香茅psbA-trnH序列鑒定及揮發(fā)油成分氣質(zhì)聯(lián)用分析

吳雙雙，徐榕青，林文津，鄭榮生，徐小妹，張亞敏，李麗莎，盧雪花

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350003；2. 福建省醫(yī)學科學研究院、福建省醫(yī)學測試重點實驗室，福建 福州 350001；3. 南平市王臺越王香業(yè)有限公司，福建 南平 353003)

香茅別名檸檬草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，禾本科香茅屬芳香性植物，具有疏風解表，祛瘀通絡，治感冒頭痛、胃痛、泄瀉、風濕痹痛、跌打損傷等藥用價值，其對生長環(huán)境要求較低而在全國多地分布廣泛，具有很高的開發(fā)價值。研究表明香茅揮發(fā)油中有多種有效成分，包括香茅醇、香葉醇、檸檬醛及丁香酚等。其地上部分的揮發(fā)油提取物具有胃保護和治愈胃潰瘍作用[1]，同時大量報道顯示香茅提取物中含有的香茅醇、香茅醛、檸檬醛等物質(zhì)具有抗氧化作用[2]、預防或治療神經(jīng)退行性疾病及炎癥[3]、抗病毒作用[4]，近期研究證明其具有抗腫瘤作用，臨床上使用其主要成分檸檬醛治療前列腺癌[5]。香茅在食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領域也有很重要的應用價值，對香茅進行準確的物種鑒定對其在各領域應用有重要意義。

DNA條形碼中藥種屬鑒定是一種能夠利用較短DNA片段對藥材進行種屬鑒定的分析手段，鑒定系統(tǒng)已經(jīng)較為完善[6]，彌補了傳統(tǒng)植物鑒定方法的缺陷，對中藥傳承和發(fā)展有著重要的作用。本研究通過DNA條形碼序列測評，對植物香茅進行了種屬鑒定。確定種屬之后選擇了氣質(zhì)聯(lián)用的手段對香茅揮發(fā)油進行了定性定量分析，氣質(zhì)聯(lián)用是一種研究中藥揮發(fā)性成分的有效方法，具有高效、低檢測限、準確度高等優(yōu)良特性[7]，香茅的定量定性分析可以較好的確定香茅品質(zhì)優(yōu)劣，以期為香茅在重要市場上的準確應用提供有效的參考。

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器

氣質(zhì)聯(lián)用儀(7890B-5977A，美國Agilent公司)；PCR儀(T100，美國Bio-Rad公司)；超微量紫外分光光度計(DUO型號，Bio-Drop公司)；電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)。

1.2 實驗藥材與試劑

香茅采自福建省南平市延平區(qū)，經(jīng)福建省醫(yī)學科學研究院副研究員林文津老師鑒定為禾本科香茅屬香茅(拉丁學名：Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf )；2 × Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司，AS111-14)；DL1000 DNA Marker(合肥博美生物科技有限公司，20180413)；氯仿、異戊醇、異丙醇、β-巰基乙醇、無水乙醚及無水硫酸鈉均為國產(chǎn)分析純。PCR擴增引物信息：psbAF：5'-GT TATGCATGAACGTAATGCTC-3；trnHR: 5'-CGCG CATGGTGGATTCACAATCC-3'，由上海生工合成。

2 方法

2.1 待測液制備

取香茅新鮮葉片0.2 g，無水乙醇擦洗香茅葉片表面，采用CTAB法提取植物DNA[8]，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取一定量的香茅粉末，置于1500 ml的圓底燒瓶中，加入4倍量的水，攪拌使粉末被充分浸潤，24 h后，加入6倍水，加熱至微沸后保持180 min[9]，停止加熱，保持冷凝狀態(tài)至裝置冷卻完全，在揮發(fā)油提取器中讀取所提揮發(fā)油的體積，收集油水混合物，用10 ml乙醚萃取3次，收集合并上層清夜，加無水硫酸鈉除水后過濾，置于室溫下?lián)]至2 ml，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴增與測序

采用超微量紫外分光光度計對樣品DNA的濃度和純度進行檢測并記錄。植物類中藥材及其基原物種選擇psbA-trnH序列作為擴增序列，利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)庫搜索藥材香茅得到香茅psbA-trnH序列信息，確定為PCR擴增目的基因[9]。從中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)查詢到植物通用的DNA條形碼片段(psbA-trnH)序列擴增通用引物對香茅DNA進行PCR擴增[9]。

