糖尿病患者紅細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究進(jìn)展*

李旭妍，孫明玥，楊麗麗，王亞奇，蘇 燕

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，主要由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。生物體內(nèi)超過(guò)一半的蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生糖基化修飾。長(zhǎng)期存在的高血糖會(huì)導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害和功能障礙，其機(jī)制可能與高血糖導(dǎo)致的蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物增多有關(guān)。紅細(xì)胞存在于循環(huán)血液中，增高的血糖可以使紅細(xì)胞表面及紅細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾，從而影響紅細(xì)胞功能，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，可能成為引起糖尿病微血管并發(fā)癥的重要機(jī)制之一。因此，進(jìn)一步明確紅細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化與糖尿病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性對(duì)于糖尿病的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。

1 高血糖與蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)及其位點(diǎn)的關(guān)系

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)的氨基酸殘基與糖鏈形成糖苷鍵的過(guò)程。該反應(yīng)又稱為美拉德反應(yīng)，最早是法國(guó)食品化學(xué)家Maillard在一次不成功的合成多肽的實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)的，直到1980年才發(fā)現(xiàn)它參與多種疾病的病理變化，因此成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。人體內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)主要有兩類：一類是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，經(jīng)酶催化生成糖蛋白的反應(yīng)；另一類是沒(méi)有酶參與的非酶糖基化反應(yīng)，主要發(fā)生在細(xì)胞外環(huán)境，包括膜蛋白、分泌蛋白及體液中的蛋白等。在高糖條件下，體內(nèi)的酶促和非酶促反應(yīng)均可以發(fā)生，高濃度葡萄糖能充分與蛋白質(zhì)的N-末端和賴氨酸側(cè)鏈氨基接觸生成Schiff堿(醛亞胺)，再經(jīng)過(guò)催化重排形成更穩(wěn)定的早期糖基化產(chǎn)物，即Amadori產(chǎn)物(酮胺或果糖胺)[1]。Amadori產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)生成晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，糖基化終產(chǎn)物的形成和堆積將加速機(jī)體糖尿病的病變程度和進(jìn)展速度，是腎病、視網(wǎng)膜病變和動(dòng)脈粥樣硬化等并發(fā)癥的主要致病因素。與非酶糖基化不同，在高糖條件下，酶促糖基化反應(yīng)則是由于催化糖基化反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)發(fā)生了改變，因此影響蛋白質(zhì)糖基化的進(jìn)程。而蛋白質(zhì)糖基化時(shí)，糖鏈會(huì)與蛋白質(zhì)的不同氨基酸殘基連接產(chǎn)生不同的糖基化產(chǎn)物，與糖鏈連接的位點(diǎn)就是糖基化位點(diǎn)。Martyna[2]等人在探索鑒別賴氨酸衍生物糖基化的方法時(shí)，通過(guò)檢測(cè)體內(nèi)外α-晶狀體蛋白賴氨酸分布來(lái)鑒別糖基化的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)體外不同濃度高糖(蛋白質(zhì)與糖的摩爾比分別為1∶1 000,1∶500,1∶370)處理后的α-晶狀體蛋白有許多反應(yīng)位點(diǎn)，但賴氨酸是最易發(fā)生糖基化的。同樣Barnaby[3]等人和Silva[4]等人的實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。蛋白糖基化修飾位點(diǎn)的檢測(cè)方法包括：基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、液相色譜-質(zhì)譜( Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS)、同位素標(biāo)記法、核磁共振譜( Nuclear Magnetic Resonance Imaging，NMR)。這些方法各有優(yōu)劣，必要時(shí)可以聯(lián)合使用。

2 糖尿病患者紅細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化的研究

糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象、運(yùn)輸、定位有著重要的作用，并參與分子識(shí)別、信號(hào)通路傳遞等重要過(guò)程。N-端糖基化是較為普遍的糖基化，主要發(fā)生在細(xì)胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，包括膜蛋白、分泌蛋白、體液中蛋白，而這些蛋白一般是疾病診斷和治療的對(duì)象，因此人們對(duì)這些蛋白質(zhì)研究的頻率較高。紅細(xì)胞隨血液不斷循環(huán)于全身，是最早感知血糖濃度變化的細(xì)胞之一。因此，研究高血糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)蛋白的糖基化修飾及其功能的改變對(duì)糖尿病的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。

