酪蛋白的胰蛋白酶水解物分離及其抗氧化性研究

秦娟娟，何超群，劉金龍，李 晶，楊繼濤 *，楊 敏

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牛乳及牛乳制品目前被認(rèn)為是最適合人類食用的動(dòng)物蛋白食品之一，而牛乳中占比最多的蛋白質(zhì)是酪蛋白[1]。人體對(duì)蛋白質(zhì)的消化過程中會(huì)產(chǎn)生許多種類的肽，牛乳酪蛋白不僅是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，而且是生物活性肽的重要來源[2]。酪蛋白經(jīng)不同酶解處理可產(chǎn)生不同的生物活性肽，如抑菌肽[3-4]、磷酸肽[5-6]、抗氧化肽[7]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin conversion enzyme，ACE）抑制肽[8]。其中抗氧化肽是一類具有清除體內(nèi)過多的自由基、抑制脂肪氧合酶活力、分解氧化物、增強(qiáng)人體抗衰老和抗疾病能力的活性多肽[9-10]。

20世紀(jì)90年代來，乳源抗氧化肽的分離鑒定及其活性的研究備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，并隨著質(zhì)譜等技術(shù)的發(fā)展，已從多種動(dòng)植物的蛋白水解產(chǎn)物中鑒定出大量的具有特定序列的抗氧化肽[2]。多肽的分離多采用樹脂分離技術(shù)，不同樹脂的分離機(jī)理不同，進(jìn)而使其富集的多肽在分子質(zhì)量、凈電荷、氨基酸組成等方面具有差異，不同分離方式其分離出肽的富集片段也各不相同。宋曉光等[11]利用D201樹脂分離了水蛭中活性肽成分，并優(yōu)化了工藝參數(shù)。胡贊揚(yáng)等[12]以酶凝干酪乳清為原料，通過硫酸銨沉淀、透析、超濾和D201樹脂離子交換層析等工藝，實(shí)現(xiàn)了乳清中糖巨肽的有效分離。大量研究指出，多肽的自由基清除力、金屬螯合力以及脂質(zhì)過氧化抑制力與其氨基酸組成、氨基酸序列、分子質(zhì)量和空間構(gòu)象密切相關(guān)，如含有酪氨酸、色氨酸、組氨酸殘基的多肽表現(xiàn)出較好的自由基清除能力，而疏水性氨基酸含量較高的多肽表現(xiàn)出極好的脂質(zhì)過氧化抑制能力[15-16]。劉麗莎等[17]利用黃漿水為原料，通過比較酶種類及用量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)黃漿水蛋白質(zhì)水解度的影響，實(shí)現(xiàn)酶解工藝的優(yōu)化，在此條件下水解度可達(dá)25.95%，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶體外抑制活性達(dá)92.0%。

關(guān)于乳源抗氧化肽的研究較多，但因多肽的分離純化工藝復(fù)雜，成本高而難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本研究采用胰蛋白酶對(duì)牛乳酪蛋白進(jìn)行水解，采用成本低廉的D201陰離子交換樹脂對(duì)酶解物進(jìn)行一次分離，獲得酪蛋白多肽；系統(tǒng)分析酪蛋白多肽的抗氧化性，旨在為酪蛋白抗氧化肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷斯坦牛乳：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牛奶廠；D201樹脂：上海匯珠樹脂有限公司；透析袋（0.1 kDa）：上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；賴氨酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；大豆卵磷脂：鄭州萬博食品配料有限公司；鹽酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司；鄰苯二甲醛（phthalaldehyde，OPA）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；四硼酸鈉、β-巰基乙醇、1,1-二苯基-2-苦基苯基（1,1-diphenyl-2-bitter phenylyl，DPPH）：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；無水乙醇、氯化亞鐵、三氯化鐵、三氯乙酸、鐵氰化鉀、菲洛嗪、抗壞血酸、2-硫代巴比妥酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K-15高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；JJ224BC型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；PHS-3C pH計(jì)：上海三信儀器廠；DF-II恒溫水浴磁力攪拌器：金壇市順華儀器有限公司；TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FD-IA-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酪蛋白的提取

將新鮮荷斯坦牛乳在高速冷凍離心機(jī)中4℃、6000 r/min離心15 min，棄去上層脂肪，取其下清液逐滴加入1 mol/L的HCl，并且緩慢攪拌使其沉降，靜置4 h后用紗布過濾，用蒸餾水洗滌沉淀4次，即得鹽酸沉淀酪蛋白；將其置于冷凍干燥機(jī)中干燥48 h。將干燥好的酪蛋白粉碎，冷藏備用。