PCR反應體系：DNA模版2 μL；上游引物2 μL；下游引物2 μL；2×Taq PCR Mix 25 μL；ddH2O 19 μL；total 50 μL。PCR反應程序：psbA-trnH：預變性溫度94℃，10 min；變性溫度94℃，30 s；退火溫度56℃，30 s延伸溫度72℃，45 s；最終延伸溫度72℃，10 min，35個循環(huán)。

使用測序儀將擴增成功的PCR產(chǎn)物進行雙向測序。測序峰圖采用序列拼接軟件進行校對拼接，得到香茅的DNA序列。使用BLAST序列對比軟件及Evoliew法構(gòu)建距離樹法對測得的DNA序列與數(shù)據(jù)庫中香茅DNA進行比對驗證。

2.3 氣質(zhì)聯(lián)用分析揮發(fā)油成分

氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 m × 250 μm × 0.25 μm)，程序升溫(初始溫度為50℃，保持3 min，以5℃·min-1上升至250℃，保持7 min)，載氣為氦氣，采用恒流模式，柱流量為0.8 ml·min-1，平均線速度為32.597 cm·s-1，進樣量為0.4 μL，進樣口溫度250℃，分流比1∶40。

質(zhì)譜條件：采用EI電離方式，EU電壓1200 V，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描范圍m/z 50-550。

按上述實驗條件，對供試品溶液進行氣質(zhì)分析，得到氣質(zhì)總離子流圖如圖1。經(jīng)質(zhì)譜工作站W(wǎng)iley275、CAS、NIST11標準質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫對化合物進行檢索，并結(jié)合圖譜分析，鑒定樣品組成。

圖1 香茅揮發(fā)油氣質(zhì)總離子流圖Fig. 1 Total ion flow of citronella essential oil

3 實驗結(jié)果

3.1 香茅的DNA測序結(jié)果

DNA雙向測序得到香茅DNA條形碼的序列為：CTCTAGACCTAGCTGCTCTTGAGTTCCATCTCTT

AATGGATAAGGTTTTCTCCTAAACATATAGGAATTT

TTGAAGGAAGGAAAGCCGGAAATACCCAATATCTT

GTTCCAACAGGATATTGGGTATTTCTTTGTTTATTCT

GAATCTTTCTATTCTGAATTCAATTAACGACGAGAT

TTAGTATCCTTTCTTGTACTTTCATAACTCGTGAAAT

GCCGAGTAGGCACGAATTCCCCCAATTTGCGACCT

ACCATAGGATTTGTTATGTAAATAGGTATATGTTCT

TTTCCATTATGAATCGCGATTGTATGGCCAACCATT

GCGGGTAGAATGCTAGATGCCCGGGACCACGTTAC

TATTATTTCTTTCTCCTCCTTCATATTGACCTTTTCGA

TTTTTGCCAATAAATGACGAGCTACAAAAGGATTCG

TTTTTTTTCGTGTCACAGCTGATTACTCCTTTTTTTC

ATTTTAAAGAGTGGCATCCTATGTCCACTATCTCGA

TCGAGGTATGGAGGTCAGAATAAATAGAATAATAA

TGAATGGAAAAAAGAGAAAATCCTTTAGCTGGATA

AGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGG

ATTGTGAATCCCCAATGCGCGA(631bp)

3.2 DNA條形碼候選序列鑒定效率評價

3.2.1 BLAST法

去除樣本條形碼序列中頭尾不穩(wěn)定序列，并與基因數(shù)據(jù)庫中所有序列進行堿基比對,結(jié)果顯示：

>Cymbopogon_citratus_GQ435011

Length=535 Score=1088 bits (535)，Expect=0.0 Identities=589/589 (100%)

Strand = Plus / Plus

按堿基差異進行排名，排名第一的物種與樣本物種相同成功鑒定。

3.2.2 Evoliew法構(gòu)建距離樹法：

將樣本的條形碼序列與條形碼數(shù)據(jù)庫中所有序列進行堿基比對，按堿基差異進行排名，對排名靠前的物種序列及樣本序列導入軟件中繪制進化樹。

3.3 GC-MS分析結(jié)果

對氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)果進行定性定量數(shù)據(jù)分析，按面積歸一化法計算各峰在揮發(fā)油中的相對百分含量。成分相對含量大于2.5%且匹配度高于85%的成分如表1所示。

