豬圓環(huán)病毒2型特異性納米抗體文庫的構建及鑒定

王長江，曲光剛,*，武曰星，管宇，魏鳳，侯運專，趙中偉，沈志強,*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 43000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子呈二十面體對稱結構，無囊膜，其基因組為單股環(huán)狀負鏈DNA[1]。PCV2是引起豬皮炎腎病綜合征、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征和母豬繁殖障礙等相關綜合征的致病原[2-3]。PCV2和由它引發(fā)的疾病每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-5]。因此，研制抗PCV2的特異性抗體對于探索PCV2的快速診斷及治療具有重要意義。

1993年，比利時學者Hamers-Casterman等報道駱駝中存在天然缺失輕鏈的重鏈抗體[6]，隨后發(fā)現(xiàn)在羊駝和一些軟骨魚等動物體內(nèi)也存在類似的抗體[7-8]。克隆重鏈抗體的可變區(qū)可得到只由一個重鏈可變區(qū)構成的單域抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)[9]，由于VHH相對分子質量約為15 kD，僅為常規(guī)抗體的1/10，因此也被稱為納米抗體，它是目前天然來源的相對分子質量最小的抗體[10]。納米抗體由于其理化性質穩(wěn)定[11]、易于基因操作和克隆[12]等優(yōu)勢，在疾病診斷、分子檢測和治療等方面受到廣泛關注。目前納米抗體主要通過噬菌體展示技術獲得[13]，該技術通過PCR擴增出抗體的全套可變區(qū)基因，并將其克隆到噬菌粒載體上，利用E.coli構建包含納米抗體全部基因序列的抗體文庫；輔助噬菌體感染納米抗體文庫后釋放包含有重組噬菌粒的噬菌體，形成噬菌體抗體文庫，VHH表達在重組噬菌體表面，該技術將表型與基因型直接聯(lián)系在一起，將抗體識別抗原的能力與噬菌體擴增的能力結合在一起[14]，對特異性抗體的篩選更為高效；噬菌體抗體庫技術與雜交瘤單克隆抗體技術相比操作更為簡便，因此在生物技術領域極具應用前景[15]。本研究利用分子生物學技術構建了PCV2特異性納米抗體文庫，并對文庫相關指標進行了鑒定分析，為進一步研究篩選抗PCV2特異性納米抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年羊駝1只，此前未經(jīng)過任何主動免疫(山東綠都生物科技有限公司飼養(yǎng))。

1.2 主要試劑E.coliTG1菌株、pCANTAB 5E載體由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院購買保存；PCV2全病毒滅活疫苗由山東綠都生物科技有限公司提供；Ficoll-paque plus 購自GE公司；總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)和DNA純化回收試劑盒購自QIAGEN公司；反轉錄試劑盒為賽默飛公司產(chǎn)品；2×Taq PCR MasterMix 為天根公司產(chǎn)品；SfiI、NotI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自NEB；瓊脂糖為Biowest產(chǎn)品；核酸提取試劑、甘油購自索萊寶生物科技有限公司；氨芐西林鈉、硫酸卡那霉素均購自Sigma公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均為OMEGA公司產(chǎn)品；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設計 根據(jù)Maass和Harmsen等[9-10,16]文獻報道使用的引物并做適當修改，設計兩對特異性的引物擴增羊駝重鏈抗體基因片段。文庫構建及鑒定所用引物如表1所示。其中VHH1-F位于抗體編碼區(qū)的前導序列保守區(qū)，VHH1-R位于抗體CH2結構域高度保守區(qū)，該對引物用于擴增大小分別為900 bp的vh-CH1-CH2片段和約700 bp的vhh-CH2片段；VHH2-F和VHH2-R用于從700 bp的vhh-CH2片段中擴增得到約400 bp的羊駝重鏈抗體重鏈可變區(qū)vhh片段，兩對引物分別在抗體結構中的位置如圖1所示。VHH-Detc-F、VHH-Detc-R為pCANTAB 5E載體上的通用引物，用于文庫質量的PCR鑒定。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 文庫構建及鑒定引物Tab 1 Primers used for library construction and characterization

圖1 vhh擴增引物在IgG抗體結構所在位置示意圖[17]Fig 1 Diagram of the location of vhh amplification primers in IgG antibody structure[17]

