高產蟲草酸蛹蟲草菌株的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

唐賢華，張崇軍，隋 明，2，周 文，2，舒學香

（1.四川工商職業(yè)技術學院 酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830；2.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草、蠶蛹草、東北蟲草等，屬于子囊菌門（Ascomycota）、麥角菌目（Clavicipitales）、麥角菌科（Clavicinitaccac）、蟲草屬（Cordyceps）[1]。蛹蟲草由子實體與菌核兩部分構成，在自然條件下生長主要包括蟲草菌絲體和子實體的生長，通過孢子對昆蟲幼蟲的感染，使孢子分裂產生菌絲體并且昆蟲本身作為營養(yǎng)物質提供其生長所需營養(yǎng)，在昆蟲的體外進行發(fā)育和分化菌絲形成子座[2]。蛹蟲草作為一種名貴的中藥材，含有豐富的生物活性物質，如蟲草酸、蟲草素、多糖、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、蛋白質和氨基酸等[3-4]。其中蟲草酸是蛹蟲草主要活性成分之一，其能抑制各種病菌的成長，可預防與治療腦血栓、腦出血、心肌梗塞、長期衰竭。蟲草酸含量的高低是衡量蛹蟲草質量的主要標準之一，一般認為蟲草酸含量高的蟲草的藥用價值高[5]。

目前關于產蟲草酸蛹蟲草菌株的研究較少，萬琴等[6]采用搖瓶培養(yǎng)的方法，通過單因素和正交試驗，以生物量和蟲草酸含量為評價指標，確定了蛹蟲草液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件；雷幫星等[7]采用靜置培養(yǎng)實驗方法培養(yǎng)蟲草菌株，測定蟲草多糖和蟲草酸的產量，獲得了培養(yǎng)基最優(yōu)組合和最佳培養(yǎng)工藝參數(shù)；刁朝強等[8]采用大米米飯固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出蛹蟲草子實體并進行了培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)子實體中的蟲草素含量明顯高于培養(yǎng)基中蟲草素的含量；馬婕馨等[9]以4種蛹蟲草菌株為研究對象，以生物量和SOD活性為指標，篩選出SOD高活性菌株，并對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，使發(fā)酵液中的SOD活性得到顯著提高。有研究表明，通過液態(tài)培養(yǎng)得到的蛹蟲草菌絲體有效成分與蛹蟲草子實體相同[10]，且培養(yǎng)條件對發(fā)酵產物的形成產生有重要的影響，合理的培養(yǎng)工藝參數(shù)將大大提高培養(yǎng)液中生物活性物質的生成。

本試驗采用組織分離育種法從蛹蟲草中分離篩選高產蟲草酸的菌株，通過分子生物學技術對其進行鑒定，并采用響應面試驗優(yōu)化其產蟲草酸的條件，為蛹蟲草液體深層發(fā)酵的工業(yè)化生產應用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蛹蟲草子實體：四川綿陽市食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[11]：土豆200g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、維生素B1（vitamin B1，VB1）0.01 g/L、瓊脂20 g/L，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至80 ℃左右后加入質量濃度為50μg/mL的硫酸鏈霉素和青霉素鈉。

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基[12]：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、VB10.01 g/L，初始pH6.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博生物技術有限責任公司；MgSO4·7H2O、KH2PO4（均為分析純）：天津市北晨方正試劑廠；硫酸鏈霉素、青霉素鈉（均為分析純）：南京奧多福尼生物科技有限公司；醋酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鉀、L-鼠李糖、濃鹽酸、無水乙醇（均為分析純）：重慶川東化工（集團）有限公司；蟲草酸（分析純）：上海士鋒科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒：美國Omega公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物純化試劑盒：杰瑞生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；Y60立式壓力蒸汽滅菌鍋：寧波久興醫(yī)療器械有限公司；SW-CG-1F型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；DK-S28恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9015A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；HZQ-2全溫振蕩器：江蘇金怡儀器科技有限公司；T100型PCR儀：杭州博日科技有限公司；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-rad公司；UV-3300（PC）紫外可見分光光度計：上海凌析儀器有限公司；TGL16M離心機：上海赫田科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離、純化

