不同乳酸菌胞外分泌物抗氧化活性的研究

黃 麗，楊 攀，曾慶坤，謝美華，孫 寧，唐 艷，李 玲*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；3.皇氏集團(tuán)股份有限公司，廣西 南寧 530000）

生物機體正常情況下?lián)碛型暾难趸?抗氧化平衡機制，當(dāng)外界條件破壞平衡引起機體發(fā)生氧化應(yīng)激，破壞機體內(nèi)生物大分子和加速老化，進(jìn)而引發(fā)高血壓、缺血性心臟病、關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病[1]。

乳酸菌被公眾認(rèn)為是最安全的食品級微生物，具備抗過敏、緩解乳糖不耐癥、提高機體免疫力等生理功能[1-2]。近幾年，有專家指出氧化應(yīng)激與慢性病等密切相關(guān)，乳酸菌屬于天然的抗氧化劑，通過清除活性氧和自由基、螯合金屬離子、多種氧化還原調(diào)控系統(tǒng)和激活抗氧化體系等途徑發(fā)揮抗氧化作用，逐漸引起研究人員的廣泛重視[3]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有明顯的抗氧化作用，能清除自由基、提高抗氧化酶活力、螯合金屬離子等[4]，且被大量體內(nèi)外試驗證實其良好的抗氧化活性[5]。目前研究熱衷于檢測乳酸菌不同部位的抗氧化能力，通過測定脂質(zhì)過氧化抑制能力、自由基清除能力和動物學(xué)實驗來評價抗氧化效果，其中自由基清除能力是應(yīng)用較多的評價指標(biāo)，包括清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基、過氧化物、超氧陰離子的能力以及過氧化氫能力[6]。黃玉軍等[7]對分離自長壽人群腸道6株乳酸菌體外抗氧化活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)菌株發(fā)酵上清液的抗氧化活性總體要優(yōu)于菌體和胞內(nèi)提取物。王曦等[8]對35株乳酸菌的菌體、無細(xì)胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進(jìn)行研究，抗氧化活性物質(zhì)較多分布在乳酸菌胞外分泌物中。姚杰玢等[9]也同樣發(fā)現(xiàn)所研究的8株乳酸菌中發(fā)酵上清液對自由基的清除能力遠(yuǎn)高于完整細(xì)胞和無細(xì)胞提取物。

本研究擬通過測定羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH 自由基的清除率以及還原能力，對不同來源（干酪、生水牛乳、酸奶、牛乳房邊緣）的28株乳酸菌胞外分泌物的體外抗氧化能力進(jìn)行檢測，并分析不同檢測方法的相關(guān)性，評價不同乳酸菌抗氧化能力，為后期開發(fā)乳酸菌抗氧化制劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗中所用的28 株乳酸菌均保存在廣西水牛研究所，其詳細(xì)信息見表1。

表1 實驗所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 化學(xué)試劑

鐵氰化鉀（分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、三氯化鐵、無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸、30%過氧化氫（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；DPPH（分析純）：美國Sigma公司；維生素C（vitamin C，VC）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PB-10 pH計：德國賽多利斯集團(tuán)；SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YM 50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機、LP Vortex Mixer旋渦振蕩器：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的培養(yǎng)及胞外分泌物的制備

分別取28株乳酸菌凍存菌液100 μL于6 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活化菌株?；罨蟀?%接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，收集發(fā)酵液，用超純水將乳酸菌的菌數(shù)調(diào)整至108CFU/mL，經(jīng)8 000 r/min條件下4 ℃離心30 min，收集發(fā)酵上清液，即為乳酸菌胞外分泌物，用0.45 μm的濾膜過濾，放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2 乳酸菌胞外分泌物的抗氧化活性

為了更直觀表明樣品的抗氧化能力，選用VC作為陽性對照，將樣品抗氧化能力轉(zhuǎn)化為同一清除率數(shù)值下對應(yīng)的VC濃度范圍，以VC當(dāng)量進(jìn)行對照評價。

（1）DPPH自由基的清除能力測定

參照文獻(xiàn)[12]所述方法進(jìn)行測定，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液的吸光度值；A1為1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液的吸光度值；A2為1.5 mL樣品液加1.5 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