1.4 方法

1.4.1 羊駝免疫及外周血淋巴細胞分離 將PCV2全病毒滅活疫苗通過背部皮下多點注射的方式對羊駝進行免疫，共免疫4次，免疫間隔為14 d；每次免疫結束后跟蹤觀察注射包塊吸收情況以及羊駝健康狀態(tài)。第4次免疫結束后1周采血，采用ELISA方法檢測免疫抗體效價。通過頸部靜脈采集羊駝外周血20 mL，通過密度梯度離心方法分離外周血淋巴細胞，計數(shù)后直接用于提取總RNA，剩余細胞沉淀于-80 ℃凍存。

1.4.2 淋巴細胞總RNA提取及cDNA合成 使用QIAGEN總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)提取淋巴細胞總RNA，具體操作參照試劑盒說明書進行?？俁NA使用NanoDrop 2000測定濃度后，直接用于反轉錄合成第一鏈。

使用Thermo反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成，反應體系為：總RNA 2 μL、Oligo(dT)181 μL、nuclease-free water 9 μL；65 ℃ 5 min，然后立即在冰上冷卻；再向以上反應體系中加入5×Raction Buffer 4 μL、Ribolock RNase Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLV RT 1 μL；42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，10 ℃保存；反應結束后cDNA于-80 ℃保存或立即用于第一輪PCR反應。

1.4.3vhh基因擴增 利用巢式PCR通過兩輪PCR反應擴增羊駝重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因，第一輪PCR反應以cDNA作為模板，使用VHH1-F和VHH1-R引物進行擴增反應，反應程序為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切取約700 bp片段，使用OMEGA膠回收試劑盒回收純化目的片段。

第一輪PCR產(chǎn)物適當稀釋后作為第二輪PCR反應的模板，使用引物VHH2-F和VHH2-R進行擴增反應，反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，預期條帶大小約400 bp。使用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 噬菌粒重組載體構建 將vhh目的基因片段與pCANTAB 5E噬菌粒載體分別使用SfiI和NotI限制性內(nèi)切酶雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收；使用T4DNA連接酶將純化的vhh目的基因片段與雙酶切處理后的噬菌粒載體pCANTAB 5E連接。將連接產(chǎn)物經(jīng)電穿孔法轉入新制備的E.coliTG1感受態(tài)細胞中，電穿孔儀設置電壓為1.8 kV，電轉化完成后37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取100 μL進行梯度稀釋計算電轉化效率；剩余菌液涂布氨芐抗性固體平板，30 ℃過夜培養(yǎng)。

1.4.5 納米抗體文庫的庫容及多樣性鑒定 使用LB培養(yǎng)基沖洗平板上固化的菌落并收集到250 mL滅菌錐形瓶中，取100 μL菌液進行梯度稀釋后涂布氨芐抗性平板，過夜培養(yǎng)后計數(shù)各稀釋度平板上的菌落數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)及稀釋倍數(shù)計算抗體文庫的庫容；隨機挑取50個單菌落分別于5 mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以過夜培養(yǎng)的菌液作為模板，使用VHH-Detc-F和VHH-Detc-R引物進行PCR反應，鑒定陽性克隆比例。將陽性克隆菌提取質粒后送上海生工生物工程有限公司測序，鑒定抗體文庫基因序列多樣性。剩余菌液加入終濃度為20%的甘油，混勻后分裝，于-80 ℃凍存。

2 結果與分析

2.1 PCV2滅活全病毒免疫羊駝后血清抗體效價

第4次免疫結束1周后采血分離抗血清，進行倍比稀釋，以PCV2 Cap蛋白包被ELISA 96孔板，以免疫PCV2全病毒滅活疫苗前分離的羊駝血清500倍稀釋后作為陰性對照，通過間接ELISA方法檢測免疫后羊駝血清IgG抗體水平。結果顯示，第4次免疫后，羊駝血清PCV2 IgG抗體效價可達1∶50000以上(圖2)，血清抗體水平符合構建納米抗體文庫標準。

圖2 PCV2滅活全病毒免疫羊駝后血清抗體效價Fig 2 Serum antibody level of alpaca after immunized with PCV2 inactivated virus

