利用紙層析-分光光度法檢測(cè)甲基營(yíng)養(yǎng)菌5222產(chǎn)L-絲氨酸

張建云，谷立坤，崔芽芽，韓夢(mèng)霞，彭 更，史永勝

（1.河南工程學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 451191；2.河南工程學(xué)院 煤化工資源綜合利用與污染治理河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 451191）

L-絲氨酸（L-serine）化學(xué)結(jié)構(gòu)為HO-CH2CH（NH3）-COOH，分子質(zhì)量為105.10，化學(xué)名為α-氨基-β-羥基丙酸，是一種含羥基的中性氨基酸[1]。L-絲氨酸雖屬人體非必需氨基酸，但卻具有許多重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求量日益增高[2]。目前，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)L-絲氨酸的方法主要有發(fā)酵法[3]、酶轉(zhuǎn)化法[4]、提取法[5]和化學(xué)合成法等[6]。其中，發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的方法是微生物利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)直接產(chǎn)生L-絲氨酸。發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的菌株幾乎都是細(xì)菌，且產(chǎn)量不高，這是由于L-絲氨酸處于代謝的中間階段，代謝速率非常快，不易積累。酶轉(zhuǎn)化法是微生物培養(yǎng)到一定程度后，將產(chǎn)物的前體物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，在微生物酶的作用下，生成L-絲氨酸。甘油酸、甘氨酸均可作為發(fā)酵前體物[7]。

目前，可以用來(lái)檢測(cè)L-絲氨酸含量的方法有高效液相色譜法[8]、氨基酸自動(dòng)分析儀[9]、紙層析-分光光度法[10]、變色酸-分光光度法[11-12]、茚三酮顯色法[13-14]等。前兩種方法對(duì)儀器設(shè)備要求高、衍生步驟繁瑣，操作不方便，對(duì)于樣品多，工作量大的絲氨酸的分離及絲氨酸生產(chǎn)菌的篩選并不適合。茚三酮顯色法是利用絲氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱生成紫紅色縮合物質(zhì)，其縮合物的顏色隨絲氨酸含量的變化而有所不同進(jìn)行檢測(cè)，但該方法顯色的靈敏度比較差，不適合用常規(guī)的分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，只能使用專門(mén)針對(duì)低含量樣品設(shè)計(jì)的722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)[15]。紙層析分光光度法和變色酸分光光度法操作簡(jiǎn)單，成本低，顯色的靈敏度高，在常規(guī)的分光光度計(jì)上即可檢測(cè)，適用范圍較為廣泛。

甲基營(yíng)養(yǎng)菌（Methylobacteriumsp.）指的能夠利用甲基化合物（甲烷、甲醛、甲醇、甲酸、甲基胺類(lèi)等）為其唯一的碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的一類(lèi)微生物。據(jù)估計(jì)，每年大概有83～273百萬(wàn)噸甲醇，600百萬(wàn)噸甲烷釋放到大氣中，此外，甲基胺類(lèi)也廣泛存在于海洋和淡水環(huán)境中[16]。由于甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物能夠?qū)⒆匀唤缛≈槐M、用之不竭的一碳化合物變?yōu)樘荚春湍茉?，可以解決發(fā)酵過(guò)程中糖原料的限制并且拓石化原料的應(yīng)用范圍（我國(guó)年產(chǎn)甲醇5 000萬(wàn)t，主要以煤制甲醇為主，國(guó)內(nèi)甲醇的需求量為2 000萬(wàn)t每年，產(chǎn)能過(guò)剩[17]），因此，對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的代謝研究具有重大意義。

絲氨酸是甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的一種重要代謝產(chǎn)物。大部分能夠利用甲醇的甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌具有L-絲氨酸代謝途徑[18-19]，它們可以通過(guò)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（serine hydroxymethyl transferase，SHMT）來(lái)同化單碳化合物與甘氨酸生產(chǎn)L-絲氨酸[20-21]。本實(shí)驗(yàn)室篩選了多株能夠以甲醇為碳源的甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，為了檢測(cè)它們是否能產(chǎn)L-絲氨酸以及產(chǎn)L-絲氨酸的水平，亟需建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的測(cè)定L-絲氨酸含量的方法。由于甲基營(yíng)養(yǎng)菌主要通過(guò)轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中的底物甘氨酸來(lái)生成L-絲氨酸，還需要檢測(cè)發(fā)酵液中甘氨酸的殘留情況來(lái)確定菌株對(duì)甘氨酸的轉(zhuǎn)化能力，而紙層析分光光度法能夠同時(shí)檢測(cè)出甘氨酸和L-絲氨酸的含量來(lái)反映菌株對(duì)底物的轉(zhuǎn)化情況。由于轉(zhuǎn)化體系與發(fā)酵液組分的差異，一些常用的氨基酸層析展開(kāi)劑并不適合L-絲氨酸和甘氨酸的分離和含量測(cè)定。由此，本研究通過(guò)優(yōu)化層展劑的種類(lèi)、洗脫溫度、洗脫時(shí)間等因素，建立一種L-絲氨酸檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)該檢測(cè)方法的精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等方法學(xué)考察，最終確定該方法的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室篩選的甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌產(chǎn)L-絲氨酸的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)中所用的菌種均來(lái)自課題組保藏菌種，所用菌株為甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌（Methylobacteriumsp.）5222。