2.1血紅蛋白 血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)是紅細(xì)胞內(nèi)的攜氧蛋白，也是含量最多的蛋白。體內(nèi)發(fā)生非酶糖基化的各種蛋白質(zhì)中，血紅蛋白的研究最徹底、最透徹。高糖環(huán)境下，紅細(xì)胞血紅蛋白糖基化程度增加明顯。Vevin[5]等將紅細(xì)胞置于37 ℃的葡萄糖溶液(終濃度分別為10 mM、15 mM、20 mM)中孵育30 min后，濃度為20 mM葡萄糖孵育的紅細(xì)胞發(fā)生血紅蛋白糖基化量增加。又有研究表明[6]，果糖比葡萄糖更易與血紅蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)。血紅蛋白與果糖的氨基形成Schiff堿的速率比與葡萄糖高7.5倍，進(jìn)一步印證了果糖能加速血紅蛋白糖基化。血紅蛋白糖基化是通過(guò)兩步連續(xù)的非酶促反應(yīng)完成的。首先，Hb N末端殘基或Lys殘基側(cè)鏈的中性氨基與糖分子中的醛或酮基相互作用，形成可逆的Schiff堿中間體。該中間體經(jīng)歷不可逆的分子間Amadori重排以產(chǎn)生更穩(wěn)定的酮胺結(jié)構(gòu)[7]。糖尿病患者血糖濃度增高引起的血紅蛋白糖基化最豐富的產(chǎn)物是HbA1c，它在紅細(xì)胞里120 d的生命周期中不斷地累積，能夠較好反映患者檢測(cè)前2～3個(gè)月的血糖水平，因此成為糖尿病和糖尿病篩查的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2酶蛋白 成熟紅細(xì)胞除細(xì)胞膜和胞質(zhì)外，不具備其他細(xì)胞器(如線粒體)。因此成熟紅細(xì)胞利用葡萄糖供能、輸送O2、維持細(xì)胞形態(tài)的代謝途徑主要有3條：糖酵解途徑、2、3-二磷酸甘油酸旁路、磷酸戊糖途徑。己糖激酶、丙酮酸激酶、6-磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等是這三條途徑的關(guān)鍵酶。有研究顯示[8]，長(zhǎng)期的高血糖環(huán)境可能引起紅細(xì)胞內(nèi)代謝酶的活性發(fā)生改變，引起紅細(xì)胞形態(tài)功能的改變進(jìn)而成為糖尿病微血管病變的發(fā)病基礎(chǔ)。

2.2.1葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)是一種普遍存在的酶，在所有細(xì)胞中都具有管家作用，對(duì)紅細(xì)胞的完整性和功能影響尤為關(guān)鍵。作為磷酸戊糖途徑的限速酶，G6PD可以催化葡萄糖分解產(chǎn)生NADPH和核糖-5-磷酸，NADPH為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原當(dāng)量。目前發(fā)現(xiàn)，G6PD在癌細(xì)胞中發(fā)生O-端糖基化，從而使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的功能改變。Abraham[9]等研究結(jié)果表明，未使用C. planchonii水提物治療的糖尿病大鼠紅細(xì)胞中，G6PD的活性顯著低于治療組和正常對(duì)照。Elena Ganea[10]等的研究卻發(fā)現(xiàn)G6PD在與20 mM果糖溫育8 h后80 %的G6PD失活。因此，推測(cè)高糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)G6PD活性可能具有抑制作用，甚至還會(huì)使其失活，但是否通過(guò)G6PD糖基化及其糖基化機(jī)制尚不明確。