采用組織分離育種法[13]對蛹蟲草中的菌株進行分離純化。先用蒸餾水沖洗蛹蟲草的菌核表面、子座頭及子座柄，在超凈工作臺里用0.1%升汞浸泡1～2 min，再用無菌水沖洗蛹蟲草表面以除掉多余的升汞并用濾紙吸干表面的水分。將蛹蟲草子實體各個部分用無菌小刀分割成1 mm3的立方小塊，用鑷子把蛹蟲草子實體的小塊組織轉移到PDA培養(yǎng)基上，于23～25 ℃條件下進行培養(yǎng)。用滅菌的接種環(huán)挑取萌發(fā)的菌絲體，在PDA培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)至單菌落。挑取單菌落接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基中，于23～25 ℃條件下培養(yǎng)，待菌絲體長滿試管后存放于4 ℃冰箱。

1.3.2 菌株的篩選

用接種針從試管斜面培養(yǎng)基中挑取約1 cm2的菌塊接種于種子培養(yǎng)基，于25 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)86 h作為種子液。將種子液以8%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基，于25 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵72 h，采用分光光度法[14]測量菌液中蟲草酸的含量，篩選出蟲草酸高產菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

參照文獻[15-16]提取菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對菌株的ITS序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL，MgCl22 μL，10 μmol/L正向引物0.5 μL，10 μmol/L反向引物0.5 μL，5 U/μL EXTaq酶0.5 μL，DNA模板0.3 μL，雙蒸水（ddH2O）16.7 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行檢驗，采用PCR擴增產物純化試劑盒進行產物回收、純化后送至上海生工有限公司進行測序。測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS序列，采用MEGA 6.0中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株產蟲草酸培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

挑取面積為1 cm2左右的菌苔接種于種子培養(yǎng)基，裝液量為90 mL/250 mL，在25 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h。將種子液按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量80 mL/250 mL，24 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h。在此基礎上，采用單因素輪換法依次考察接種量（6%、8%、10%、12%、14%、16%）、初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、培養(yǎng)溫度（18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃）、轉速（130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min、180 r/min）4個因素對菌株產蟲草酸的影響。采用分光光度法[14]測定培養(yǎng)液中蟲草酸的含量，平行試驗3次，確定菌株產蟲草酸的最佳培養(yǎng)條件。

1.3.5 菌株產蟲草酸培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以接種量（A）、初始pH值（B）、培養(yǎng)溫度（C）和轉速（D）為考察因素，蟲草酸含量（Y）為評價指標，采用Box-Behnken響應面試驗設計法[17-21]進行4因素3水平優(yōu)化試驗，其因素與水平見表1。

表1 菌株產蟲草酸培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for culture conditions optimization of cordycepic acid-producing strain

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件對數(shù)據(jù)進行回歸擬合，作出響應曲面圖，并進行線性回歸和方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選結果

通過組織分離育種法從蛹蟲草子實體中分離得到6株菌株，根據(jù)6株真菌的蟲草酸產量篩選得到一株產白色絨毛狀菌絲的高產蟲草酸蛹蟲草菌株YCC-1，其培養(yǎng)液中蟲草酸含量為101.83 mg/g。

2.2 菌株YCC-1的分子生物學鑒定結果

通過PCR擴增獲得菌株YCC-1的ITS基因序列，其堿基長度為568 bp。將測序結果提交至NCBI，采用MEGA 6.0中的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。由圖1可知，菌株YCC-1與蛹草擬青霉（Paecilomyces militaris）聚于同一分支，其序列同源性為98%。因此，將菌株YCC-1鑒定為蛹草擬青霉菌（Paecilomyces militaris）。