1.1.2 化學(xué)試劑

甘氨酸（純度＞99.0%）、L-絲氨酸（純度＞99.0%）：美國(guó)Amresco公司；茚三酮（分析純）：西隴化工股份有限公司；丙酮、正丁醇、二乙胺（均為分析純）：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀7.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，無(wú)水氯化鈣0.015 g/L，氯化鈉0.5g/L，硫酸銨2g/L，加蒸餾水1L。121℃高壓蒸汽滅菌20min。

接菌前加入過(guò)濾除菌后的甲醇達(dá)到0.7%（V/V）為宜。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25B型數(shù)字酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：上海藍(lán)豹實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HC-2064高速臺(tái)式離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LDZM-60KCS-II立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA2204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱、THZ-300臺(tái)式恒溫?fù)u床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液及發(fā)酵液的制備方法

甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌種子液的制備：從平板上挑取單菌落于0.7%甲醇（V/V）裝液量為5 mL/25 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于34 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h，終止發(fā)酵，即得種子培養(yǎng)液。

甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌發(fā)酵液的制備：將1%甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌種子液接種于含0.7%甲醇（V/V）裝液量為50 mL/300 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于34 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h，然后在無(wú)菌條件下加入過(guò)濾除菌的甘氨酸母液至終質(zhì)量濃度為5 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止發(fā)酵即得發(fā)酵液。

1.3.2 紙層析-分光光度法測(cè)定氨基酸含量

（1）主要試劑和溶液的配制

展開(kāi)劑：①正丁醇∶丁酮∶濃氨水∶水=4∶3∶2∶1（V/V）、②丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶10∶2∶5（V/V）、③正丁醇∶乙酸∶水=12∶3∶5（V/V）、④乙醇∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶15∶5∶8（V/V）；顯色劑：稱取0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中；洗脫液：0.1%硫酸銅∶體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇=2∶38（V/V）?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

10 g/LL-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取1.0 gL-絲氨酸溶解于蒸餾水并定容至100 mL；10 g/L甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取1.0 g甘氨酸溶解于蒸餾水并定容至100 mL；100 g/L甘氨酸母液的配制：稱取10.0 g甘氨酸溶解于蒸餾水并定容至100 mL。

（2）紙層析-分光光度法測(cè)定

點(diǎn)樣：將濾紙裁成9 cm×28 cm大小，用鉛筆在距濾紙底端2 cm的地方劃一道基線，在線上每隔2 cm，畫(huà)上一個(gè)小點(diǎn)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。將待測(cè)氨基酸樣品點(diǎn)樣于濾紙上所標(biāo)點(diǎn)的中心位置，點(diǎn)樣量為0.2～2.0 μL（樣品中氨基酸的含量為5～20 μg為宜）。

層析、顯色：展開(kāi)劑于層析缸中密封靜置，待所點(diǎn)樣液風(fēng)干后，將濾紙放于層析杠中，并密封缸口。待層析液上行展開(kāi)至距濾紙頂端1.0 cm左右時(shí)，取出層析紙后吹風(fēng)機(jī)吹干，將顯色劑用噴霧器均勻噴灑于層析紙上，置于烘箱中105 ℃顯色5 min，取出。

比移值（retardation factor，Rf）為斑點(diǎn)中心距原點(diǎn)的距離與溶劑展開(kāi)前沿距原點(diǎn)距離的比值，其計(jì)算公式如下：

Rf值=斑點(diǎn)中心移動(dòng)距離/溶劑前沿移動(dòng)距離

洗脫：待斑點(diǎn)完全顯出后，剪下氨基酸斑點(diǎn)置于具塞玻璃管中，用5.0 mL洗脫液靜置洗脫30 min后，得洗脫液。并在752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定其吸光度值。

（3）L-絲氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)樣于濾紙上所標(biāo)點(diǎn)的中心位置，點(diǎn)樣量依次為0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL，層析、顯色并洗脫后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，以L-絲氨酸質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)繪制L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作同上。