2.2.2己糖激酶 己糖激酶(hexokinase, HK)是糖酵解途徑中催化葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖-6-磷酸的酶，是糖酵解途徑的限速酶。HK在哺乳動(dòng)物體內(nèi)中分為五種亞型：HK1、HK2、HK3、HK4、HK5，屬于同工酶，它們分布于不同的組織中，但有著類似的結(jié)構(gòu)和功能[11]。Mali[12]等通過(guò)研究糖尿病患者體內(nèi)紅細(xì)胞糖酵解酶活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)糖尿病組紅細(xì)胞己糖激酶活性高于正常人，但糖尿病組本身紅細(xì)胞己糖激酶活性隨血糖濃度升高活性反而降低。Brito[13]等同樣發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠紅細(xì)胞中HK活性較對(duì)照組是增加的，而糖尿病大鼠肝臟和腎臟中HK活性較對(duì)照組低。這說(shuō)明高血糖可以增加紅細(xì)胞中HK活性，但對(duì)高血糖環(huán)境下的紅細(xì)胞，不斷升高血糖反而起到反作用，其是否與己糖激酶發(fā)生糖基化修飾有關(guān)，尚有待繼續(xù)研究。

2.2.3乳酸脫氫酶 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH或LD)是糖酵解過(guò)程中催化乳酸和丙酮酸之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)的酶，它存在于機(jī)體的所有組織細(xì)胞中，以心和腎臟最為豐富。因?yàn)樗Ｔ诮M織損傷期間釋放，所以它成為機(jī)體損傷或疾病(例如心力衰竭)的標(biāo)志物。Mali[14]等在研究2型糖尿病患者紅細(xì)胞乳酸脫氫酶動(dòng)力學(xué)特性的改變時(shí)，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者紅細(xì)胞中乳酸脫氫酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有顯著改變，這有利于丙酮酸有效轉(zhuǎn)化為乳酸。說(shuō)明糖尿病患者紅細(xì)胞中乳酸脫氫酶活性升高，促進(jìn)乳酸生成。非酶促糖基化是糖尿病的顯著特征，但不清楚這種結(jié)構(gòu)變化是否會(huì)影響LDH的催化活性，或影響糖尿病RBC中LDH同工酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，需要直接的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定這些可能性。

2.3膜蛋白 紅細(xì)胞膜是主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類組成。膜蛋白主要有血影蛋白、肌動(dòng)蛋白、錨蛋白和帶4.1蛋白等，它們相互結(jié)合、纏繞，構(gòu)成蛋白骨架，以維持細(xì)胞形態(tài)和變形性。還有一部分蛋白鑲嵌在細(xì)胞膜上充當(dāng)載體或離子交換器，如ATP酶、纈氨酶素。

2.3.1ATP酶 ATP酶又稱為三磷酸腺苷酶，普遍存在于各種活細(xì)胞細(xì)胞膜上，通過(guò)水解ATP為跨細(xì)胞膜物質(zhì)運(yùn)輸提供能量。紅細(xì)胞膜表面的ATP酶有Na+-K+ATP酶、Mg2+ATP酶、Ca2+ATP酶等。Na+-K+ATP酶在紅細(xì)胞膜上維持鈉和鉀梯度，Ca2+ATP酶則是維持紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定。有證據(jù)表明非酶促糖化導(dǎo)致ATP酶功能受損，如Na+-K+ATP酶和Ca2+ATP酶[15]。據(jù)報(bào)道[16]，高濃度葡萄糖孵育對(duì)紅細(xì)胞膜上的Na+-K+ATP酶有抑制作用。同樣，Menon[17]等也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠模型的紅細(xì)胞膜上的Na+-K+泵、Mg2+泵活性低于正常組，而Ca2+泵活性與正常組持平，說(shuō)明高血糖環(huán)境會(huì)抑制細(xì)胞膜上的部分質(zhì)子泵的活性，影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，造成疾病的發(fā)生，但具體是否是糖基化修飾影響質(zhì)子泵活性還需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3.2肌動(dòng)蛋白 肌動(dòng)蛋白(actin)是一種高度保守的球狀多功能蛋白質(zhì)，可在細(xì)胞質(zhì)中形成微絲。它是所有真核細(xì)胞中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，有α、β和γ三種。α肌動(dòng)蛋白是肌肉組織中的收縮裝置的主要成分；β和γ肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成成分，參與細(xì)胞收縮機(jī)制，并充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)的作用[18]。肌動(dòng)蛋白對(duì)糖基化特別敏感，因?yàn)樗哂芯徛M(jìn)化的特性，并且含有幾種易于被體外糖化劑修飾的賴氨酸和精氨酸殘基。糖基化后的肌動(dòng)蛋白的功能可能會(huì)發(fā)生較大改變，如細(xì)胞遷移、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[19]。但紅細(xì)胞膜上的肌動(dòng)蛋白糖基化修飾后是否會(huì)改變紅細(xì)胞形態(tài)和功能的研究很少，還需繼續(xù)關(guān)注。