圖1 基于ITS序列菌株YCC-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain YCC-1 based on ITS sequences

2.3 菌株YCC-1產蟲草酸培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 接種量對菌株YCC-1產蟲草酸的影響

不同接種量對菌株YCC-1產蟲草酸的影響結果見圖2。

圖2 不同接種量對菌株YCC-1產蟲草酸的影響Fig.2 Effect of different inoculum on cordycepic acid production by strain YCC-1

由圖2可知，當接種量為4%～8%時，蟲草酸含量隨接種量的增加而增加；當接種量為8%時，蟲草酸含量達到最大，為102.33 mg/g；當接種量＞10%之后，隨著接種量的增加，蟲草酸含量大幅減少。分析原因可能是當接種量過小時，在發(fā)酵終點，培養(yǎng)基中所添加的營養(yǎng)物質沒有被完全利用，降低了利用率；當接種量過大時，還未到發(fā)酵終點，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質不能夠支撐菌體代謝產物的生成。因此，確定最佳接種量為8%。

2.3.2 初始pH值對菌株YCC-1產蟲草酸的影響

不同初始pH值對菌株YCC-1產蟲草酸的影響結果見圖3。

圖3 不同初始pH值對菌株YCC-1產蟲草酸的影響Fig.3 Effect of different initial pH on cordycepic acid production by strain YCC-1

由圖3可知，當初始pH值為4.0～6.0時，蟲草酸含量隨初始pH值的升高而升高；當初始pH值為6.0時，蟲草酸含量達到最大，為106.15 mg/g；當初始pH值＞6.0之后，蟲草酸含量逐漸減少。分析原因可能是隨著pH值過高或過低，都不利于蛹蟲草菌絲體的生長和生物活性物質的生成，并影響蟲草酸的含量。因此，確定最佳初始pH值為6.0。

2.3.3 發(fā)酵溫度對菌株YCC-1產蟲草酸的影響

蛹蟲草屬于中低溫生長菌，菌絲體的萌發(fā)溫度為20～23 ℃，較高的溫度會影響蛹蟲草的正常代謝活動，而較低的溫度又不利于蛹蟲草菌絲體的形成和生物活性物質的產生，因此，維持發(fā)酵過程中適宜菌體生長代謝的溫度具有重要意義[17]。不同發(fā)酵溫度對菌株YCC-1產蟲草酸的影響結果見圖4。

圖4 不同發(fā)酵溫度對菌株YCC-1產蟲草酸的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on cordycepic acid production by strain YCC-1

由圖4可知，在不同的發(fā)酵溫度下，菌株YCC-1的生長情況差別很大。當發(fā)酵溫度為18～24 ℃時，蟲草酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增大；當發(fā)酵溫度為24 ℃時，蟲草酸含量最高，為123.3 mg/g；當發(fā)酵溫度＞24 ℃之后，蟲草酸含量逐漸降低，表明適當提高溫度會加速菌絲體的生長，并有利于蟲草酸分子轉移到培養(yǎng)液中，但溫度過高會抑制菌絲體的生長和影響蟲草酸的含量。因此，確定菌株YCC-1的最佳發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.3.4 轉速對菌株YCC-1產蟲草酸的影響

轉速對菌株YCC-1產蟲草酸的影響結果見圖5。

圖5 轉速對菌株YCC-1產蟲草酸的影響Fig.5 Effect of rotational speed on cordycepic acid production by strain YCC-1

蛹蟲草的液體發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，適當?shù)膿u床轉速可以增加發(fā)酵液中的溶氧量，促進菌絲體的生長。由圖5可知，當轉速為140 r/min時，蟲草酸含量達到最大，為127.4 mg/g；當轉速＜140 r/min之前，隨著搖床轉速的增大，蟲草酸含量較快增加；當轉速＞140 r/min之后又較快下降，說明不同搖床轉速對發(fā)酵液蟲草酸生成影響較大。綜合考慮，選擇發(fā)酵搖床轉速為140 r/min。