（4）發(fā)酵液中氨基酸含量的測(cè)定

將發(fā)酵液在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取出上清液，點(diǎn)樣2.0 μL于層析濾紙上展開(kāi)、顯色。根據(jù)L-絲氨酸和甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣展開(kāi)的Rf值定性判斷發(fā)酵液中是否含有這兩種氨基酸，若含有L-絲氨酸和甘氨酸，再剪下顯色斑點(diǎn)洗脫，測(cè)定吸光度值，根據(jù)L-絲氨酸和甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出發(fā)酵液中L-絲氨酸和甘氨酸含量。

1.3.3 紙層析-分光光度法精確性和準(zhǔn)確性測(cè)試

通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)和回收率實(shí)驗(yàn)來(lái)確定方法的精確性和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 展開(kāi)劑的選擇

為了使L-絲氨酸和甘氨酸兩種氨基酸成功分離，各自單獨(dú)獲得，將L-絲氨酸、甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)液及L-絲氨酸和甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液采用1.3.2 中4種不同的展開(kāi)劑液分別進(jìn)行紙層析實(shí)驗(yàn)，以獲取最佳的展開(kāi)劑，紙層析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵液在不同展開(kāi)劑條件下的紙層析色譜圖Fig.1 Paper chromatogram of fermentation broth under different developing solvents

由圖1可知，采用③和④作為展開(kāi)劑時(shí)，L-絲氨酸和甘氨酸斑點(diǎn)間的Rf值基本一致（用③作展開(kāi)劑二者的Rf值均為0.295，用④作展開(kāi)劑二者的Rf值分別為0.23和0.24），混合液中L-絲氨酸和甘氨酸未出現(xiàn)分離現(xiàn)象，因此不能作為本實(shí)驗(yàn)的展開(kāi)劑。采用①作展開(kāi)劑分離時(shí)，兩種氨基酸的Rf值差距不明顯（Rf值分別為0.175和0.12），僅僅能證明混合液中有兩種氨基酸的存在，但分離效果不好。采用②作為展開(kāi)劑時(shí)能夠明顯分離出混合液中的L-絲氨酸和甘氨酸，并且L-絲氨酸和甘氨酸斑點(diǎn)間Rf值差距較大（Rf值分別為0.445和0.295），效果最佳。因此，選擇丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶10∶2∶5（V/V）作為最佳展開(kāi)劑。

2.2 洗脫液最佳波長(zhǎng)的測(cè)定

L-絲氨酸及甘氨酸的點(diǎn)樣量為2.0 μL，展開(kāi)、顯色顯出斑點(diǎn)后，剪下斑點(diǎn)在具塞玻璃管中用5 mL洗脫液洗脫30 min左右。以空白洗脫液為對(duì)照，用分光光度計(jì)在不同波長(zhǎng)條件下測(cè)定洗脫液的吸光度值，確定洗脫液的最佳波長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 洗脫液中L-絲氨酸和甘氨酸最適波長(zhǎng)的測(cè)定Fig.2 Determination of optimal wavelength of L-serine and glycine in eluants

由圖2可知，L-絲氨酸的最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，甘氨酸的最大吸收波長(zhǎng)也為510 nm。結(jié)果表明，當(dāng)波長(zhǎng)為510 nm時(shí)，兩種氨基酸分析吸收峰均處于波峰位置，即兩種洗脫液的吸光度值均達(dá)到最大值。因此，在測(cè)定L-絲氨酸和甘氨酸吸光度值時(shí)，均在510 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定。

2.3 展開(kāi)劑最佳pH值測(cè)定

按照最佳展開(kāi)劑②比例配成展開(kāi)劑的初始pH值為12.7，然后用2 mol/L的鹽酸溶液將展開(kāi)劑pH值依次調(diào)為10.5、8.0、6.0、4.0、2.0，用2.5 μL移液槍分別取0.5 μLL-絲氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸和甘氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)樣，分別進(jìn)行層析、顯色，最終紙層析顯色結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同pH條件下標(biāo)準(zhǔn)液的紙層析色譜圖Fig.3 Paper chromatogram of standard liquid under different pH conditions

由圖3可知，當(dāng)展開(kāi)劑pH值近似為8.0和2.0時(shí)基本不顯出斑點(diǎn)；而當(dāng)pH值為12.7時(shí)，能達(dá)到較好的層析效果，L-絲氨酸和甘氨酸混合液分離明顯。因此，層析液按照各試劑比例配好后無(wú)需調(diào)pH值即能達(dá)到最佳的分離效果，可直接作為展開(kāi)劑使用。

