微生物發(fā)酵液對(duì)保護(hù)地番茄灰霉菌的抑制作用效果評(píng)價(jià)

劉曉梅　梁長(zhǎng)東　李景芳　楊和川　任立凱

摘要 [目的] 明確微生物發(fā)酵液對(duì)灰霉病菌的防治作用。[方法]通過室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效試驗(yàn)研究了微生物發(fā)酵液對(duì)灰霉病菌的抑制作用和田間防效。[結(jié)果]毒力測(cè)定結(jié)果表明，微生物發(fā)酵液能明顯抑制灰霉病菌菌絲的生長(zhǎng)，發(fā)酵液原液的抑制率最高為66.18%。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)番茄間隔7 d、連續(xù)施藥3次，第3次施藥7 d后，微生物發(fā)酵液原液對(duì)灰霉病的防效最高達(dá)60.47%，與35%的腐霉利600倍液的防治效果無顯著差異。[結(jié)論]微生物發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病有較好的防治效果，其作為一種生物新型殺菌劑值得進(jìn)一步研究、開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞 微生物發(fā)酵液;灰霉菌;防治效果

中圖分類號(hào) S436.412.1+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）21-0145-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.043

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Control Effects of Microbial Fermentation Liquid on Tomato Gray Mould in Protected Field

LIU Xiaomei，LIANG Changdong，LI Jingfang? et al

（Lianyungang Academy of Agricultural Sciences， Lianyungang，Jiangsu? 222000 ）

Abstract [Objective] To study the effect of microbial fermentation liquid on controlling gray mould. [Method] Toxicity experiments and field trials were conducted. [Result] Toxicity experiments showed that the microbial fermentation liquid could significantly inhibit the growth of Botrytis cinerea， and the inhibition rate of the fermentation liquid was 66.18%. In the field trials， the control effect of microbial fermentation liquid on grey mold was 60.47% 7 days after the third treatment， which was no significant difference from the control effect of 600fold dilution of 35% saprophytic. [Conclusion] The microbial fermentation liquid had control effect on tomato Botrytis cinerea， as a new biological fungicide， it was worthy of further research， development and utilization.

Key words Microbial fermentation liquid;Tomato gray mould;Control effect

基金項(xiàng)目 連云港市財(cái)政專項(xiàng)（QNJJ1719）。

作者簡(jiǎn)介 劉曉梅（1987—），女，河南偃師人，助理研究員，碩士，從事植物保護(hù)研究。 通信作者，副教授，從事作物栽培及資源與壞境研究。

收稿日期 2019-07-17

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性氣傳病害。近年來隨著保護(hù)地番茄種植面積的不斷增加，灰霉病菌在土壤中大量累積，特別是在冬春季節(jié)最容易發(fā)生，且常暴發(fā)式擴(kuò)增，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[2]。目前，保護(hù)地番茄灰霉病防治主要以化學(xué)藥劑[3-4]為主，然而化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期施用往往會(huì)造成灰霉病菌的抗藥性增加，且防治效果逐步降低[5-7]，另外還會(huì)導(dǎo)致病害的流行[8]。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥殘留問題比較嚴(yán)重，且越來越引起人們的關(guān)注，尤其是對(duì)鮮食果蔬，給環(huán)境及人畜健康帶來嚴(yán)重威脅[9]。因此，探索生物新型殺菌劑來替代常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)保護(hù)地蔬菜種植具有積極的影響。

連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究室制備的微生物發(fā)酵液是利用納豆芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，而這3種微生物對(duì)多種病原菌均具有良好的殺菌效果，目前已有大量研究[10-18]，但其混合發(fā)酵液的殺菌作用效果還不明確。筆者通過室內(nèi)毒力測(cè)定及田間藥效試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)該微生物發(fā)酵液對(duì)保護(hù)地番茄灰霉病的殺菌效果，旨在為新型高效生物殺菌劑的開發(fā)和應(yīng)用提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試番茄。番茄品種為中蔬四號(hào)，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。

1.1.2 供試藥劑。微生物發(fā)酵液由連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究室提供，35%腐霉利懸浮劑購(gòu)于四川宜賓川安高科農(nóng)藥有限公司。

1.1.3 病原菌?；移咸焰撸˙otrytis cinerea）斜面購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.4 PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B1 10 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 灰葡萄孢斜面轉(zhuǎn)接。

從灰葡萄孢斜面取0.5 cm×0.5 cm正方形菌塊接種在PDA平板培養(yǎng)基上，正置放入培養(yǎng)箱，25～28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿平板保存待用。

1.2.2 微生物發(fā)酵液對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用的測(cè)定。

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定。將PDA培養(yǎng)基熔化，待冷卻至45～50 ℃時(shí)，在無菌操作條件下倒入滅菌培養(yǎng)皿中，每皿10～15 mL培養(yǎng)基，搖勻后冷卻凝固。將微生物發(fā)酵液配成不同濃度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀釋），以化學(xué)試劑腐霉利和清水作對(duì)照。取消毒燒杯，標(biāo)記藥劑名稱及濃度，分別盛取藥液，再用滅菌鑷子夾取消毒濾紙片（直徑4～5 mm）分別投入藥液中，然后把浸透的濾紙片按順序列于距培養(yǎng)基中央2.3 cm處，每皿放4片，并在培養(yǎng)皿底面加標(biāo)簽。夾取濾紙片時(shí)應(yīng)在燒杯壁上停留片刻，讓多余的藥液流去。最后將 PDA 平板上培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢霉打成直徑 6 mm的菌餅，接種于 PDA 培養(yǎng)皿中央。每個(gè)處理5次重復(fù)。置于25 ℃左右恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

