致病菌檢驗和鑒定技術在食品安全保障中的應用

□ 趙德錕 張帆 杭州大微生物技術有限公司

□李杜娟 鄭州市食品藥品檢驗所

食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，隨著人們生活水平的提升，以及對檢驗能力要求的提高，致病菌檢驗與鑒定已成為食品安全檢測實驗室中最基本且重要的工作之一。采用恰當?shù)蔫b定手段，及時、準確地鑒定出食品樣品中的疑似致病菌是保證食品安全的關鍵，也是國家監(jiān)管部門和企業(yè)實驗室中檢驗工作者共同努力的方向。本文分析了食源性致病微生物鑒定的兩類主流技術，提出生化鑒定方法和經法規(guī)標準確認的微生物鑒定金標準。最終顯示，食品安全檢測實驗室采用自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，有助于降低致病菌污染風險，促進食品安全保障體系的健全。

1 致病菌檢驗和鑒定技術在食品安全保障中的重要性

食品安全一直是我國重大的公共衛(wèi)生問題，隨著人們生活水平的不斷提高，微生物對食品的污染問題也愈發(fā)受到關注。其中，食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，其在食品生產、加工、儲存和運輸?shù)拳h(huán)節(jié)中均有存在的可能。消費者一旦誤食被食源性致病菌污染的食品，極易引起食物中毒，還易導致各類食源性疾病的發(fā)生，嚴重時甚至危及生命。同樣，食品生產企業(yè)一旦發(fā)現(xiàn)其產品被食源性致病菌污染，將會受到產品召回、停產、整頓及罰款等處罰而承擔重大的經濟損失。2019年，國家市場監(jiān)督管理總局頒布新規(guī)—《食品安全抽樣檢驗管理辦法》，要求食品生產經營者收到市場監(jiān)管部門的致病菌檢驗項目不合格的通報后，應當立即封存不合格食品，暫停生產、經營，并召回已銷售的不合格食品；涉嫌犯罪的，依法及時移送公安機關。因此，及時、準確地檢測和鑒定出食品樣品中的疑似致病菌，是將風險降至最低以保證食品安全的關鍵，也是國家監(jiān)管部門和食品企業(yè)實驗室中微生物檢驗工作者努力的方向。

目前，我國GB 4789食品安全系列標準和國家食源性致病菌監(jiān)測目錄中，大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌、霍亂弧菌、副溶血性菌及空腸彎曲菌等均屬于被要求檢驗的致病菌。除此之外，還有其他相關法律法規(guī)也對食品中食源性致病菌的定性檢查提出了明確要求，如表1、表2所示。根據(jù)食品安全國家標準的規(guī)定，在食源性病原菌檢測過程中，若檢測結果呈陽性，則需采用生化試驗或微生物生化鑒定系統(tǒng)進行相關的鑒定以確定其屬、種。因此，近年來微生物鑒定技術也逐漸成為食品安全檢測實驗室亟需加強的重要技術能力之一。

表1 國家法規(guī)對食源性致病菌檢驗和鑒定的要求

2 食源性致病微生物鑒定的主流技術及應用特點

關于食源性致病微生物鑒定的主流技術主要分為兩類，即常規(guī)鑒定技術和分子水平鑒定技術。

微生物常規(guī)鑒定技術是根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對微生物進行形態(tài)學和生理生化水平的分類及鑒定。由于部分微生物形態(tài)比較單一而容易分辨，可根據(jù)其形態(tài)直接判斷。雖然大部分微生物形態(tài)較為相近，但由于其具有不同的酶系統(tǒng)，且對營養(yǎng)基質的分解能力也有所不同，因此可在形態(tài)學觀察的基礎上，通過微生物細胞壁組成、發(fā)酵產物、代謝情況、對碳源或氮源等營養(yǎng)成分利用的生化反應進行綜合判斷，進而實現(xiàn)分類和鑒定。

分子水平鑒定技術主要包括蛋白質檢測和DNA檢測。當前，蛋白質的鑒定技術主要利用飛行時間質譜獲得微生物特征蛋白質分子的“指紋圖譜”，之后通過數(shù)據(jù)庫比對來實現(xiàn)；DNA檢測的鑒定技術則是利用細菌核糖體上的16SrDNA基因進化速度緩慢的特點，通過檢測同源基因來實現(xiàn)，現(xiàn)常用的手段包括16SrDNA測序、PFGE（脈沖場凝膠電泳）和全基因組測序等技術。

