(cè)定[14]：采用pH 計(jì)直接測(cè)定。

有機(jī)酸的測(cè)定[9，15]采用HPLC法，取發(fā)酵48 h的不同處理的發(fā)酵液，4 ℃條件下4 000 r/min離心20 min，上清液過(guò)0.22 μm的水膜，收集濾液進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件如下：色譜柱Accucore C18反向柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相0.015 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈溶液，用磷酸將pH調(diào)至2.7；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)定性，以峰面積計(jì)算各有機(jī)酸的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)益生菌菌落數(shù)的影響

不同處理對(duì)副干酪乳桿菌（A）及植物乳桿菌（B）菌落數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1A可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖對(duì)副干酪乳桿菌發(fā)酵不同時(shí)間后菌落數(shù)有很大的影響，以2%葡萄糖作為對(duì)照組，發(fā)酵24 h后普通平菇多糖、不同濃度的富硒平菇多糖都使得副干酪乳桿菌的菌落數(shù)增加但差異不顯著（P＞0.05），而菊粉組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.9）增加顯著（P＜0.05），0.5%富硒平菇多糖組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.6）較2%富硒平菇多糖組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.4）促進(jìn)效果更好，但都低于2%菊粉的促進(jìn)效果。說(shuō)明適當(dāng)濃度的硒多糖促進(jìn)了副干酪乳桿菌的增殖，而較高濃度硒多糖會(huì)一定程度抑制其增殖。培養(yǎng)48 h后的副干酪乳桿菌其菌落數(shù)都相應(yīng)較24 h降低，進(jìn)一步證明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)減少限制了副干酪乳桿菌的增殖，有一部分菌還會(huì)受到代謝產(chǎn)物的損失而死亡。但各多糖組菌落數(shù)仍然顯著高于葡萄糖對(duì)照組（P＜0.05），2%硒多糖組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.3）顯著高于普通多糖組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.1）（P＜0.05），同時(shí)也高于菊粉組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.2）（P＞0.05），充分說(shuō)明添加硒多糖后有利于長(zhǎng)時(shí)發(fā)酵條件下保持益生菌的活性，可能與硒對(duì)菌體在不良環(huán)境下的脅迫具有較好的保護(hù)作用有關(guān)，可能與硒被益生菌吸收后提高了自身的抗氧化酶的活性有關(guān)，也可能與發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸等作用有關(guān)[14，16]。

圖1 不同處理對(duì)副干酪乳桿菌（A）及植物乳桿菌（B）菌落數(shù)的影響Fig.1 Effect of different treatments on the viable count of Lactobacillus paracasei(A)and Lactobacillus plant(B)

由圖1B可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖對(duì)植物乳桿菌菌落數(shù)的影響不同，不同的培養(yǎng)時(shí)間也對(duì)植物乳桿菌菌落數(shù)的影響不同，以2%葡萄糖作為對(duì)照，發(fā)酵24 h后各處理組植物乳桿菌的菌落數(shù)顯著增加（P＜0.05），其中0.5%的富硒平菇多糖組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.4）高于其他處理組，但低于2%菌粉組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.6），發(fā)酵48 h后各處理組的菌數(shù)都相應(yīng)下降，平菇多糖及富硒平菇多糖組菌數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中2%的富硒平菇多糖組（活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.3）顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.2 不同處理對(duì)pH的影響

不同處理對(duì)副干酪乳桿菌及植物乳桿菌pH的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2A可知，添加平菇多糖和富硒平菇多糖對(duì)副干酪乳桿菌發(fā)酵后pH的影響不同，不同的培養(yǎng)時(shí)間也對(duì)副干酪乳桿菌pH的影響不同。發(fā)酵24 h后，以2%葡萄糖作為對(duì)照組（pH 4.1），2%普通平菇多糖（pH 4.6）和0.5%、2%富硒平菇多糖組（pH 4.4，pH 4.7）pH下降不明顯，而2%菊粉組經(jīng)副干酪乳桿菌發(fā)酵后pH（pH 3.9）較低。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理下副干酪乳桿菌發(fā)酵液的pH進(jìn)一步降低，但各處理組pH（pH分別為4.2、4.3、4.1）都高于對(duì)照組（pH 3.9）。

圖2 不同處理對(duì)副干酪乳桿菌（A）及植物乳桿菌（B）發(fā)酵液pH值的影響Fig.2 Effect of different treatments on the pH of fermentation borth by Lactobacillus paracasei (A) and Lactobacillus plant (B)