1.3.2 酪蛋白的水解

準(zhǔn)確稱取10.0 g酪蛋白，加入300 mL蒸餾水溶解，45 ℃加熱磁力攪拌，溶解過程中加1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值始終控制在7.0左右，直至酪蛋白溶解后用蒸餾水定容至500 mL。向酪蛋白溶液中加入400 μL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的胰蛋白酶，在pH 7.0的條件下恒溫水浴37 ℃磁力攪拌3 h，酶解結(jié)束后在沸水浴中5 min滅酶活，冷水中迅速冷卻。

1.3.3 酪蛋白水解度的測定

賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取40 mg OPA溶于1.00 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液中，移取pH 9.5的0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖溶25.00 mL、SDS溶液（20 mg/100 mL）2.50 mL、β-巰基乙醇100 μL混合均勻，用蒸餾水定容至50 mL。稱取賴氨酸0.050 0 g，用蒸餾水定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的溶液。分別移取適量賴氨酸溶液，稀釋至400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL。取上述賴氨酸溶液400 μL，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至7.5 mL；取上述溶液200 μL，加入6.00 mL OPA試劑，混合均勻后室溫條件下暗室放置5 min，以200 μL蒸餾水和6.00 mL OPA試劑混合液為參比，測定波長340 nm處的吸光度值；以賴氨酸質(zhì)量濃度（x）作為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

水解度的測定：取400 μL酪蛋白酶解液或未加酶的酪蛋白溶液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至7.5 mL；取200 μL上述酶解液，加入6.00 mL OPA試劑，混合均勻后室溫條件下暗室放置5 min，以200 μL蒸餾水和6.00 mL OPA試劑混合液為參比，測樣品在波長340 nm處的吸光度值。酪蛋白水解度計(jì)算公式[18]如下：

式中：A0為未加酶樣品的吸光度值；A為酶解后樣品的吸光度值。

1.3.4 酪蛋白多肽的分離

離子交換樹脂的預(yù)處理：稱取200 g D201樹脂置于燒杯中，倒入飽和食鹽水，使飽和食鹽水完全浸沒樹脂，并不斷攪拌以除去氣泡，使之充分混合，靜置24 h。

將泡好的樹脂裝入分離柱中，用2倍柱體積的飽和食鹽水緩慢沖洗樹脂，然后用蒸餾水洗至無黃色液體流出。

用5倍柱體積4%的NaOH溶液浸泡，再用蒸餾水沖洗至中性；用5倍柱體積4%的HCl浸泡，再用蒸餾水沖洗至中性。

多肽的分離：在室溫條件下，將水解后的酪蛋白溶液160 mL流過D201陰離子交換樹脂層析柱，采用氯化鈉梯度洗脫，氯化鈉濃度為0～3%，洗脫液總體積為2 000 mL，分管收集分離出的液體，每管收集15 mL，洗脫液用紫外-可見分光光度計(jì)在波長280 nm處測定吸光度值。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，洗脫液吸光度值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

根據(jù)洗脫曲線，合并同一洗脫峰，置于透析袋（截留分子質(zhì)量0.1 kDa）中透析24 h，采用冷凍干燥機(jī)凍干，即得酪蛋白多肽。

1.3.5 抗氧化性測定

還原力的測定：參考GU F等[19]的方法，準(zhǔn)確稱取適量酪蛋白肽，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，取多肽溶液1 mL，與1.0 mL濃度為0.2 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1.0 mL 1%的鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]混合。將反應(yīng)混合物在50 ℃水浴中溫育20 min，冷卻至室溫后加入1.0 mL的10%三氯乙酸。使用離心機(jī)在25 ℃條件下將混合物4 000 r/min離心10 min。取離心后的上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水和400 μL 0.1%FeCl3。使用紫外-可見分光光度計(jì)在波長700 nm處測量反應(yīng)混合物的吸光度值。還原力表示為波長700 nm處的吸光度值，以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）作為抗氧化劑參照物比較還原力。

DPPH自由基清除活力的測定：參考BENJAKUL S等[20]的方法，將2.0 mL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的多肽溶液加入4.0 mL DPPH濃度為0.1 mmol/L的乙醇溶液，將溶液劇烈混合，并在室溫條件下于黑暗中靜置20 min。將混合物4 000 r/min離心10 min。使用紫外-可見分光光度計(jì)在波長517 nm處測量上清液的吸光度值，記為A1；用等體積乙醇溶液替代DPPH溶液，吸光度值記為A2，等體積水代替樣品溶液，吸光度值記為A0；等體積水和乙醇混合溶液調(diào)零。DPPH自由基清除力計(jì)算公式如下：

