菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中主要成分變化研究

林麗靜，馬麗娜，2，黃曉兵，龔 霄

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001；2.華中農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖北 武漢 430070）

菠蘿（Ananas comosus）是僅次于香蕉和柑橘類水果的第三大熱帶水果，原產(chǎn)于南美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國的廣東、廣西、福建、臺灣等均有廣泛種植。目前全球共有85個國家種植菠蘿，種植面積約占全球熱帶水果的1/3[1]。菠蘿有著獨特的風味和豐富的營養(yǎng)價值，是許多食譜的重要組成部分，受到國內(nèi)外廣大消費者的青睞，在食品行業(yè)中具有無可估量的價值。研究表明，菠蘿中除含有豐富的維生素C、無機鹽、有機酸外，還含有蛋白酶、粗纖維、白藜蘆醇、酚類等營養(yǎng)成分，具有很高的食用價值[2]。米酒是由蒸熟的糯米或江米，拌上酒曲發(fā)酵而成的。作為我國傳統(tǒng)特色飲品，其歷史悠久，營養(yǎng)豐富，廣受喜愛。

菠蘿皮渣是菠蘿產(chǎn)品加工所產(chǎn)生的副產(chǎn)品，主要由果皮和果渣組成，約占果實質(zhì)量的25%～35%左右[3]。研究表明，菠蘿皮渣主要由膳食纖維、黃酮類、果膠、糖類及多酚類[4]組成。為了增加菠蘿的附加值，減少菠蘿皮渣資源浪費，國內(nèi)外學者對菠蘿皮渣的開發(fā)利用進行了大量的研究[5-8]，其中發(fā)酵菠蘿果酒是研究利用的重要途徑[9-10]。目前，國內(nèi)外研究菠蘿皮渣主要集中在其功能成分（如多糖、纖維素、多酚和黃酮類物質(zhì)）的提取，也出現(xiàn)了菠蘿皮渣發(fā)酵酒的相關發(fā)研究。但菠蘿皮渣發(fā)酵酒顏色灰暗、口感粗糙、香氣稀少，為解決這一系列問題，提升其感官品質(zhì)，結(jié)合相關文獻研究，開發(fā)菠蘿皮渣糯米酒。本實驗室利用菠蘿皮渣和糯米酒聯(lián)合發(fā)酵，開發(fā)菠蘿皮渣糯米酒。采用相關國標檢測方法、液相色譜（liquid chromatography，LC）及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定發(fā)酵過程中可溶性固形物、酒精度、有機酸、揮發(fā)酸和香氣成分等成分變化。通過研究果酒發(fā)酵過程中物質(zhì)變化規(guī)律，加強對菠蘿皮渣糯米果酒生產(chǎn)的控制，為菠蘿皮渣的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌種

菠蘿（卡因品種）：廣東省湛江市；白砂糖（食品級）：湛江華資農(nóng)墾糖業(yè)發(fā)展有限公司廣豐分公司；QA23釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（簡稱Q）：上海杰兔工貿(mào)有限公司；糯米酒（酒精度12%vol，糖度7.3°Bx）：本實驗室自釀。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉（分析純）：廣東省化學試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；磷酸鹽緩沖溶液：國藥集團化學試劑有限公司；有機酸混標：美國Sigma-Aldrich公司；揮發(fā)酸混標：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PAL-3糖度計：日本ATAGO公司；BSA4202S電子天平、CPA225D十萬分之一分析天平：德國塞多利斯公司；QP-2020SE氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；JYZ-D68榨汁機：九陽股份有限公司；25 L發(fā)酵罐：石家莊恒昌食品機械包裝公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵工藝流程及操作要點

菠蘿→清洗→削皮→菠蘿皮渣榨汁→糖度調(diào)配→殺菌→冷卻→接種發(fā)酵→主發(fā)酵→過濾→加入糯米酒后陳釀發(fā)酵→過濾→澄清→罐裝→菠蘿皮渣糯米果酒

操作要點：

清洗、削皮：選擇八、九成熟新鮮菠蘿，用清水沖洗菠蘿，晾干，將菠蘿皮和肉切開分離。

榨汁：將菠蘿皮渣用榨汁機榨汁，條件為12 000 r/min、3 min。

糖度調(diào)配：菠蘿皮渣汁中加入白砂糖，調(diào)整糖度至20°Bx。

殺菌、冷卻：將菠蘿皮渣汁100 ℃殺菌30 min，然后冷卻至室溫。

接種發(fā)酵：菠蘿皮渣汁與蒸餾水按1∶1（V/V）混合，在菠蘿皮渣醪中接入5%活化酵母。

主發(fā)酵：在28 ℃條件下進行主發(fā)酵，發(fā)酵7 d結(jié)束。實時監(jiān)測發(fā)酵汁殘?zhí)呛浚?4 h內(nèi)殘?zhí)呛咳舨话l(fā)生變化，則主發(fā)酵結(jié)束。