2.3.3血影蛋白 血影蛋白(spectrin)是由α-β二聚體組成的大而靈活的蛋白質(zhì)，它們頭對(duì)頭連接以形成規(guī)范的異四聚體血影蛋白結(jié)構(gòu)。大多數(shù)僅存在于人紅細(xì)胞膜上，與錨蛋白和肌動(dòng)蛋白一樣是細(xì)胞膜骨架重要組分。Resmi[20]的研究表明，紅細(xì)胞膜上的血影蛋白可以發(fā)生非酶糖基化。血影蛋白既發(fā)生O-端糖基化，又發(fā)生N-端糖基化。Samanta[21]等在內(nèi)臟利什曼病中發(fā)現(xiàn)在α-血影蛋白上有四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，所有這些位點(diǎn)都含有共有序列Asn-Xaa-Ser / Thr。在Thr-817位置僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)。然而，在β-血影蛋白中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，沒(méi)有潛在的O-糖基化位點(diǎn)。Mahindrakar[22]等的研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血漿中，血影蛋白糖基化增加，幾乎是血紅蛋白糖基化的3倍。紅細(xì)胞膜血影蛋白糖基化狀態(tài)的改變可能影響2型糖尿病紅細(xì)胞的完整性、壽命、變形性和粘彈性。然而，需要進(jìn)一步闡明其潛在的生化機(jī)制。

2.3.4帶3蛋白 帶3蛋白又被稱為人類紅細(xì)胞陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(anion exchanger1, AE1)，它是存在于紅細(xì)胞膜上的一種內(nèi)在蛋白質(zhì)，占紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)總量的25 %。它屬于跨膜蛋白，在質(zhì)膜上介導(dǎo)氯離子(Cl-)與碳酸氫鹽(HCO3-)的交換，在完成組織CO2運(yùn)輸、肺CO2排出過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Reithmeier[23]等在人類紅細(xì)胞膜上的帶3蛋白的陰離子交換作用的研究中發(fā)現(xiàn)帶3蛋白中單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)Asn642，該位點(diǎn)位于長(zhǎng)多肽區(qū)段(Gln625-Pro660)中間的一個(gè)區(qū)域。帶3蛋白雖然可以發(fā)生糖基化，但糖尿病患者紅細(xì)胞膜上的帶3蛋白是否發(fā)生糖基化反應(yīng)還未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有待繼續(xù)探索。

3 展望

紅細(xì)胞內(nèi)充斥著不同的蛋白質(zhì)，它們承擔(dān)著各種各樣的功能，如催化能量代謝反應(yīng)的多種酶、構(gòu)成紅細(xì)胞膜的膜蛋白等。當(dāng)機(jī)體處于高糖狀態(tài)下，紅細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)會(huì)與糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，并進(jìn)一步導(dǎo)致紅細(xì)胞的能量代謝、形態(tài)、功能等發(fā)生改變，加重糖尿病癥狀，引發(fā)一系列并發(fā)癥。因此，從紅細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化角度深入探究高糖對(duì)紅細(xì)胞代謝及能量產(chǎn)生的影響，將為糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防、早期診斷和治療等提供有力的新的思路。