2.2 外周血淋巴細胞分離及總RNA提取 使用淋巴細胞分離液從20 mL羊駝抗凝外周血中分離到約7.5×107單個核細胞。使用QIAGEN總RNA提取試劑盒提取的RNA總量為25.9 μg，A260 nm/A280 nm值為1.99，滿足建庫要求。剩余淋巴細胞于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3vhh目的基因擴增 以制備的cDNA為模板，使用VHH1-F和VHH1-R引物進行第一輪PCR擴增反應，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖3。第一輪PCR產(chǎn)物包括大小分別為900 bp和700 bp的兩種特異性片段。

M: DL2000 Marker；ctrl: PCR陰性對照；1-2: 第一輪PCR產(chǎn)物 M: DL2000 Marker; ctrl: PCR negative control; 1-2: the first round PCR products圖3 第一輪PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the first round PCR products

割膠回收第一輪PCR產(chǎn)物中的700 bp片段，純化后以此為模板，使用VHH2-F和VHH2-R引物進行第二輪PCR擴增反應。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，第二輪PCR產(chǎn)物大小約為400 bp(圖4)，與預期片段大小一致。

M: DL2000 Marker；N1～N2: PCR陰性對照； 1-2: 第二輪PCR產(chǎn)物 M: DL2000 Marker; N1～N2: PCR negative control; 1-2: the second round PCR products圖4 第二輪PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 4 Agarose gel electrophoresis of the second round PCR products

2.4 pCANTAB-vhh重組質粒構建 第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與噬菌粒載體pCANTAB 5E分別經(jīng)SfiI和NotI限制性內(nèi)切酶雙酶切，使用DNA純化回收試劑盒回收雙酶切后的vhh目的片段和pCANTAB 5E載體，定量后使用T4 DNA連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示連接產(chǎn)物包含大小分別為約7000 bp和5000 bp的兩條帶(圖5)。其中5000 bp條帶與重組質粒預期大小一致，可判斷vhh目的基因與pCANTAB 5E載體連接成功。

M: 1 kb ladder；1: 雙酶切后的pCANTAB 5E載體； 2: vhh與pCANTAB 5E連接產(chǎn)物 M: 1 kb ladder; 1: double-digested pCANTAB 5E vector; 2: ligation product圖5 連接產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 5 Agarose gel electrophoresis of ligation product

2.5 納米抗體文庫陽性率、庫容鑒定 將連接產(chǎn)物通過電穿孔轉入新鮮制備的E.coliTG1感受態(tài)細胞中，電轉化后獲得轉化子數(shù)為1.34×108CFU/mL，轉化效率約1.5×108CFU/μg DNA。轉化子涂布氨芐抗性平板，30 ℃過夜培養(yǎng)后收獲平板上的菌落，最終收獲轉化重組子數(shù)為3.01×1010CFU/mL。從稀釋后菌液涂布的抗性平板上隨機挑取50個單菌落進行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示其中有4個為陰性(圖6，26號、29號、32號和43號)，其余均擴增出約700 bp的預期大小條帶(圖6)，陽性率為92.0%，計算最終庫容大小為2.77×1010CFU/mL。

M: DL2000 Marker；ctrl: PCR陰性對照；1-50: 菌液PCR結果 M: DL2000 Marker; ctrl: negative control; 1-50: PCR products of randomly picked colonies圖6 納米抗體文庫菌液PCR鑒定結果Fig 6 PCR identification results of nanobody library

2.6 納米抗體文庫多樣性鑒定 對鑒定為陽性的菌液提取質粒后測序，并將測序結果分別與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，結果顯示所有匹配序列均為羊駝或駱駝重鏈抗體可變區(qū)序列，序列一致性比率在79%～97%之間，表明該抗體文庫為重鏈抗體基因文庫。測序序列之間比對結果如圖7所示，16個測序序列均為獨立克隆，其CDR3區(qū)的氨基酸種類和包含的氨基酸殘基數(shù)均有較大差異，表明該納米抗體文庫基因序列中CDR3區(qū)氨基酸序列種類豐富，所構建的PCV2納米抗體文庫具有很好的多樣性。其中編號為01、02、03和10的測序序列，CDR3區(qū)包含20個以上的氨基酸殘基，符合納米抗體具有較長CDR3區(qū)的典型特征；另外，所有測序序列的第39位、第46位、第47位和第49位氨基酸殘基種類符合納米抗體的氨基酸結構特征[18]，進一步證明了所構建的抗體文庫確為納米抗體文庫。

