硒代半胱氨酸生物合成研究進(jìn)展

何家偉，杜 馨，蔡 俊*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）是蛋白質(zhì)中硒的主要存在形式，也是唯一含有準(zhǔn)金屬元素的氨基酸[1]。Sec被稱為第21種氨基酸[2]，作為活性中心存在于谷胱甘肽過(guò)氧化酶、硫氧還蛋白還原酶、甘氨酸還原酶、甲酸脫氫酶等含硒酶中。其在合成高活性硒化物，生產(chǎn)富硒食品，醫(yī)藥保健方面有著巨大潛力。如硒代半胱氨酸的甲基化衍生物硒甲基半胱氨酸（methyl selenocysteine，SeMcys）是一種有著良好抗癌前景的物質(zhì)。硒甲基半胱氨酸具有補(bǔ)硒、防治癌癥、抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病、解重金屬毒等作用[3]。硒代半胱氨酸是多種低分子硒代多肽類物質(zhì)的組分[4]。包含硒代半胱氨酸殘基的蛋白稱為硒蛋白[5]。含有硒代半胱氨酸的硒蛋白有多種重要作用[6]，是人和動(dòng)物體內(nèi)是不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)硒代半胱氨酸有著良好的市場(chǎng)效益。目前可利用化學(xué)法和生物法合成硒代半胱氨酸。

1 化學(xué)法合成硒代半胱氨酸

化學(xué)法合成硒代半胱氨酸先用氯丙氨酸（C3H6ClNO2）與二硒化鈉（Na2Se2）反應(yīng)生成硒代胱氨酸（SeC），然后用金屬鈉/液氨在-70 ℃的條件下將硒代胱氨酸還原裂解成硒代半胱氨酸[7]。該方法中的化學(xué)反應(yīng)需在-70 ℃的條件下進(jìn)行，且需用到性質(zhì)活潑的金屬鈉，反應(yīng)條件苛刻，工藝設(shè)備要求高，氯丙氨酸原料價(jià)格高，生產(chǎn)成本高，很難投入大規(guī)模的生產(chǎn)中。

2 生物法合成硒代半胱氨酸

植物、動(dòng)物、微生物均能合成硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸在生物體內(nèi)合成需要依賴復(fù)雜的轉(zhuǎn)移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）合成機(jī)制[8]，其tRNA起初由絲氨酸-tRNA連接酶加載絲氨酸（serine，Ser），但其無(wú)法被普通的翻譯因子識(shí)別。該絲氨酰可被含有磷酸吡哆醛的硒代半胱氨酸合成酶替換為硒半胱胺酰。然后Sec-tRNA與硒特異延伸因子（SelB或mSelB）結(jié)合，通過(guò)核糖體翻譯該mRNA。無(wú)機(jī)硒通過(guò)硫的合成途徑，傳遞到核糖體，并插入到新生的硒蛋白[9]。生物法合成硒代半胱氨酸相較于化學(xué)法，反應(yīng)相對(duì)溫和，材料成本低廉，大規(guī)模生產(chǎn)方面更具前景。

2.1 植物合成硒代半胱氨酸及檢測(cè)提取方法

植物硒的主要來(lái)源是土壤中的硒。六價(jià)硒被吸收進(jìn)入植物葉綠體細(xì)胞后在谷胱甘肽和5-磷硫酸腺苷（adenosine 5-phosphosulfate，APS）的作用下轉(zhuǎn)化為四價(jià)硒，然后在植物葉綠體內(nèi)經(jīng)過(guò)半胱氨酸合成酶（cysteine synthase，CSase）的作用轉(zhuǎn)化成硒代半胱氨酸[10]。植物中硒代半胱氨酸合成效率較低，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)較為困難。不同植物來(lái)源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法見表1。

表1 不同植物來(lái)源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法Table 1 Extraction and detection methods of selenocysteine from different plants