（2）羥自由基的清除能力測定

參照文獻(xiàn)[13]所述方法并略有修改，羥基自由基清除率計算公式如下：

（3）超氧陰離子自由基的清除能力測定

參考文獻(xiàn)[10]所述方法，略有改進(jìn)，超氧陰離子清除率計算公式如下：

式中：ΔA0為對照組的吸光度值做出曲線的斜率；ΔA1為樣品的吸光度值做出曲線的斜率。

（4）還原能力測定

按照參考文獻(xiàn)[14]所述方法，以蒸餾水代替FeCl3溶液作為空白調(diào)零，于波長700 nm 處測定吸光度值。以吸光度值反映樣品的還原能力，吸光度值越大，說明還原能力及抗氧化性越強。

1.3.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，采用Duncan進(jìn)行單因素方差分析，采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。每個實驗進(jìn)行2次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X+SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對DPPH自由基清除能力的比較

DPPH 自由基一種以氮為中心穩(wěn)定性很好的大分子，與具有抗氧化活性的物質(zhì)反應(yīng)后在波長517 nm 處吸收峰減弱，以此變化來評價抗氧化能力，DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強，是一種常用于評價抗氧化效果的有效方法[8]。本研究在反應(yīng)體系中加入28株乳酸菌胞外分泌物，測定其對DPPH自由基的清除效果從而確定其抗氧化性能，結(jié)果見表2。

表2 28株乳酸菌的胞外分泌物對DPPH自由基的清除率Table 2 DPPH free radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

由表2可知，28株菌株都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力，清除能力較強且差異較大，清除率為29.80%～74.90%，為0.004～0.010 mg/mL VC當(dāng)量。其中乳酸菌WC5、ZC1、WM7、GC2、RY1、ZC2、WC1、WC4具有較強的清除能力，均在66%以上，為0.008 mg/mL 以上的VC當(dāng)量，與其余乳酸菌的DPPH自由基清除能力差異顯著（P＜0.05）。同時，研究也發(fā)現(xiàn)在菌株在種內(nèi)和來源也存在著一定的差異。其中菌株ZC1、ZC2、ZM3、ZB4都屬于植物乳桿菌，但存在顯著的種內(nèi)差距（P＜0.05）；6株WC都是來源于干酪的戊糖乳桿菌，但WC1、WC4、WC5的DPPH自由基清除率顯著高于WC2、WC3、WC6（P＜0.05），表現(xiàn)出相同來源的種內(nèi)差距；菌株RY1、RB2、RM3為不同來源的乳酸乳球菌，DPPH自由基清除率有顯著性差異（P＜0.05），表現(xiàn)出不同來源的種內(nèi)差距。本研究結(jié)果與其他學(xué)者[15-16]的研究結(jié)果一致，這種差異可能是由不同來源的菌株DPPH自由基的活性物質(zhì)的含量或種類不同造成的。

2.2 乳酸菌對羥自由基清除能力的比較

生命體代謝過程中在線粒體內(nèi)產(chǎn)生自由基并釋放到細(xì)胞質(zhì)中，其中羥自由基的氧化性極強，與生物大分子發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)造成細(xì)胞損傷，乳酸菌細(xì)胞內(nèi)存在螯合Cu2+和Fe2+的天然物質(zhì)，在此反應(yīng)之前將自由基清除，從根本上減少羥自由基，測定乳酸菌對羥自由基的清除率能反應(yīng)其抗氧化效果，羥自由基的清除率越高，表明抗氧化能力越強[17-18]。本實驗對28株乳酸菌胞外分泌物的羥自由基清除能力進(jìn)行了研究，結(jié)果見表3。

表3 28株乳酸菌的胞外分泌物對羥自由基的清除率Table 3 Hydroxyl free radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