從當前的應用情況來看，兩類微生物鑒定技術各有優(yōu)劣。分子鑒定技術雖然快速、通量高、鑒定結果準確，但樣品前處理過程和結果分析過程對操作人員的要求較高，且儀器價格昂貴、一次性投入較大，因此暫未被納入食品安全檢測標準中。生化鑒定方法雖然鑒定時間較長，但因操作流程標準化、結果分析難度低、鑒定準確性較高，且能直接反應出微生物的生化特性，因此該方法一直被全球許多國家確認為是法規(guī)標準中的微生物鑒定金標準，是不可替代的實驗室主流鑒定技術之一。

3 DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)

為實現(xiàn)對食品終產品檢測和加工過程監(jiān)控中采樣的細菌、酵母菌等微生物進行便捷、可靠的菌種鑒定，杭州大微生物技術有限公司結合多年工業(yè)微生物檢測方面的經驗和技術積累，推出了DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，如圖1所示。通過一系列突破性創(chuàng)新，該系統(tǒng)除操作更加方便且人性化外，還優(yōu)化和擴大了微生物數(shù)據(jù)庫，具有簡便的操作流程和高效準確的鑒定能力，不僅適用于各種類型樣品（食品、農產品、藥品、化妝品、質控樣、模擬樣品及環(huán)境監(jiān)測樣品等）的微生物鑒定，還適用于市場監(jiān)督管理部門、海關出入境檢驗檢疫、疾病預防控制、食品安全、制藥、企業(yè)、獸醫(yī)、漁業(yè)水產養(yǎng)殖等微生物檢測實驗室。

3.1 工作原理

DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)利用不同細菌具有不同酶系統(tǒng)的特點和對底物的不同分解能力，以生化反應原理（底物反應、糖利用反應、同化反應、氨基酸實驗等）為基礎，通過微生物激光透射比色法捕獲細菌的生化表型特征，并采用數(shù)值分類原理，自動比對專用微生物數(shù)據(jù)庫，對各種類型樣品的微生物單分離株進行自動分類和鑒定。

3.2 系統(tǒng)特點

3.2.1 操作方便簡單，結果準確可靠

工作流程可實現(xiàn)標準化，僅需4步（革蘭氏染色與鏡檢→試劑板選擇→加樣及培養(yǎng)→上機自動鑒定）即可完成鑒定全流程；實驗結果無需人工干預，可全部由計算機自動完成判讀，并調取數(shù)據(jù)庫信息，得出鑒定結果。同時，由于DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)將多個生化反應有效整合并濃縮于96孔板卡上，不僅增加了生化反應數(shù)量，還實現(xiàn)了微量培養(yǎng)與檢測，在檢測準確性和速度上都得到大幅提高，最快可當天獲得結果。

3.2.2 擁有廣泛的鑒定范圍

微生物鑒定試劑板是根據(jù)不同種類微生物專門設計而成，為更大程度地擴大鑒定范圍，DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)配套16種鑒定板條，鑒定范圍覆蓋絕大多數(shù)微生物，適用于腸桿菌、非發(fā)酵菌、葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、陽性桿菌、弧菌、陰性球菌、酵母菌、嗜血桿菌、厭氧菌、彎曲桿菌、支原體、分枝桿菌等微生物的檢測。

3.2.3 提供龐大的專業(yè)數(shù)據(jù)庫支撐

數(shù)據(jù)庫是鑒定系統(tǒng)能否準確鑒定細菌的關鍵因素，DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)的菌種信息數(shù)據(jù)庫在2000種以上，可定性鑒定微生物數(shù)量為550種以上；當發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫以外的未知少見菌種時，還可結合實驗室需求進行菌種信息和生化反應表型的人工擴充，進而使數(shù)據(jù)庫不斷豐富和完善。

圖1 DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)

基于以上特點，DW-M80自動微生物生化鑒定系統(tǒng)已經成為食品檢測實驗室中微生物檢測的日常鑒定手段。除微生物生化鑒定功能外，該系統(tǒng)還可實現(xiàn)微生物對抗生素耐藥性的檢測及MIC值測定，滿足抑菌實驗的需求。

4 結語與展望

近年來，隨著儀器分析技術的不斷進步，自動化微生物鑒定技術逐步發(fā)展起來，大大促進了食品檢測技術的發(fā)展進程，并正被廣泛應用于致病菌的檢測和鑒別中。由于自動微生物生化鑒定系統(tǒng)采用經典的微生物生理生化反應原理，具有操作簡單、標準化、準確率高等特點，現(xiàn)階段仍是食物樣品中微生物鑒定的基本方法，也是分子鑒定結果的根本驗證手段。

此外，若食品生產單位能有效使用微生物生化鑒定系統(tǒng)，對生產環(huán)境、生產過程，以及出廠最終產品進行有效監(jiān)控，了解微生物分布情況，及時分析微生物污染來源等，有助于降低微生物污染風險，促進產品質量安全保障體系的健全。

表2 食品安全檢測實驗室的致病菌鑒定項目需求與標準依據(jù)