2.4 洗脫液最佳洗脫時(shí)間測(cè)定

L-絲氨酸的點(diǎn)樣量為2.0 μL，展開(kāi)、顯色顯出斑點(diǎn)后，在具塞玻璃管中用10 mL洗脫液洗脫不同時(shí)間。以空白洗脫液為對(duì)照，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定洗脫液的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 洗脫時(shí)間與吸光度值的關(guān)系Fig.4 Relationship between elution time and absorbance value

由圖4可知，在波長(zhǎng)510 nm處洗脫液洗脫30 min時(shí)的吸光度值最大，因此測(cè)定L-絲氨酸和甘氨酸時(shí)，均選用30 min作為最佳洗脫時(shí)間。

2.5 洗脫液穩(wěn)定性測(cè)定

L-絲氨酸的點(diǎn)樣量為2.0 μL，展開(kāi)、顯色、顯出斑點(diǎn)后，剪下顯色斑點(diǎn)于具塞玻璃管中用10 mL洗脫液洗脫30 min后。放置不同時(shí)間后，以空白洗脫液為對(duì)照，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定洗脫液的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 洗脫后放置不同時(shí)間與吸光度值的關(guān)系Fig.5 Relationship between eluent preserving time and absorbance value

由圖5可知，隨著洗脫后洗脫液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，洗脫液的吸光度值在不同程度上會(huì)有所降低。結(jié)果表明，在洗脫工作完成后要盡快測(cè)定洗脫液的吸光度值，不要間隔太長(zhǎng)時(shí)間，盡量在10 min內(nèi)完成所有測(cè)量工作，從而達(dá)到減小誤差的目的。

2.6 L-絲氨酸及甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

L-絲氨酸及甘氨酸的點(diǎn)樣量分別依次為2.0 μg、4.0 μg、6.0 μg、8.0 μg、10.0 μg、12.0 μg，待L-絲氨酸加甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色后，剪下顯色斑點(diǎn)置于具塞玻璃管中用5 mL洗脫液洗脫30 min，顯色后圖譜斑點(diǎn)進(jìn)行洗脫。以空白洗脫液為對(duì)照，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定洗脫液的吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，以L-絲氨酸及甘氨酸質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)繪制L-絲氨酸及甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 L-絲氨酸（A）及甘氨酸（B）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curves of L-serine (A) and glycine (B)

由圖6A可知，L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.008 8x+0.008 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2。由圖6B可知，甘氨酸回歸方程為y=0.016 2x+0.040 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5。結(jié)果表明，L-絲氨酸和甘氨酸質(zhì)量與吸光度值之間線性關(guān)系良好。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)10.0 μgL-絲氨酸分別進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)。點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色，洗脫后測(cè)量吸光度值，根據(jù)L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出L-絲氨酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，經(jīng)計(jì)算得到L-絲氨酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.3%。結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)該方法在發(fā)酵液中的準(zhǔn)確性，點(diǎn)樣2 μL處理過(guò)的發(fā)酵液，同時(shí)加入0.5 μLL-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并另外點(diǎn)2 μL發(fā)酵液來(lái)測(cè)定發(fā)酵液中的絲氨酸含量，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of standard recovery rate tests

由表2可知，發(fā)酵液中L-絲氨酸的加標(biāo)回收率在91%～98%之間，RSD為2.6%，說(shuō)明該方法在發(fā)酵液中受到的干擾比較小。

2.9 甲基營(yíng)養(yǎng)菌5222發(fā)酵液中L-絲氨酸含量的測(cè)定結(jié)果

取培養(yǎng)96 h的發(fā)酵液上清2 μL，通過(guò)層展、顯色、洗脫等步驟測(cè)定甲基營(yíng)養(yǎng)菌5222發(fā)酵液中L-絲氨酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，發(fā)酵液中L-絲氨酸的含量為0.90 g/L。

表3 發(fā)酵液中L-絲氨酸含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of L-serine content in fermentation broth

3 結(jié)論

紙層析-分光光度法所用儀器設(shè)備比較簡(jiǎn)單，操作方便，重復(fù)性好。在發(fā)酵液中測(cè)定時(shí)，沒(méi)有受到明顯干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于發(fā)酵培養(yǎng)基中L-絲氨酸含量的測(cè)定。本研究確立了紙層析-分光光度法的最適工作條件：展開(kāi)劑為丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶10∶2∶5（V/V），展開(kāi)劑pH值為12.7，波長(zhǎng)為510 nm，洗脫時(shí)間為30 min。應(yīng)用此方法，可以檢測(cè)到甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌5222在發(fā)酵培養(yǎng)96 h以后，發(fā)酵液中L-絲氨酸的含量為0.90 g/L。