由表3可知，所有菌株都表現(xiàn)出一定的羥自由基清除能力，清除率在10.97%～58.67%，為0.04～0.2 mg/mL VC當(dāng)量。其中菌株GC2、ZC1、WM7、RY1、WM8表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力，達(dá)到54%以上，為0.1～0.2 mg/mL VC當(dāng)量，顯著高于其他菌株（P＜0.05），遠(yuǎn)高于王曦等[6]研究的35株乳酸菌胞外分泌物的羥自由基清除能力，而ZB4表現(xiàn)出最低的還羥自由基清除能力，僅為10.97%，為0.04 mg/mL VC當(dāng)量?？赡苁遣煌樗峋那宄u自由基活性物質(zhì)成分或含量不同造成。另外，菌株在種內(nèi)和種間也存在著一定的差異，德氏乳桿菌DF1和DY2之間的羥自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），表現(xiàn)出種內(nèi)差異；不同種植物乳桿菌ZC1、ZC2、ZM3、ZB4和德氏乳桿菌DF1、DY2之間的羥自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），表現(xiàn)出種間差異，這可能是不同乳酸菌所含活性物質(zhì)不同所決定的。

2.3 乳酸菌對超氧陰離子自由基清除能力的比較

超氧陰離子是氧氣在需氧生物體內(nèi)生成的第一種自由基，可以在金屬離子的催化作用下發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生活性較高的羥自由基，會對植物組織有損害作用，是抗氧化性能的重要指標(biāo)。有學(xué)者[19]研究發(fā)現(xiàn)，人體在攝入某些乳酸菌后，能有效降低活性氧、超氧陰離子和過氧化氫的濃度。本實驗對28株乳酸菌胞外分泌物的超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行了研究，結(jié)果見表4。

表4 28株乳酸菌的胞外分泌物對超氧陰離子自由基的清除率Table 4 Superoxide anion radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

由表4可知，28株乳酸菌的胞外分泌物均具有較強的超氧陰離子自由基清除能力，其清除率在70.83%～98.26%之間。其中有5株乳酸菌GB8、GY7、DY2、GC2、RY1胞外分泌物的清除率＞87%，為0.08～0.30 mg/mL VC當(dāng)量，并且與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。同時檢測出GY3的清除能力最弱，但其清除率也＞70.83%，為0.06～0.07 mg/mL VC當(dāng)量。研究表明，乳酸菌清除超氧陰離子的活性物質(zhì)大部分存在于細(xì)胞外，存在于乳酸菌的代謝分泌物中，本研究的乳酸菌的胞外分泌物清除率高于其他學(xué)者研究中的其他部位。姚杰玢等[9]對8株乳酸菌的超氧陰離子清除能力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)菌株R36的發(fā)酵上清液、完整細(xì)胞菌懸液和無細(xì)胞提取物清除率最高，其中發(fā)酵上清液72.02%為三者最高，但遠(yuǎn)低于本實驗中大部分乳酸菌胞外分泌物的超氧陰離子清除率。

2.4 乳酸菌對還原能力的比較

還原能力是指還原酶和非酶復(fù)合物抵抗氧脅迫和降低螯合亞鐵離子的能力，是體外評價抗氧化活性的關(guān)鍵指標(biāo)，通過使Fe3+（鐵氰化鉀）生成Fe2+（亞鐵氰化鉀），F(xiàn)e2+再和FeCl3反應(yīng)生成布魯士藍(lán)色化合物，測定波長700 nm 處最大吸光值來反應(yīng)還原能力大小，其抗氧化能力，A700nm值越大，其還原能力越大，抗氧化作用也越大[1，15，21]。由表5可知，28株乳酸菌胞外分泌物均具有一定的還原能力，A700nm值的范圍在0.578～0.964，為0.1～0.2 mg/mL VC當(dāng)量，其中菌株GB8、FB1、RY1、WM8、GY7、RM3、GC2、ZC1 表現(xiàn)出較強的還原能力，均達(dá)到0.820以上，顯著高于其他菌株（P＜0.05），而菌株FM3的還原能力最低，A700nm為0.578，為0.08 mg/mL VC當(dāng)量。除了戊糖乳桿菌和干酪乳桿菌之外，其余4個種屬均表現(xiàn)出顯著種內(nèi)差異（P＜0.05）；植物乳桿菌ZC1、ZC2、ZM3、ZB4與發(fā)酵乳桿菌FB1、FB2、FM3又存在顯著種間差異（P＜0.05）。這個結(jié)果與[16]研究一致，該研究指出17株乳酸菌的無細(xì)胞提取物的還原能力存在種內(nèi)和種間差異。由此可推斷，乳酸菌具還原能力的活性物質(zhì)也存在代謝分泌物中，但不同屬或同屬不同菌株的乳酸菌胞外分泌物具有還原能力的活性物質(zhì)存含量不同。