過濾：發(fā)酵第8天，采用8層紗布過濾酒醪，取清液。

陳釀發(fā)酵：菠蘿皮渣酒中加入20%的糯米酒，移入20 L新的發(fā)酵罐，充氧量為5%，靜置發(fā)酵，于20 ℃條件下發(fā)酵60 d。實時監(jiān)測其殘?zhí)呛浚?4 h內(nèi)殘?zhí)呛坎辉侔l(fā)生變化時，視作發(fā)酵結(jié)束。

澄清：菠蘿皮渣糯米果酒20 ℃條件下靜置24 h。

灌裝：用750 mL棕色葡萄酒瓶灌裝菠蘿皮渣糯米果酒。

1.3.2 菠蘿皮渣糯米酒基本理化指標測定

可溶性固形物含量（糖度）：利用糖度計進行測定；酒精度：參照國標GB/T 13662—2008《黃酒》中方法進行測定；總酸含量：采用滴定法進行測定。

1.3.3 有機酸含量

有機酸含量采用反相高效液相色譜（reversed phase highperformance liquid chromatography，RP-HPLC）法進行測定[11]。

樣品前處理：吸取5.00 mL的待測樣品，高速離心（5 000 r/min、5 min），取1.00 mL上清液，用1%磷酸溶液（pH 3.60）稀釋10倍，用0.22 μm尼龍膜過濾，濾液上機分析。

色譜條件：BP-OA色譜柱（300 mm×7.8 mm）；BP-OA H+Guard保護柱（50 mm×4.6 mm）；流動相A（超純水）∶B（1%磷酸溶液）=20∶80（V/V），等度洗脫，流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm；進樣量10.00 μL。

定性定量方法：分別精密稱取5.00 mg草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸和乙酸置于5 mL容量瓶中，用流動相B定容至刻度線，得到質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的有機酸母液，進一步通過梯度稀釋制備質(zhì)量濃度為0.80 mg/mL、0.60 mg/mL、0.40 mg/mL、0.20 mg/mL的標準品工作液，以各標準品質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算各物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.4 揮發(fā)酸含量的測定

揮發(fā)酸的測定采用高效液相色譜法，其色譜條件如下：Thermo C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；紫外檢測器；流動相：A為50 mmol/L磷酸二氫鉀（pH 2.70），B為甲醇，A∶B=97∶3（V/V）；洗脫模式：等度洗脫；流速：0.8mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：2 μL。

定性定量方法：配制各標準品母液，梯度稀釋母液，0.22濾膜過濾，進樣量5 μL。以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。稀釋樣品至樣品中待測有機酸的質(zhì)量濃度介于上下檢測限之間，0.22 μm濾膜過濾，進樣量5 μL。按照標準曲線回歸方程計算各揮發(fā)酸的含量。

1.3.5 香氣成分的測定

揮發(fā)性香氣成分采用氣質(zhì)聯(lián)用法，其檢測條件如下：

樣品前處理：將菠蘿皮渣糯米果酒用0.22 μm的有機系濾頭，取0.5 mL過濾后的酒樣，加入15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

氣相色譜條件：VF-Wax毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.2 μm）；程序升溫：初始溫度45 ℃，保留2 min，以5 ℃/min的速率升至180 ℃，再以20 ℃/min的速率升至240 ℃，保留2 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純度氦氣（He），流速1 mL/min；不分流進樣。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度250 ℃，全掃描模式，掃描范圍35～500 m/z，溶劑延遲3.5 min。

定性定量方法：質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)Wiley.lib數(shù)據(jù)庫和美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14.lib譜庫檢索，僅對匹配值（similarity index，SI）＞90（最大匹配值為100）的鑒定結(jié)果予以報道。采用峰面積歸一化法計算菠蘿皮渣糯米果酒中各揮發(fā)性成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程基本理化指標的分析

2.1.1 糖度和酒精度的變化

菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程糖度和酒精度的變化結(jié)果如圖1所示。

圖1 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中糖度和酒精度的變化Fig.1 Changes of sugar content and alcohol content in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine

