不同添加量的紅豆杉葉干粉對仙居雞BCL2和NF-κB基因表達(dá)的影響

劉銀蘭　李國勤　葉軒　李浙烽　趙倩云　顧天天　田勇　李昂　盧立志

摘要 [目的]研究在飼糧中添加不同水平的紅豆杉葉干粉對仙居雞肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、胸肌和腿肌中BCL2和NF-κB mRNA表達(dá)量的影響，以確定紅豆杉葉干粉在仙居雞飼糧中適宜的添加量，并探討紅豆杉葉干粉作為功能性飼料添加劑用于仙居雞生產(chǎn)的可行性。[方法]試驗選取140日齡健康生長狀況良好、體重相近的仙居雞400只作為試驗雞，將其隨機(jī)分為4組，A組為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧;B、C和D組為試驗組，在基礎(chǔ)日糧中分別添加2%、3%、4%的紅豆杉葉干粉，試驗期90 d。[結(jié)果]與A組相比，C、D組雞脾臟BCL2基因表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）;B組雞腎臟BCL2表達(dá)量顯著升高;各組雞十二指腸BCL2表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）;C、D組雞胸肌BCL2表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而B組雞胸肌BCL2表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;D組雞腿肌BCL2表達(dá)量顯著升高（P<0.05），B組腿肌BCL2表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。與A組相比，B、D組雞肝臟NF-κB基因表達(dá)量顯著升高（P<0.05）;B、C組肺臟NF-κB基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;D組脾NF-κB基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;各試驗組十二指腸NF-κB基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05），B、C組雞胸肌NF-κB基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05），C組腿肌NF-κB基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。[結(jié)論]不同添加量紅豆杉葉干粉對仙居雞BCL2和NF-κB基因組織表達(dá)水平具有一定程度的影響。

關(guān)鍵詞 紅豆杉葉干粉;仙居雞;BCL2;NF-κB

中圖分類號 S831.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Various Levels of Dried Yew Leaf Powder on the Gene Expression? of BCL2 and NFκB mRNA in Xianju Chicken

LIU Yinlan1， 2， LI Guoqin1， YE Xuan3 et al

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou，Zhejiang? 310021;2.Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350000;3.Zhejiang Xianju Breeding Farm， Xianju， Zhejiang? 311719）

Abstract [Objective] To study the effects of different levels of dried yew leaf powder on the expression amount of BCL2 and NFκB mRNA in the liver， spleen， lung， kidney， intestine， chest muscle and leg muscle of Xianju chicken and determine the appropriate addition level of dried yew leaf powder in the diet of Xianju chicken，and explore the feasibility of using dried yew leaf powder as a functional feed additive for the production of Xianju chicken. [Method] A total of 400 140dayold healthy Xianju chicken with good growth status and similar? body weight were randomly divided into four groups. The chicken in group A（control group） were fed the basic diet. The chicken in groups B， C and D （experimental groups） were fed with the basal diet with adding 2%， 3% and 4% dried yew leaf powder respectively. The test period lasted for 90 days. [Result]? Compared with group A， the expression levels of BCL2 gene in chicken? spleen of group C and D were significantly decreased （P<0.05）. The expression of BCL2 in group B was significantly increased（P<0.05）.?? The expression level of BCL2 in chicken duodenum of three test groups was significantly decreased （P<0.05）. The expression level of BCL2 in? breast muscle of chicken in group C and D were significantly increased （P<0.05）， and that of group B was significantly decreased （P<0.05）. The expression of BCL2 in leg muscle of chicken in group D was significantly increased （P<0.05）， but that in? group C was significantly decreased （P<0.05）.? Compared with group A， the expression level of NFκB gene in chicken liver of groups B and D were significantly increased （P<0.05）. The expression level of NFκB gene in chicken? lungs of groups B and C were significantly decreased （P<0.05）. The expression level of NFκB gene in chicken spleen of group D was significantly decreased （P<0.05）. The expression level of NFκB gene in chicken duodenum of every test group was significantly decreased （P<0.05）. The expression level of NFκB gene in chicken chest muscles of groups B and C were significantly decreased （P<0.05），but the expression level of NFκB gene in chicken leg muscles of group C was significantly decreased （P<0.05）.? [Conclusion]? Different addition amount of dried yew leaf powder had a certain degree of influences on the expression? levels of BCL2 and NFκB genes in Xianju chicken.