通過對圖1香茅揮發(fā)油總離子流圖的分析，得到揮發(fā)油組分如表1所示，從福建香茅中一共分離出43個組分，檢索符合篩選條件的成分共有9種，已鑒定的主要成分為單萜及其含氧衍生物。其中相對含量較大的有香茅醇(12.76%)、香葉醇(14.54%)、檸檬醛(5.33%)、欖香醇(12.57%)。

4 討論

香茅屬植物形態(tài)相似，傳統(tǒng)鑒別比較依賴專業(yè)人員，使用混亂頻率較高，影響了香茅的質(zhì)量安全和臨床療效。通過GenBank數(shù)據(jù)庫序列對比最終得到香茅及其混偽品序列104種，其近親屬序列及生物形態(tài)與之十分相近，鑒定人員利用傳統(tǒng)經(jīng)驗判斷種屬的準確度難以跟上現(xiàn)實需要，而使用DNA條形碼序列通用引物進行擴增測序可以有效增加種屬鑒定可靠性。研究過程發(fā)現(xiàn)psbA-trnH通用擴增引物與ITS2通用擴增引物對樣本DNA的擴增效果有較大不同，ITS2引物擴增較難，對實驗結(jié)果的準確性影響較差，所以選擇psbA-trnH擴增引物進行擴增。所測序列應用BLAST數(shù)據(jù)庫自動對比分析后的結(jié)果顯示，所測樣品與數(shù)據(jù)庫中所記載的基因序列吻合度為96%，種屬相似度排名62位，通過分析鑒定結(jié)果可以看出，擴增序列與基因庫中香茅序列中間段完全吻合，前段序列出現(xiàn)偏差，可以認為是前段序列不穩(wěn)定所致，吻合度排名靠前的物種與樣品序列在序列中間段存在偏差。由此可見，psbA-trnH序列可有效鑒定香茅及其混偽品，保障香茅的質(zhì)量安全和臨床療效，并為保證藥材在市場上的安全流通和質(zhì)量監(jiān)管提供參考。

圖2 香茅屬相近種屬距離樹Fig. 2 Distance trees of similar genera of Citronella

序號Number保留時間(min)Retention time化合物名稱Compound name相對含量(%)Relative content匹配度(%)Matching degreeCAS號CAS Number114.0513,7-Dimethyl-6-octenal[香茅醛]2.9389000106-23-0216.9163,7-Dimethyl-6-octen-1-ol[香茅醇]12.7693000106-22-9318.182(2E)-3,7-Dimethyl-2,6-octadien-1-ol[香葉醇]14.5490000106-24-1418.2263,7-Dimethyl-2,6-octadienal[檸檬醛]5.5396005392-40-5521.0264-Allyl-2-methoxyphenol[丁香酚]3.2398000097-53-0626.128d-Cadinene[d-杜松]3.6893000483-76-1727.114Cyclohexanemethanol[欖香醇]12.5791000639-99-6829.276Eudesm-4-en-11-ol (8CI)[桉葉油醇]5.2499001209-71-8929.544T-Cadinol[T-杜松醇]4.7691005937-11-1

注：在揮發(fā)油測量器中讀取揮發(fā)油的體積為1.08 ml。

香茅及香茅揮發(fā)油具有較高的藥用、食用價值。本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取香茅揮發(fā)油，揮發(fā)油得率為1.07%，多為低沸點揮發(fā)油成分。香茅揮發(fā)油成分繁多，極個別組分含量較高，且各成分的分子結(jié)構(gòu)、相對含量較接近，可以通過降低樣品濃度、加大分流比、減慢程序升溫的速度等方法實現(xiàn)較好的分離。

通過氣質(zhì)聯(lián)用分析香茅揮發(fā)油的主要成分為香茅醛、香葉醇、香茅醇、檸檬醛、丁香醇，屬于典型的爪哇型香茅[10]。其中香茅醛可作為潛在麻醉劑[11]，香茅醇具有減少糖尿病大鼠中的肝臟組織學損傷并逆轉(zhuǎn)胰腺中胰島的組織學損傷作用[12]、抗白內(nèi)障作用[13]及解痙作用[14]，丁香酚具有明顯的抗菌作用，可以減緩大腸桿菌耐藥性[15]，檸檬醛對于子宮平滑肌的松弛有一定的效果[16]。通過對香茅揮發(fā)油成分的分析，為香茅后續(xù)的質(zhì)量控制、藥理研究及合理利用提供科學依據(jù)。