2.2 動(dòng)物合成硒代半胱氨酸及檢測(cè)提取方法

動(dòng)物合成硒代半胱氨酸的途徑與微生物合成硒代半胱氨酸途徑相同，但動(dòng)物體內(nèi)硒的轉(zhuǎn)化效率和硒代半胱氨酸合成效率較低，提取手段較為復(fù)雜。在哺乳動(dòng)物中，比較基因組學(xué)和實(shí)驗(yàn)分析表明哺乳動(dòng)物的硒代半胱氨酸合成酶（selenocysteine synthetase，Secs）是含吡咯磷酸鹽（pyrrole phosphate）的蛋白質(zhì)[16]，被稱為可溶性肝抗原。硒代半胱氨酸合成酶需要磷酸硒和膦酰-tRNA[Ser]Sec作為底物產(chǎn)硒代半胱氨酸-tRNA[Ser]Sec[17]。此外，在由硒化物、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和絲氨酸組成的tRNA支架上，用tRNA[ser]sec、seryl-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase）、膦酰-tRNA[Ser]SEC激酶（phosphonoy-tRNA[Ser]Seckinase）、激酶磷酸硒合成酶、硒代半胱氨酸合成酶在tRNA支架上合成了硒代半胱氨酸[18]。不同動(dòng)物來(lái)源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法見表2。

表2 不同動(dòng)物來(lái)源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法Table 2 Extraction and detection methods of selenocysteine from different animals

2.3 微生物合成硒代半胱氨酸

圖1 釀酒酵母硫硒氨基酸生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of sulfur amino acid in Saccharomyces cerevisiae

硒酸鹽在還原酶的作用下與氨基酸結(jié)合成硒代氨基酸再參與生物體代謝，主要生成硒蛋白和含硒酶類。硒與硫在微生物中的代謝途徑和是相似的，均使用同一個(gè)絲氨酸代謝途徑[25]。圖1顯示了硒進(jìn)入微生物體內(nèi)后的代謝和硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸途徑，以及硒代半胱氨酸合成硒代甲基半胱氨酸和谷胱甘肽途徑。硒化氫（H2Se）與O-乙酰絲氨酸（O-acetyl serine，OAS）在同型半胱氨酸合成酶作用下合成同型硒半胱氨酸，在蛋氨酸合成酶作用下合成硒代蛋氨酸。同型硒半胱氨酸與絲氨酸在半胱氨酸-β-合成酶作用下生成硒代胱硫醚，然后在胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase）的作用下生成硒代半胱氨酸（SeCys）。

硒代半胱氨酸的合成與selA、selB、selC、selD四個(gè)基因的產(chǎn)物相關(guān)[26]。SelC是一個(gè)特異性的硒代半胱氨酸-tRNASec，在進(jìn)行翻譯時(shí)，SelC會(huì)被氨?；?，在Seryl-tRNA合成酶催化完成反應(yīng)，同動(dòng)物硒代半胱氨酸合成途徑相似，形成SertRNASec提供了基本的碳骨架來(lái)生成硒代半胱氨酸[27]。

2.4 常用硒代半胱氨酸檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

比色法、熒光分光光度法、氫化物-原子熒光法、火焰原子吸收法、氫化物-原子吸收法、石墨爐-原子吸收法、催化動(dòng)力學(xué)光度法、高效液相色譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法[28]是常用測(cè)定總硒含量的方法。但上述方法并不能完全有效的檢測(cè)硒代半胱氨酸，需對(duì)硒代半胱氨酸進(jìn)行高效的分離提取，并與檢測(cè)方法聯(lián)用對(duì)硒代半胱氨酸進(jìn)行測(cè)定。硒代半胱氨酸檢測(cè)提取方法及優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表3 硒代半胱氨酸檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 Advantages and disadvantages of detection methods for selennocysteine

3 微生物發(fā)酵生產(chǎn)硒代半胱氨酸進(jìn)展

動(dòng)、植物生產(chǎn)硒代半胱氨酸成本高，且受季節(jié)、地域、氣候的限制。而微生物生長(zhǎng)速度快，原料經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，便于培養(yǎng)，產(chǎn)出效率高，可通過(guò)控制培養(yǎng)條件提高產(chǎn)量，故利用微生物生產(chǎn)硒代半胱氨酸。

