黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

孫子羽，滿都拉，陳 佳，劉 婷，溫 慧，陳忠軍*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳清是生產(chǎn)干酪和干酪素的副產(chǎn)物，含有乳中近一半的營養(yǎng)成分，其中干物質(zhì)約含6%～8%，粗蛋白質(zhì)1%，粗脂肪0.3%～0.4%，總糖3%～5%（乳糖占99.8%）[1]。目前乳清處理方式不能有效促進乳清再利用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。因此，利用乳清或其干燥產(chǎn)物生產(chǎn)乳清干酪[4]、濃縮乳清蛋白[5]、乳清蛋白酶解產(chǎn)物[6-8]、乳糖和乳清飲料等高附加值的產(chǎn)品是未來的主要發(fā)展方向[9]。

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）為茄科枸杞屬多棘刺灌木，在我國主要分布于青海、寧夏、新疆、甘肅、西藏等省區(qū)[10]，以其花青素含量豐富而著名[11]。黑枸杞除花青素外還含有脂肪、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、有機酸、微量元素以及維生素等多種營養(yǎng)成分[12]，具有抗氧化、抗疲勞、降壓、抗心血管疾病等功能，具備廣闊的應用前景，是近年來食品研究與開發(fā)的熱點[13-16]。

目前對黑枸杞的研究主要集中于黑枸杞營養(yǎng)成分等，也有對黑枸杞與葡萄、靈芝、紅棗、苦蕎和仙人掌等結(jié)合生產(chǎn)復合飲料的研究[17-21]。而以黑枸杞為原料的乳清酒未有報道，本研究以乳清粉和黑枸杞為原料制備乳清酒，通過單因素試驗和正交試驗對乳清酒發(fā)酵原料的配比及工藝進行優(yōu)化，并利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（head space solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法鑒定黑枸杞乳清酒揮發(fā)性風味成分，以期為黑枸杞乳清酒中香味物質(zhì)的認識和乳清高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞：銀川杞里鄉(xiāng)商貿(mào)有限公司；乳清粉：新西蘭恒天然集團有限公司；啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司；乳糖酶（10萬U/g）：山東圣斯德食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10精密電子pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；SPME裝置：上海安譜實驗科技股份有限公司；Trace1300-ISQ型GC-MS聯(lián)用儀、U3000高效液相色譜儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枸杞乳清酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點

原料選擇：選擇無霉變、無病蟲害的黑枸杞干。

黑枸杞汁制備：將黑枸杞進行研磨，按照1∶5（g∶mL）加入水，攪拌均勻，靜置30 min，取上清。

乳清液制備：乳清粉按照1∶10（g∶mL）加水溶解，制得10%的乳清溶液，加入0.7%的乳糖酶，攪拌均勻后35 ℃酶解3 h。

殺菌：65 ℃水浴30 min。

成分調(diào)整：按200 g/L加入蔗糖。

菌株活化：啤酒活性干酵母按料水比為1∶10（g∶mL）配制，加入2%蔗糖，置于35 ℃水浴鍋中活化30 min至大量起泡即酵母活化完成。

接種：在超凈工作臺中完成，以防止污染。

發(fā)酵：發(fā)酵瓶用帶有單向閥的瓶蓋密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

過濾：用砂芯漏斗過濾不溶性固形物。

1.3.2 黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

固定初始原料體積比（黑枸杞汁∶乳清汁）1∶4，接種量1%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間120 h。分別改變原料體積比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）、接種量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、發(fā)酵時間（96 h、108 h、120 h、132 h、144 h），對黑枸杞乳清酒粗品進行感官評定以確定原料體積比、接種量和發(fā)酵時間的最佳水平。

1.3.3 黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計3因素3水平正交試驗，考察原料體積比（A）、接種量（B）和發(fā)酵時間（C）對黑枸杞乳清酒感官品質(zhì)的影響，正交試驗因素與水平見表1。

表1 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of black medlar whey wine

1.3.4 測定方法

感官評價：根據(jù)國家標準GB/T 16861—1997《感官分析通過多元分析方法鑒定和選擇用于建立感官剖面的描述詞》，選擇描述詞，根據(jù)GB/T 10220—2012《感官分析方法學總論》建立感官評分標準，滿分100分，見表2。選定20人（男、女各10人），根據(jù)表2標準主要圍繞色澤、香氣、口感和組織狀態(tài)對黑枸杞乳清酒進行感官評定。

表2 黑枸杞乳清酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of black medlar whey wine

黑枸杞乳清酒中揮發(fā)性風味物質(zhì)分析：利用HS-SPMEGC-MS法[22]，量取8.0 mL黑枸杞乳清酒放入20 mL SPME樣品瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分進行萃取，在60 ℃水浴條件下平衡10 min，萃取頭頂空吸附30 min后，在GC進樣口釋放1 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：DB-5毛細色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（He）；載氣流速1.0 mL/min；離子源溫度230 ℃；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升溫至100 ℃保持3 min，再以4 ℃/min升溫至220 ℃保持10 min，不分流進樣；質(zhì)量掃描范圍50～550 m/z；溶劑延遲時間1 min。

1.3.5 統(tǒng)計分析

單因素和正交試驗中每個水平做3次平行試驗。利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（采用一般線性模型單因素Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 黑枸杞汁與乳清汁體積比的確定