抑制百分率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%

1.2.3 微生物發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌田間防治效果測(cè)定。

1.2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

將微生物發(fā)酵液配成不同濃度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀釋），以腐霉利和清水作對(duì)照，選取長(zhǎng)勢(shì)一致3葉1心的植株幼苗作處理，每個(gè)處理20株，共3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.2 施藥時(shí)間與方法。

2019年1月3日第1次噴藥，1月10日和1月17日進(jìn)行第2、3次施藥，共3次，采用小噴壺進(jìn)行噴灑番茄植株葉正反面，做到濕而不滴。

1.2.3.3 調(diào)查方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)病初期噴藥前進(jìn)行病情調(diào)查，每次施藥后7 d調(diào)查病害情況。每小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取5株，每株調(diào)查所有葉片上病斑面積占整株葉片的百分比進(jìn)行分級(jí)。按以下[19]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病害分級(jí)。根據(jù)病害調(diào)查結(jié)果計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

0級(jí)：葉片、果實(shí)無病;1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面的5%以下;3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面的6%～15%;5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面的16%～25%;7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面的26%～50%;9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉、果面的50%以上;

病情指數(shù)=100×[（各級(jí)病葉數(shù)×病害級(jí)別數(shù)）]/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）

防治效果=[1-（CK0×PT1）/（CK1×PT0）]×100%

式中，CK0為空白對(duì)照區(qū)施藥前病情指數(shù);CK1為空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù);PT0為藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù);PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定微生物發(fā)酵液對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明，微生物發(fā)酵液對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用（表1），且抑制作用隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加而逐步降低，其中發(fā)酵液原液對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高達(dá)66.26%，其次是發(fā)酵液5倍稀釋液、10倍稀釋液且之間無顯著差異，20倍、40倍稀釋液抑制作用效果最小。

2.2 微生物發(fā)酵液對(duì)保護(hù)地番茄灰霉病的田間防治效果

微生物發(fā)酵液對(duì)保護(hù)地番茄灰霉病的防治效果（表2）表明，在第1次噴施后7 d，微生物發(fā)酵液原液對(duì)灰霉病菌的防效最高可達(dá)48.24%，與35%腐霉利600倍液藥劑對(duì)照、微生物發(fā)酵液5倍稀釋液均無顯著差異;其次是發(fā)酵液10倍稀釋液，防效最低的是20、40倍稀釋液且兩者之間無顯著差異;第2次噴施后7 d，發(fā)酵液原液的防效達(dá)58.15%，顯著低于35%腐霉利600倍液藥劑防效72.10%，且顯著高于發(fā)酵液其他稀釋液處理組的防治效果，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加防效逐漸降低，其中5倍與10倍稀釋液，20倍與40倍稀釋液處理之間的防效均無顯著差異;第3次噴施后7 d，微生物發(fā)酵液原液的防治效果達(dá)60.47%，顯著高于其他各稀釋倍數(shù)處理，與35%腐霉利600倍液藥劑處理的防治效果無顯著差異。隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加防效逐漸降低，且20倍與40倍稀釋液處理之間的防效均無顯著差異。綜上可知，在3次施藥過程中，微生物發(fā)酵液不同處理組對(duì)番茄灰霉病的防治效果逐漸增加，發(fā)酵液原液在第3次噴藥后與藥劑對(duì)照無顯著差異。

3 討論

該研究通過生長(zhǎng)速率法測(cè)定了微生物發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果顯示微生物發(fā)酵液能抑制灰霉菌菌絲的生長(zhǎng)，其原液的抑制作用效果最好，抑制率為66.18%。在田間藥效試驗(yàn)中，微生物發(fā)酵液原液在第3次施藥后7 d對(duì)番茄灰霉病的防效最高，達(dá)60.47%，與35%腐霉利600倍液的藥劑對(duì)照之間無顯著差異。綜合上述研究結(jié)果可以證實(shí)微生物發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病具有一定的防治效果。

目前，微生物發(fā)酵液中的納豆芽孢桿菌主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、保鮮、畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面[20-21]，其發(fā)酵液中殺菌活性物質(zhì)的研究多集中在次級(jí)代謝產(chǎn)物納豆激酶、γ-聚谷氨酸以及一些脂肽類抗菌物質(zhì)[22-23]。納豆芽孢桿菌在農(nóng)作物病害防治方面少有研究，而乳酸菌對(duì)番茄早疫病菌（Alternaria solani）、甜瓜疫霉菌（Phytophthora drechsleri Tucker）、蘋果炭疽病（Glomer ellacingulated）、灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的抑制作用已有人研究[11，24]。酵母菌被作為一種生防菌具有適應(yīng)力強(qiáng)、定殖快、不產(chǎn)生抗菌素等優(yōu)勢(shì)。目前利用酵母菌來防治植物病害主要集中在果蔬采后病害的控制[15，17]。研究證明酵母菌可誘導(dǎo)番茄果實(shí)中防御相關(guān)酶活性增強(qiáng)番茄對(duì)灰霉病抗病能力[25]。由此看來，納豆芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌混合微生物發(fā)酵液在農(nóng)業(yè)殺菌劑的開發(fā)利用方面具有很大潛力，且作用范圍較廣。雖然，目前納豆芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌這3種微生物各自的殺菌作用已有不少研究，但其混合發(fā)酵液的殺菌作用還很少有研究，且對(duì)于鮮食果蔬病害防治方面具有較高的研究?jī)r(jià)值。該試驗(yàn)證實(shí)了該微生物發(fā)酵液對(duì)灰霉病菌的殺菌效果，但其殺菌作用方式及對(duì)其他病原菌的殺菌作用效果還有待進(jìn)一步研究。

47卷21期劉曉梅等 微生物發(fā)酵液對(duì)保護(hù)地番茄灰霉菌的抑制作用效果評(píng)價(jià)

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