3.1 富硒菌種選育

硒代半胱氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)需先選育出高耐硒性菌株。硒酸鹽或亞硒酸鹽作為添硒劑，均對(duì)菌種產(chǎn)生毒性并對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用[29]，要想得到具有高硒積累能力的菌株，其在生長(zhǎng)過(guò)程中需表現(xiàn)出較高的抗硒鹽能力[30]，故選育菌種需有一定的耐硒性。篩選過(guò)程前需對(duì)菌種的富硒能力進(jìn)行評(píng)估，選用富硒能力強(qiáng)的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。菌種選育階段首先需考慮抗性篩選過(guò)程，對(duì)樣本菌種進(jìn)行不同濃度硒的梯度培養(yǎng)，以達(dá)到初篩目的。微生物主要利用透性酶對(duì)硒吸收，已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌硫透性酶基因有cysA，cysU，cysW，以上基因發(fā)生突變將會(huì)提高硒的耐受性[31]。在此基礎(chǔ)上對(duì)具有耐硒能力的菌種繼續(xù)采用誘變育種的方式篩選。

富硒誘變育種通常采用紫外線照射或亞硝酸等誘變劑進(jìn)行單因素誘變，王小波等[32]以富硒酵母Y2為出發(fā)菌株，通過(guò)60Coγ射線照射誘變育種，篩選獲得一株生物量和富硒能力都較高的突變菌株YR166，進(jìn)行富硒培養(yǎng)后硒含量達(dá)到2 531.4 μg/g，較原菌株提高74.2%，酵母生物量達(dá)到14.9 g/L，較原菌株提高36.7%。復(fù)合誘變相對(duì)于單因素誘變過(guò)程更為復(fù)雜，但可以更有針對(duì)性的培育菌種，達(dá)到更好的誘變效果。曾禮華等[33]以熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis）1254為出發(fā)菌株進(jìn)行了亞硝基胍誘變和亞硒酸鈉抗性篩選，紫外線誘變和乙硫氨酸抗性篩選等兩輪突變和篩選，獲得突變菌株1254-6-1，其生物量、總硒含量、有機(jī)硒的含量及轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%，分別為原始出發(fā)菌株的1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍。富硒復(fù)合誘變流程如下：硒鹽抗性初篩→選出硒耐受性及富硒能力強(qiáng)的菌株→亞硝基胍誘變及硒鹽抗性復(fù)篩→進(jìn)一步篩選富硒能力強(qiáng)的菌株→紫外誘變及乙硫氨酸抗性篩選→富硒菌株。以上步驟篩選出的菌株一般具有良好的抗硒性。從中繼續(xù)篩選硒代半胱氨酸產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。

3.2 硒代半胱氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化

通常有兩種硒源在實(shí)驗(yàn)中被廣泛使用，亞硒酸鈉（Na2SeO3）和硒酸鈉（Na2SeO4），對(duì)于兩種不同價(jià)態(tài)的硒，硒代半胱氨酸產(chǎn)率也不同。兩種硒鹽對(duì)菌體的生長(zhǎng)均有抑制作用，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中添加硒酸鈉能提高有機(jī)硒的產(chǎn)量。因?yàn)閬單徕c不同于硒酸鈉，可與還原糖（如葡萄糖）反應(yīng)生成單質(zhì)Se[34]，而生物幾乎無(wú)法利用單質(zhì)Se。