由圖1可知，黑枸杞乳清酒感官評分隨黑枸杞汁與乳清汁體積比的減少呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。在黑枸杞汁與乳清汁的體積比為1∶3時，感官評分達到最大值89.1分，此時酒體色澤鮮明，口感純正，故黑枸杞汁與乳清汁最佳體積比確定為1∶3。

圖1 黑枸杞汁與乳清汁比例對感官評分的影響Fig.1 Effect of the ratio of black medlar to whey on sensory evaluation

2.1.2 接種量的確定

圖2 接種量對感官評分的影響Fig.2 Effect of inoculum on sensory evaluation

由圖2可知，在原料比例固定情況下，黑枸杞乳清酒感官評分隨接種量的增加整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在接種量為1.0%時感官評分達到最大值84.1分，此時黑枸杞乳清酒香味協(xié)調(diào)，口感平衡，故最佳接種量確定為1.0%。

2.1.3 發(fā)酵時間的確定

圖3 發(fā)酵時間對感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation

由圖3可知，在其他條件不變情況下，發(fā)酵時間對黑枸杞乳清酒感官評分的影響類似于接種量對其的影響。在發(fā)酵120 h時感官評分達到最大值89.9分，此時黑枸杞乳清酒光澤協(xié)調(diào)，酒體醇厚。隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液糖度下降和酒精度升高使黑枸杞乳清酒口感缺少柔和性，故最佳發(fā)酵時間確定為120 h。

2.2 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以黑枸杞汁與乳清液的比例、酵母接種量和發(fā)酵時間為評價因素，以感官評分為評價指標，進行正交試驗，結(jié)果與分析見表3。

表3 黑枸杞乳清酒發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of black medlar whey wine

由表3可知，影響黑枸杞乳清酒感官評價的因素主次順序為黑枸杞汁與乳清液體積比（A）＞發(fā)酵時間（C）＞接種量（B），最優(yōu)工藝組合為A2B3C1，即黑枸杞汁∶乳清液為1∶3、接種量1.1%、發(fā)酵時間115 h，在此條件下所得黑枸杞乳清酒的感官評分為90.2分。

2.3 黑枸杞乳清酒的揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

采用HS-SPME結(jié)合GC-MS萃取分離鑒定黑枸杞乳清酒中的揮發(fā)性成分，通過美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫檢索，黑枸杞乳清酒的揮發(fā)性風味物質(zhì)組成見表4。

由表4可知，在檢測到的揮發(fā)性風味物質(zhì)中，酯類化合物所占的比例最大，占全部揮發(fā)性風味物質(zhì)的72.42%，共有41種，其中癸酸乙酯含量最高，占總揮發(fā)性物質(zhì)的28.57%，其次是辛酸乙酯，占20.87%。癸酸乙酯具有有椰子香味[23]，辛酸乙酯具有梨子香味[24]。酯類物質(zhì)是酒體中最活躍的成分，整體提供了怡人的果香香氣，可使黑枸杞乳清酒變得清甜醇香[25]。

表4 黑枸杞乳清酒揮發(fā)性成分的GC-MS聯(lián)用分析結(jié)果Table 4 Analysis of volatile substances in black medlar whey wine by GC-MS

續(xù)表

醇類物質(zhì)所占比例僅次于酯類物質(zhì)，占檢出總量的24.76%。共有10種，其中異戊醇和2-甲基丁醇含量較高，分別為9.29%和6.72%。異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味[26-27]，2-甲基丁醇是一種香味成分，這兩種物質(zhì)在形成黑枸杞乳清酒整體風味中具有重要作用。

酸類物質(zhì)檢測到4種，分別為己酸、辛酸、順式-13-十八酸和E-9-十四烯酸，只占風味物質(zhì)檢出總量的0.39%。適量的酸可對黑枸杞乳清酒起緩沖作用，協(xié)調(diào)、烘托黑枸杞乳清酒的主體香。酚類物質(zhì)檢測到2種，其中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有香辛料、丁香和發(fā)酵樣香氣，兼具有炒花生香氣。另外，還檢測到1種醛類物質(zhì)、1種酮類物質(zhì)和9種烴類及其衍生物，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了黑枸杞乳清酒獨特的風味。

3 結(jié)論

采用單因素及正交試驗對以乳清粉和黑枸杞為原料的黑枸杞乳清酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明，黑枸杞乳清酒最佳發(fā)酵工藝為黑枸杞汁與乳清液體積比1∶3、接種量1.1%、發(fā)酵時間115 h、發(fā)酵溫度28 ℃。在此工藝條件下，得到的黑枸杞乳清酒呈透亮紫色、口感純正、風味良好，感官評分為90.2分。

利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析黑枸杞乳清酒揮發(fā)性風味成分，共鑒定出68種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中包括酯類41種（含量72.42%），醇類10種（含量24.76%），酸類4種（含量0.39%），醛類1種（含量0.14%），酚類2種（含量0.53%），酮類1種（含量0.04%），烴類及其衍生物9種（含量1.70%）。黑枸杞乳清酒中主要風味物質(zhì)為酯類、醇類和酸類。主要風味化合物為癸酸乙酯（28.57%）和辛酸乙酯（20.87%）等。