“.”表示該序列氨基酸與首行序列完全相同；“-”表示該位置氨基酸缺失；英文字母表示測序序列在該位置氨基酸殘基具有差異 “.” represents that the amino acids of all sequences in this site are the same; “-” represents that there are amino acids deletion in this site; Letters represent that the amino acids in this site are different圖7 納米抗體文庫序列多樣性分析Fig 7 Sequence diversity analysis of PCV2 nanobody library

3 討論與結論

PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等相關疾病的主要病原[19]，PCV2及其導致的多種病原體的共同感染每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前雖已有各種類型的疫苗用于PCV2的防控，但是建立高效的PCV2感染的檢測方法對PCV2的綜合防控同樣具有重要意義。近年來已有許多國內(nèi)外學者開展了PCV2單克隆抗體的研制工作[20-22]，與傳統(tǒng)多克隆抗體和單克隆抗體相比，納米抗體相對分子質量更小、特異性和穩(wěn)定性好、制備周期相對較短、在識別傳統(tǒng)抗體無法識別的隱蔽表位或小表位等方面更具優(yōu)勢。本研究構建了高質量納米抗體文庫，為篩選抗PCV2特異性納米抗體提供原始材料。

根據(jù)抗體基因來源動物是否經(jīng)過免疫，納米抗體文庫可分為免疫抗體文庫和非免疫抗體文庫[23]，本研究構建的特異性納米抗體文庫來源于經(jīng)PCV2免疫的羊駝，屬于免疫抗體文庫。動物免疫后血清抗體水平反映了特異性抗原激發(fā)免疫反應的程度，同時也能間接反映經(jīng)特異性抗原介導活化、增殖的淋巴細胞的數(shù)目。本研究分離免疫羊駝外周血淋巴細胞后，通過巢式PCR擴增出vhh目的基因片段，并將其克隆到pCANTAB 5E載體上，連接產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果出現(xiàn)兩條帶，推測是由于重組質粒的構象差異導致在凝膠中的遷移速率不同所致。

本研究所構建的納米抗體文庫，文庫菌陽性重組率為92.0%，符合納米抗體文庫質量要求；16個隨機測序序列均為獨立克隆，與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，結果顯示目的基因均與羊駝或駱駝重鏈抗體重鏈可變區(qū)序列特征匹配，表明本研究所構建的抗體文庫為重鏈抗體基因文庫；在結構方面，納米抗體的典型特征之一是具有較長的CDR1和CDR3，CDR3平均長度為16～18個氨基酸[24-25]，較長的CDR3有助于維持納米抗體結構的穩(wěn)定性、增加其特異性和親和力。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體在FR2區(qū)存在4個特征性氨基酸，Phe/Tyr39、Glu/Gln46、Arg47和Gly/Phe/Leu49，這四個特征性氨基酸殘基能夠阻止VH與VL結合，增加納米抗體的可溶性、降低其聚合性[6, 25]。本研究中隨機挑取的16個單克隆的氨基酸序列符合納米抗體的氨基酸序列結構特征，納米抗體文庫包含序列多樣性良好。

納米抗體文庫的庫容大小、抗體基因多樣性是衡量抗體文庫質量的重要指標[26]，對后續(xù)淘洗出的特異性納米抗體的親和力具有決定作用[27]。對于天然抗體庫而言，淘洗到高親和力抗體(Kd10-8～10-10M)要求庫容達到109以上[28]；而免疫庫中包含的可變區(qū)基因是經(jīng)過重排及親和力成熟后的序列，與非免疫抗體文庫相比，淘洗到高親和力納米抗體對庫容要求相對較低。本研究構建的納米抗體文庫庫容達到2.77×1010CFU/mL，文庫包含大量已經(jīng)被誘導的PCV2特異性抗體基因，抗原針對性強，有助于淘洗到高親和力PCV2特異性納米抗體。

綜上所述，本研究成功構建了羊駝來源的PCV2特異性納米抗體文庫，并對文庫庫容和序列多樣性進行了鑒定，為進一步篩選抗PCV2相關抗原的高親和力納米抗體奠定了基礎。