Fe2+螯合力的測定：將2.0 mL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的多肽溶液與3.7 mL蒸餾水和0.1 mL濃度為2.0 mmol/L的FeCl2混合，將混合物在室溫條件下靜置30 s；加入0.2 mL濃度為5 mmol/L菲洛嗪并混合，在室溫條件下靜置10 min，4 000 r/min離心5 min；用紫外-可見分光光度計(jì)測定波長562 nm處的吸光度值，記為A1。用水代替樣品作為空白，以相同的方式進(jìn)行測定，記為A2。Fe2+螯合力計(jì)算公式[21]如下：

脂質(zhì)過氧化抑制力的測定：參考YI O S等[22]的方法，將卵磷脂懸浮于質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L，pH 7.4）中，溶液標(biāo)記為LLS。將15 g三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、0.37 g硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）和2 mL濃HCl加入蒸餾水中，將體積調(diào)節(jié)至100 mL，標(biāo)記為TCA-TBA-HCl。將1 mL LLS、1.0 mL 400 μmol/L FeCl3、1.0 mL 400 μmol/L抗壞血酸和1.0 mL樣品溶液依次混合。將溶液在37 ℃黑暗的水浴中放置60 min，再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl。混合液在90～100 ℃水浴加熱15 min后用冰水冷卻。將溶液以750 r/min離心10 min，采用紫外-可見分光光度計(jì)于波長532 nm處測定上清液的吸光度值，記為As。用1.0 mL蒸餾水替代樣品，吸光度值記為Ac。脂質(zhì)過氧化抑制力計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均為3次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS 18.0（SPSS Inc.，USA）進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白水解度

賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lysine

由圖1可知，經(jīng)線性擬合，得到賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 01x+0.039 78，方程相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得知，酪蛋白的水解程度為（83.33±3.26）%，由此可見，酪蛋白的水解程度較高。

2.2 酪蛋白多肽的分離

酪蛋白的胰蛋白酶水解液經(jīng)過D201陰離子交換樹脂分離的洗脫曲線見圖2。

圖2 酪蛋白酶解液洗脫曲線Fig.2 Elution curve of casein enzymatic hydrolysate

由圖2可知，采用D201陰離子交換樹脂對(duì)酪蛋白酶解液分離后得到5個(gè)峰（分別標(biāo)記為P1、P2、P3、P4、P5），實(shí)現(xiàn)了很好的分離。

2.3 酪蛋白多肽的抗氧化性

2.3.1 還原力

還原力是衡量多肽抗氧化性的重要指標(biāo)之一，評(píng)價(jià)的是多肽的給電子能力。據(jù)報(bào)道，甲硫氨酸殘基的硫原子可供電子，因而具有較強(qiáng)的還原力；甘氨酸的側(cè)鏈有一個(gè)氫原子，使多肽具有很好的構(gòu)象柔性，而脯氨酸的吡咯烷環(huán)可以阻止多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)生成，這些氨基酸的存在有利于多肽中其他氨基酸殘基抗氧化性的發(fā)揮[23-26]。對(duì)分離獲得的5種酪蛋白多肽和未分離的酪蛋白酶解液進(jìn)行還原力測定，結(jié)果見圖3。

圖3 酪蛋白酶解液及多肽的還原力Fig.3 Reducing powers of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

由圖3可以看出，酪蛋白酶解液的還原力最低，其吸光度值為0.026。酪蛋白多肽P2的還原力最大，其吸光度值為0.231。酪蛋白多肽的還原力順序?yàn)镻2＞P1＞P4＞P5＞P3，且多肽間還原力差異顯著（P＜0.05）。由此可見，經(jīng)過分離后，還原力較高的肽段得以富集。

2.3.2 DPPH自由基清除力

對(duì)分離獲得的5種酪蛋白多肽和未分離的酶解液進(jìn)行DPPH自由基清除力測定，結(jié)果見圖4。

圖4 酪蛋白酶解液及多肽的DPPH自由基清除力Fig.4 DPPH radical scavenging activities of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