由圖2B可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵后pH的影響不同，不同的培養(yǎng)時(shí)間也對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵后pH的影響不同，發(fā)酵24 h后，與2%葡萄糖（pH 4.1）作為對(duì)照，2%普通平菇多糖（pH 4.6）和不同濃度的富硒平菇多糖（pH 4.4、4.7）對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵后pH值下降不明顯，都較菊粉組pH值高。經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵后各組pH值都進(jìn)一步降低，說(shuō)明培養(yǎng)基中的多糖都可以被植物乳桿菌進(jìn)一步利用，仍然以菊粉組的pH值（pH 3.5）最低，各多糖組pH值都高于對(duì)照組，而其中2%平菇多糖和0.5%富硒平菇多糖pH值接近（pH 4.3）。

2.3 不同處理對(duì)有機(jī)酸的影響

多糖一般不能被胃腸液中的酶分解，一般的細(xì)菌也很難利用其進(jìn)行生長(zhǎng)，而益生菌可以利用其代謝生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，其中的丙酸作為糖異生的前體底物對(duì)糖尿病人和肥胖癥有很好的功效[15]，乙酸在糖異生和脂代謝中扮演信號(hào)分子的作用，丁酸通過(guò)營(yíng)養(yǎng)結(jié)腸細(xì)胞近而起到預(yù)防結(jié)腸癌的作用[17]，因而分析益生菌在生長(zhǎng)過(guò)程中生成的短鏈脂肪酸是評(píng)價(jià)其益生作用的一個(gè)重要方面[18-19]，益生菌利用多糖發(fā)酵的速率取決于自身的酶系統(tǒng)和多糖的結(jié)構(gòu)以及多糖的聚合度[9，20]。副干酪乳桿菌和植物乳桿菌兩種益生菌在添加不同濃度多糖后發(fā)酵48 h生成有機(jī)酸結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖都提高了副干酪乳桿菌和植物乳桿菌代謝生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸四種有機(jī)酸含量，其中添加0.5%富硒平菇多糖顯著提高了副干酪乳桿菌發(fā)酵后生成甲酸和丙酸的含量（P＜0.05），而2%富硒平菇多糖顯著提高了副干酪乳桿菌發(fā)酵生成甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量（P＜0.05），且最終濃度與2%菊粉差異不顯著（P＞0.05），充分說(shuō)明平菇硒多糖可以促進(jìn)副干酪乳桿菌發(fā)酵后代謝形成短鏈有機(jī)酸，從而實(shí)現(xiàn)益生功能。與2%葡萄糖相比，添加0.5%富硒平菇多糖的植物乳桿菌發(fā)酵48 h后丁酸、乙酸、丙酸的含量顯著增加（P＜0.05），而添加2%富硒平菇多糖的植物乳桿菌發(fā)酵48 h后丁酸、甲酸、乙酸、丙酸的含量分別顯著增加到0.41 mg/mL、0.49 mg/mL、3.61 mg/mL、4.25 mg/mL（P＜0.05），但與2%菊粉組差異不顯著（P＜0.05）。

表1 不同處理組發(fā)酵48 h后有機(jī)酸的含量Table 1 Contents of organic acids after fermentation for 48 h with different treatments mg/L

3 結(jié)論

2%富硒平菇多糖對(duì)發(fā)酵48 h副干酪乳桿菌的增殖效果優(yōu)于菊粉，對(duì)植物乳桿菌的增殖效果與菊粉相當(dāng)。平菇多糖和富硒平菇多糖促進(jìn)了副干酪乳桿菌和植物乳桿菌代謝生成短鏈有機(jī)酸的含量，其中2%富硒平菇多糖的促進(jìn)作用更強(qiáng)，兩種益生菌發(fā)酵后的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分別比對(duì)照組（2%葡萄糖）提高了的340%、32.5%、43.4%、51.4%和122.7%、186.5%、183.3%、412.5%。發(fā)酵48 h后2%富硒平菇多糖能夠保持較高的益生菌數(shù)量。平菇多糖和富硒平菇多糖經(jīng)過(guò)兩種益生菌發(fā)酵后pH下降不明顯，但兩種多糖有效促進(jìn)了兩種益生菌代謝生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的水平，富硒平菇多糖促進(jìn)作用更好，益生作用更強(qiáng)。