表5 28株乳酸菌的胞外分泌物的還原能力Table 5 Reducing capacity of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

2.5 不同抗氧化活性測定方法間的相關(guān)性

體外評價方法屬于化學(xué)方法，是在體外模擬氧化反應(yīng)過程，通過測定不同生理狀態(tài)乳酸菌的還原能力、清除自由基能力等指標(biāo)，評價其抵抗氧脅迫的能力。由于各種評價指標(biāo)方法的測定機理不同，單一的化學(xué)方法來篩選高抗氧化活性的乳酸菌菌株有一定局限性，因此對所用到方法進(jìn)行相關(guān)性分析，評價其相關(guān)性。4種不同的方法測定結(jié)果表明，本研究中的不同乳酸菌胞外分泌物均有一定的抗氧化能力，其中菌株GC2在4種方法中均名列前7以上，表現(xiàn)出最強的綜合抗氧化能力，菌株ZB4在4種分析方法中均為倒數(shù)第四以后，表現(xiàn)出最弱的綜合抗氧化能力。本研究通過比較4種體外抗氧化活性分析方法的相關(guān)性，結(jié)果見表6。

表6 抗氧化活性分析方法間相關(guān)性Table 6 Correlation between different analytical methods of antioxidant activity

由表6可知，羥自由基與DPPH自由基（R=0.633）、超氧陰離子自由基與還原能力（R=0.488）方法間極顯著相關(guān)（P＜0.01）；羥自由基與還原能力（R=0.295）方法間顯著相關(guān)（P＜0.05）。而DPPH自由基與超氧陰離子、還原能力，羥自由基與超氧陰離子自由基方法間沒有顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。這與謝麗源[14]的研究結(jié)果是一致的。結(jié)果表明，化學(xué)方法的測定機理不同，而乳酸菌抗氧化作用模式多樣，單一方法不具有代表性，應(yīng)盡量選擇幾種評價抗氧化的方法。

3 結(jié)論

本研究主要對28株乳酸菌胞外分泌物的3種自由基清除率及還原能力進(jìn)行測定，來源于牛乳房邊緣的副干酪乳桿菌GB8 的胞外分泌物對超氧陰離子自由基清除率最高，為98.26%，為0.10～0.30 mg/mL VC當(dāng)量；還原能力也最強，A700nm值為0.964，為0.1～0.2 mg/mL VC當(dāng)量。從干酪分離的戊糖乳桿菌WC5對DPPH自由基的清除率最高，為74.90%，為0.01 mg/mL VC當(dāng)量。干酪乳桿菌GC2對羥自由基清除率最高為58.67%，為0.1～0.2 mg/mL VC當(dāng)量，其對DPPH的清除率為73.09%，對超氧陰離子自由基清除率為87.50%，還原能力的A700nm值為0.806，表現(xiàn)出最強的綜合抗氧化能力。由此，篩選得到GB8、WC5和GC2三株抗氧化能力相對較強的乳酸菌菌株，可用于抗氧化劑的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。同時對不同測定方法間的相關(guān)性進(jìn)行研究，羥自由基與DPPH自由基（R=0.633）、超氧陰離子自由基與還原能力（R=0.488）；羥自由基與還原能力（R=0.295）這幾種方法的相關(guān)性較高，不同的體外評價抗氧化能力方法所得結(jié)果間具有不同的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。在本研究的基礎(chǔ)上，將篩選出的有效菌株GB8、WC5和GC2進(jìn)一步做體內(nèi)抗氧化模型，分析乳酸菌抗氧化的物質(zhì)成分，分離抗氧化活性物質(zhì)，并對目前尚不太清除的乳酸菌抗氧化作用機制作深入研究。