由圖1可知，初始糖度為20°Bx，在主發(fā)酵發(fā)酵0～4 d，糖度迅速下降至6.81°Bx，發(fā)酵4～8d，糖度變化不大，說明主發(fā)酵結(jié)束。第8天陳釀發(fā)酵，因為加入的糯米酒糖度高于主發(fā)酵后的菠蘿皮渣酒，導致糖度有所上升后下降，然后趨于平穩(wěn)。酒精度在主發(fā)酵0～8 d上升，第8 天酒精度達8.30%vol，陳釀發(fā)酵8～15 d酒精度上升至11.37%vol后趨于穩(wěn)定，可能是因為糯米酒的加入，增加了發(fā)酵醪中糖含量，酵母再次利用糖轉(zhuǎn)化為乙醇，使酒精度升高。發(fā)酵前期，酵母菌對糖的消耗較快，轉(zhuǎn)化成酒精的速度也較快，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵汁中殘?zhí)堑暮拷档?，能被利用的糖已被利用，后期酒精度逐漸升高，可能是因為增加了發(fā)酵醪中糖含量，糖度降低的趨勢和酒精度增加的趨勢基本一致，因為酒精發(fā)酵就是把發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成酒精的過程，釀酒原料的糖酸比直接決定了酒的酒精度以及酒的口感平衡度。

2.1.2 pH和總酸含量的變化

菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程pH和總酸含量的變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，果酒發(fā)酵過程中pH在3.80～3.50之間，主發(fā)酵0～8 d時pH值下降，陳釀發(fā)酵第10天時，pH值最低，為3.57，然后逐漸上升至3.70。總酸含量在主發(fā)酵0～8 d內(nèi)總體呈上升趨勢，在第6天稍微有些下降，可能發(fā)酵過程中酵母分解菠蘿皮渣，使酸性物質(zhì)溶出。8～15 d內(nèi)總酸含量呈上升趨勢，可能是酵母代謝使蘋果酸轉(zhuǎn)化成其他有機酸，使酸度增加明顯。陳釀階段15 d之后，總酸含量下降，可能由于在低溫高酒精度下，菠蘿皮渣糯米果酒中的酸與醇類結(jié)合生成酯類、醛類等芳香物質(zhì)，增加果酒香氣，改善品質(zhì)[12]?？偹岷渴侵苯佑绊懢浦衟H的主要因素，總酸含量增加，pH值下降，呈負相關關系。

圖2 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中pH值（A）和總酸含量（B）變化Fig.2 Changes of pH (A) and total acid content (B) in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine

2.2 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程有機酸含量的變化

有機酸對果酒的口感和風味都具有重要的調(diào)節(jié)作用。菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程有機酸含量的變化結(jié)果見表1。由表1可知，菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程一共檢出8種有機酸，主要是檸檬酸和蘋果酸。有機酸在主發(fā)酵和后陳釀發(fā)酵過程中品種和含量變化較大，主發(fā)酵8 d之后，草酸未檢出；前10 d丙酮酸含量降低了0.12 g/L，乙酸含量升高了0.18 g/L，從第10 天乙酸含量開始減少，到第60 天時降低了0.05 g/L，因為一些乙酸被激活以形成乙酰-輔酶A（acetylcoenzyme A，CoA），可以進入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）或產(chǎn)生脂肪酸或與醇反應生成乙酸酯[13]。第10天時琥珀酸含量升高了0.11 g/L，蘋果酸含量不斷降低，第60天時降低了2.26 g/L，因為DL-蘋果酸可進入酵母細胞[14]。發(fā)酵結(jié)束后與菠蘿汁相比，乳酸含量升高0.49 g/L，丙酮酸和乙酸變化較小，其他有機酸含量降低，其中檸檬酸和蘋果酸含量降低較多，分別為10.85 g/L和4.34 g/L。菠蘿皮渣糯米果酒中檸檬酸含量最高，第60天時為3.51 g/L，是果酒酸味的主要來源，較高的乳酸含量增加口感的柔和性。

表1 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中有機酸含量變化Table 1 Change of the organic acid content in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine

2.3 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程揮發(fā)酸含量變化

揮發(fā)酸作為果酒品質(zhì)的一項重要指標，在國家標準中有明確的的限量要求（果酒中揮發(fā)酸含量應≤1.2 g/L）。揮發(fā)酸含量過高表示酒樣酸敗，酒樣顏色灰暗渾濁、能聞到刺鼻的酸味，口感過酸失衡。采用高效液相色譜測定菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程揮發(fā)酸含量變化，結(jié)果見表2。由表2可知，果酒揮發(fā)酸主要是甲酸和乙酸。在發(fā)酵前期，甲酸、乙酸含量較高，在第2天時甲酸和乙酸含量分別達1.41 g/L和0.71 g/L，隨著發(fā)酵的進行，揮發(fā)酸含量逐漸降低，第60天時甲酸和乙酸含量分別降低了1.11 g/L和0.45 g/L，可能是果酒在微氧的條件下貯藏，揮發(fā)酸可與醇類結(jié)合產(chǎn)生酯類，如乙酸與乙醇可生產(chǎn)乙酸乙酯，增加果酒香氣[15]。農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1508—2007《綠色食品果酒》中規(guī)定果酒中揮發(fā)酸含量＜1.50 g/L，陳釀60 d時菠蘿皮渣糯米果酒揮發(fā)酸含量為0.56 g/L，滿足要求。