2.4 菌株YCC-1產蟲草酸培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，選取接種量（A）、初始pH值（B）、培養(yǎng)溫度（C）、轉速（D）為考察因素，以蟲草酸含量（Y）為響應值，利用Minitab軟件進行Box-Behnken試驗設計，試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.4.2 回歸方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.06軟件對表2的試驗結果進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：Y=129.33-1.58A+0.17B+1.42C+0.50D+2.25AB-1.50AC+1.75BC-2.00BD+0.050CD-8.96A2-11.33B2-3.21C2-4.33D2

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型P值為0.000 1＜0.01，極顯著；失擬項P值為0.464 4＞0.05，不顯著，表明該模型可靠。該模型的決定系數(shù)R2=0.961 2，說明該模型能解釋96.12%響應值的變化，校正決定系數(shù)R2adj=0.916 0，說明該模型擬合程度較好[18]，試驗誤差較小，因此，可用此模型對菌株YCC-1產蟲草酸的培養(yǎng)條件進行分析和預測。

通過方差分析[19]可知，影響菌株YCC-1產蟲草酸的因素的主次順序為A＞C＞D＞B，即接種量＞培養(yǎng)溫度＞轉速＞初始pH值，與前面的單因素試驗結果有一定的差異，可能是在響應面優(yōu)化試驗過程中，由于發(fā)酵工藝和單因素試驗條件差異較大，使影響菌株產蟲草酸的因素發(fā)生變化。模型的一次項A、C、交叉項AB、BC、BD對結果影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響均不顯著（P＞0.05）。

2.4.3 響應面分析

各個因素間的交互作用對菌株YCC-1產蟲草酸的影響的響應曲面及其等高線見圖5。

等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素間交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[20]。由圖5可知，接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度和轉速間的交互作用對菌株YCC-1產蟲草酸的影響的響應面均呈拋物面型，說明所得到的響應面都存在一個極大值點，其中接種量、轉速、培養(yǎng)溫度分別與初始pH值的交互作用的等高線呈橢圓形，對結果影響顯著（P＜0.05），與方差結果分析一致。

圖5 接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度、轉速對菌株YCC-1產蟲草酸的影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of inoculum,initial pH,culture temperature and rotational speed on cordycepic acid production by strain YCC-1

經(jīng)過響應面優(yōu)化，根據(jù)二次多項回歸方程得到理論上菌株YCC-1產蟲草酸的最佳培養(yǎng)條件：接種量7.78%、初始pH值6.01、培養(yǎng)溫度24.76 ℃、轉速140.7 r/min，在此最優(yōu)條件下，蟲草酸含量的理論值為129.62 mg/g。考慮到實際操作的可行性，將上述最優(yōu)條件修訂為接種量7.8%、初始pH值6.0、培養(yǎng)溫度25 ℃、搖床轉速140 r/min。

2.4.4 驗證試驗

為了驗證該模型的有效性及實用性，在此最佳提取條件下對該模型做3次驗證試驗，結果測得蟲草酸含量為132.65 mg/g，與預測結果基本一致，因此，該模型能較好地預測該菌株的實際培養(yǎng)狀況。

3 結論

本研究以蛹蟲草子實體為研究對象，采用組織分離法從中分離得到一株高產蟲草酸的菌株YCC-1，通過分子生物學技術鑒定其為蛹草擬青霉（Paecilomyces militaris）。通過單因素及響應面試驗優(yōu)化得到菌株YCC-1產蟲草酸的最佳培養(yǎng)條件為接種量7.8%、初始pH值6.0、培養(yǎng)溫度25 ℃、搖床轉速140 r/min。在此最優(yōu)條件下，蟲草酸含量可達到132.65 mg/g，較優(yōu)化前提高了22.86%，為該菌株的深層發(fā)酵試驗研究和工業(yè)化應用奠定了良好的基礎。