發(fā)酵過(guò)程中，由于硒與硫在菌體吸收過(guò)程中的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，富硒過(guò)程中需控制硫與硒的比值發(fā)酵。MAPELLI V等[34]在高硫硒比和低硫硒比的情況下對(duì)釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)只有在缺硫的情況下硒才會(huì)被完全消耗，但由于硒鹽對(duì)菌體的毒性，在缺硫條件下細(xì)胞會(huì)生長(zhǎng)不良；在高硫硒比時(shí)，硒難以被菌體所吸收。合適的硫硒比在硒代半胱氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中尤為關(guān)鍵。酵母細(xì)胞在添加硒鹽后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞尺寸減小[35]，具體原因還有待研究。DHANJAL S等[36]發(fā)現(xiàn)隨著硒鹽濃度的增加，細(xì)菌細(xì)胞大小隨之減小。細(xì)胞大小和數(shù)量的減少在細(xì)胞形態(tài)上可歸因于高濃度有毒離子對(duì)生長(zhǎng)細(xì)胞施加的脅迫。換而言之，單個(gè)細(xì)胞體積減小，它們的相對(duì)表面積更大，能更好地吸收環(huán)境脅迫條件下的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

發(fā)酵方式的選用對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)吸收至關(guān)重要。補(bǔ)料分批發(fā)酵比其他發(fā)酵方式在調(diào)整營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度方面有更大的優(yōu)勢(shì)。將常用碳源葡萄糖的濃度維持在適當(dāng)?shù)乃剑瑧?yīng)用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，以控制葡萄糖效應(yīng)，提高細(xì)胞密度[37]。發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵參數(shù)如酵母細(xì)胞產(chǎn)率、發(fā)酵效率、有機(jī)硒生產(chǎn)率、產(chǎn)量和消耗率、生物量、底物和硒代半胱氨酸的濃度等進(jìn)行測(cè)定。其他因素包括蒸發(fā)氣體損失，pH值測(cè)定，消泡手段，生物量體積，樣品的提取，這些都是影響酵母生長(zhǎng)的因素[38]。

4 展望

本文探討了硒代半胱氨酸的生物合成以及檢測(cè)提取方法。植物、動(dòng)物、微生物中均能合成硒代半胱氨酸，但植物、動(dòng)物中產(chǎn)硒代半胱氨酸效率較低，微生物較二者更適合生產(chǎn)硒代半胱氨酸。介紹了硒代半胱氨酸多種檢測(cè)提取方法。從菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化兩方面概述微生物發(fā)酵生產(chǎn)硒代半胱氨酸方法。需注意以下幾點(diǎn)：高耐硒性菌株的選育和誘變篩選方式選用，硒源、發(fā)酵方法的選取以及適當(dāng)硫硒比對(duì)微生物產(chǎn)硒代半胱氨酸的影響。

微生物合成硒代半胱氨酸可以從以下幾個(gè)方面拓展：（1）Sec常與其二聚體（Seenocystine，Sec2）混淆，易導(dǎo)致硒代半胱氨酸無(wú)法被準(zhǔn)確的定性和定量，該問(wèn)題是Sec檢測(cè)方面值得深入研究?jī)?nèi)容。（2）在誘變育種基礎(chǔ)上能夠通過(guò)原生質(zhì)體融合或基因工程的方法進(jìn)一步提高菌種的耐硒性或是提高菌種產(chǎn)硒代半胱氨酸能力。（3）微生物利用硒代半胱氨酸產(chǎn)出相應(yīng)高活性硒化物。硒代半胱氨酸可在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶的催化下，與谷氨酸可能發(fā)生反應(yīng)生成谷氨酰硒半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶催化下該產(chǎn)物進(jìn)一步與甘氨酸反應(yīng)可能生成硒代谷胱甘肽。硒代谷胱甘肽（GSeH）是谷胱甘肽（glutathione，GSH）的硒類似物，氧化型硒代谷胱甘肽（selenoglutathione）是一種具有類似谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）抗氧化能力的物質(zhì)[39]，其還原物硒代谷胱甘肽的抗氧化能力更強(qiáng)。

堅(jiān)信隨著社會(huì)發(fā)展和研究深入，人們將會(huì)科學(xué)認(rèn)識(shí)和了解硒代半胱氨酸以及其衍生物，基于微生物發(fā)酵生產(chǎn)相應(yīng)高活性抗癌硒化物將越來(lái)越受人們青睞，在食品、醫(yī)療等方面具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和和社會(huì)效益。