表2 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程揮發(fā)酸含量變化Table 2 Change of volatile acid content in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine

2.4 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程香氣成分變化

采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣成分變化，結(jié)果見表3。由表3可知，菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中共檢出88種揮發(fā)性香氣成分，其中主要有41種酯類、22種醇類、10種酸類和15種其他類。菠蘿主要香氣成分是酯類和萜烯類物質(zhì)[16]，己酸乙酯、異丁酸乙酯、菠蘿乙酯、丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯和呋喃酮（dimethyl hydantoin formaldehyde resin，DMHF）、癸醛等是菠蘿的主要香氣成分[17]。

如表3所示，酯類物質(zhì)發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。酯類含量發(fā)酵前是39.27%，發(fā)酵至10 d，上升至59.24%，從第10天到第60天，酯類物質(zhì)含量下降，最終降至47.19%，其中第4天和第10天最高，分別為55.42%和59.24%，在第8天時加入糯米酒，糯米酒與菠蘿醪經(jīng)過兩天融合，香氣更加突出，在第10天，酯類含量達到最高，在10～40 d酯類含量呈下降趨勢；從40～60 d，乙酸異戊酯和葵酸乙酯含量呈現(xiàn)微量上升。

醇類是酒的主體成分，少量高級醇嗅覺閾值較低，賦予果酒較高的香氣值，也促進其他香氣物質(zhì)的溶解，對酒體豐滿起著不可忽視的作用[18]。由表3可知，菠蘿醇是果酒特有的香氣成分，在發(fā)酵過程中呈先升后降的變化趨勢，在第8天時，達到最大，相對含量為0.77%，在第8天后加入糯米酒，高級醇含量增多，促進酯化反應的發(fā)生，使酯類含量在第10天達到最高。糯米酒中糖含量較高，微量的酵母利用新加入糯米酒中的糖，繼續(xù)生長，產(chǎn)生醇類，使醇類含量緩慢上升，第25天時，達到最大，相對含量為25.92%。整個過程中苯乙醇含量都較高，第40天時，達到最大，為21.33%，苯乙醇香氣值很高，對果酒濃郁優(yōu)雅風味的形成具有重要作用[19]。

酸類物質(zhì)是果酒的重要呈香物質(zhì)，其中不飽和酮酸對果酒風味影響最大[20]，發(fā)酵過程中不斷變化。第8天時，酸類物質(zhì)相對含量達14.43%，且成分較多，發(fā)酵第8天時，己酸、辛酸、壬酸和癸酸含量變化較大，分別為1.84%、7.95%、3.04%、1.49%，加入糯米酒與菠蘿皮渣混合，部分有機酸含量變化。發(fā)酵第60天時己酸和辛酸含量較高，分別為0.7%和3.28%，為果酒的主要酸類物質(zhì)，增加菠蘿皮渣糯米果酒的柔和感。

表3 菠蘿皮渣糯米果酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣成分相對含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of relative contents of volatile aroma compounds in the fermentation process of pineapple peel and glutinous rice wine%

續(xù)表

3 結(jié)論

通過采用國標檢測方法、液相色譜及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)合法，研究菠蘿皮渣糯米果酒在發(fā)酵過程中可溶性固形物、酒精度、有機酸、揮發(fā)酸和香氣成分等成分變化。結(jié)果表明，菠蘿皮渣糯米果酒在發(fā)酵過程中，糖度下降，總酸含量下降，酒度上升，有機酸含量總體下降，香氣含量增加。在發(fā)酵過程中，菠蘿皮渣糯米果酒中共檢測出88種香氣成分，其中41種酯類、22種醇類、10種酸類和15種其他類。本研究通過將菠蘿皮渣發(fā)酵汁與糯米酒混合發(fā)酵，有效降低了菠蘿皮渣發(fā)酵酒中有機酸和揮發(fā)酸的含量，使酒樣口感更圓潤柔和，酸度協(xié)調(diào)，研究結(jié)果為開發(fā)利用菠蘿皮渣提供一種利用途徑，并具有廣闊的應用價值。