由圖4可以看出，與未分離的酶解液相比，分離所得的5個(gè)肽段DPPH自由基清除活力均高于酶解液。就多肽而言，多肽P4的DPPH自由基清除活性最強(qiáng)達(dá)到（23.8±0.18）%，P3的清除活性最差為（4.5±0.16）%；多肽P4與P2的DPPH自由基清除活性相當(dāng)，均高于多肽P1。DPPH法測定多肽抗氧化性是基于單電子轉(zhuǎn)移機(jī)理，可用于評(píng)價(jià)多肽提供電子的能力[15-16]。多肽P3的DPPH自由基清除活性是5個(gè)多肽中最差的，這一結(jié)果與還原力測定結(jié)果一致。雖然多肽P4、P5的還原力低于其他肽段，但其自由基清除活性并不低于其他肽段，這是因?yàn)槎嚯牡淖杂苫宄钚暂^還原力而言受到的影響因素更多、更為復(fù)雜，如pH、分子質(zhì)量等[27-28]。

2.3.3 Fe2+螯合能力

對(duì)分離獲得的5種酪蛋白多肽進(jìn)行Fe2+螯合能力的測定，以未分離的酪蛋白酶解液為對(duì)照，結(jié)果見圖5。

圖5 酪蛋白酶解液及多肽的Fe2+螯合率Fig.5 Fe2+chelating activities of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

由圖5可以看出，未分離的酶解液Fe2+螯合率為（31.27±5.80）%。多肽P3的螯合率為（2.50±0.14）%，基本可忽略。其他4個(gè)肽段的Fe2+螯合率均＞90%，其中多肽P5的Fe2+螯合率達(dá)（99.80±0.12）%，表現(xiàn)出極好的金屬螯合能力。

據(jù)報(bào)道，組氨酸的咪唑基團(tuán)可以螯合金屬離子；酸性氨基酸（如谷氨酸、天門冬氨酸）帶負(fù)電的側(cè)鏈具有較好的金屬螯合能力；堿性氨基酸賴氨酸也具有金屬螯合能力[23-27]。采用陰離子交換樹脂分離多肽的機(jī)理基于帶負(fù)電荷的肽段被吸附于樹脂上，在用鹽洗脫的過程中，Cl-將多肽交換下來，從而實(shí)現(xiàn)了分離。由此可見，分離所得的肽段中性條件下帶有負(fù)電荷，酸性氨基酸含量較高，從而表現(xiàn)出極高的金屬螯合能力。肽段P3可能在金屬螯合力測定條件下發(fā)生自組裝，形成多聚體，或因其分子質(zhì)量及構(gòu)象影響，基本沒有金屬螯合能力，具體原因有待進(jìn)一步研究。

2.3.4 脂質(zhì)過氧化抑制力

對(duì)分離獲得的5種酪蛋白多肽進(jìn)行脂質(zhì)過氧化抑制力的測定，以未分離的酪蛋白酶解液為對(duì)照，結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，酪蛋白酶解液表現(xiàn)出一定的脂質(zhì)過氧化抑制力，抑制率為（14.82±0.12）%，而分離所得的肽段P1和P4抑制力較差，多肽P2和P3不具備脂質(zhì)過氧化抑制能力；多肽P5的抑制力為（13.58±0.38）%?？偠灾嚯牡闹|(zhì)過氧化抑制力低于酶解液。

圖6 酪蛋白酶解液及多肽的脂質(zhì)過氧化抑制力Fig.6 Lipid peroxidation inhibition of casein enzymatic hydrolysate and polypeptide

3 結(jié)論

利用牛乳酪蛋白為原料，經(jīng)過胰蛋白酶充分水解后，再通過D201陰離子交換樹脂梯度洗脫分離出5個(gè)較顯著的肽片段，其分離效果較好。對(duì)酪蛋白酶解液與分離所得的5個(gè)肽段分別進(jìn)行抗氧化性測定，對(duì)比還原力和DPPH自由基清除能力發(fā)現(xiàn)，分離出的肽段高于酶解液。P1、P2、P4、P5肽段的還原力、DPPH自由基清除活力、Fe2+螯合力均明顯高于P3肽段，其中，P2肽段的還原力最高，為0.234，然后是P3肽段，為0.057；P4肽段的DPPH自由基清除活力最高，達(dá)到（23.8±0.18）%，然后是P3肽段，為（4.5±0.16）%；P5肽段的Fe2+螯合力最高，高達(dá)（99.80±0.12）%，P3肽段的Fe2+螯合力最低，為（2.50±0.14）%，而酶解液的Fe2+螯合率為（31.27±5.80）%。酶解液的脂質(zhì)過氧化抑制力高于多肽；P5肽段的脂質(zhì)過氧化抑制力為（13.58±0.38）%，略低于酶解液，酶解液的抑制力是（14.82±0.12）%，而P2、P3肽段不具備脂質(zhì)過氧化抑制力。綜上所述，酪蛋白多肽P1、P4、P5具有較好的抗氧化性。