Key words Dried yew leaf powder;Xianju chicken;BCL2;NFκB

基金項目 國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（2014GB2C200207）;浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院仙居雞產(chǎn)業(yè)團(tuán)隊科技特派員項目（103）;仙居縣科技項目（2018B04）。

作者簡介 劉銀蘭（1993—），女，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料。通信作者，研究員，從事家禽遺傳育種和養(yǎng)殖技術(shù)研究工作。

收稿日期 2019-05-17

在正常生理情況下，當(dāng)機(jī)體受到某些刺激后，為保持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，由部分基因控制的細(xì)胞進(jìn)行有序的自殺性死亡稱為細(xì)胞凋亡[1]。與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡對部分基因的激活、表達(dá)和調(diào)控等具有主動干涉的作用，但其不是在病理條件下出現(xiàn)自身受到損害的現(xiàn)象，是為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境，對死亡進(jìn)行主動爭取的過程[2]。BCL2在細(xì)胞凋亡中屬于抑制基因，隸屬于原癌細(xì)胞基因，分布于人類染色體的18q21上，可控制部分凋亡因子的釋放，對腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生異常情況有抑制作用[3]。NF-κB的活性在細(xì)胞內(nèi)外的反饋調(diào)節(jié)中均受到嚴(yán)格控制，在細(xì)胞因子干涉的炎癥反應(yīng)中起到調(diào)節(jié)作用[4]。Sen等[5] 研究發(fā)現(xiàn)NF-κB是一種核蛋白，從漿細(xì)胞核和成熟B淋巴細(xì)胞中提取而來，分布在各種細(xì)胞中[6]。紅豆杉作為一級國家保護(hù)野生珍稀抗癌植物，含有紫杉烷類、木脂素類及黃酮類等化學(xué)成分[7-8]，其中紫杉醇是一種天然二萜類紫杉烷類抗癌活性物質(zhì)，具有較好的抗癌效果[9]，因而成為人們研究關(guān)注的焦點[10]。自1964年Barclay博士在紅豆杉樹皮中提取出紫杉醇，并進(jìn)一步驗證了紫杉醇提取物具有抗癌效應(yīng)[11]以來。國內(nèi)外對其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究，近年來發(fā)現(xiàn)紫杉醇對一些風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病也具有較好的作用[12]。隨著對紫杉醇研究的不斷深入，其在臨床上的應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大[13]，而從中提取的紫杉醇含量僅為干物質(zhì)的0.005%～0.070%[9]。筆者探索了不同紅豆杉葉干粉添加水平對仙居雞不同組織中BCL2和NF-κB mRNA表達(dá)的影響，旨在為紅豆杉葉干粉在家禽生產(chǎn)上的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用紅豆杉葉干粉為2017年度自紅豆杉樹修剪下的枝葉，自然光照曬干后粉粹而成，紫杉醇含量為19.6 μg/g， 由浙江武義曼地亞紅豆杉開發(fā)研究有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取140日齡、健康狀況良好的仙居雞400只，隨機(jī)分成4組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)20只。對照組（A）飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組B、C、D在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別添加2%、3%和4%紅豆杉葉干粉?；A(chǔ)日糧由浙江省仙居種雞場提供，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗雞只采用雙層立體籠養(yǎng)，雞舍為半封閉式，自然光照和通風(fēng)，試驗期90 d 。整個試驗期間，雞只自由采食粉狀飼料、自由飲水，試驗過程中詳細(xì)記錄各組雞的健康情況，按照雞場正常免疫程序進(jìn)行免疫和消毒，飼養(yǎng)管理條件保持一致。

1.3 組織樣品的采集

試驗期第90天，對照組（A）、試驗組（B、C、D）以重復(fù)為單位，每組每個重復(fù)選取1只仙居雞進(jìn)行屠宰放血，采集血液，分離血清，將血清用移液槍轉(zhuǎn)移到離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存待測;同時，摘取肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌等少量組織樣品放入凍存管中，且立即將凍存管放入液氮罐中進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標(biāo)與方法

實時定量 PCR（real-time PCR）法測定肝臟、脾臟、肺臟 、腎臟、十二指腸、胸肌、腿肌BCL2、NF-κB基因的相對表達(dá)量。首先進(jìn)行RNA的提取，從液氮罐中取采集的樣品置于1.5 mL的離心管中，加入1 mL TRIzol Reagent使用漩渦振蕩儀進(jìn)行振蕩，然后加入0.2 mL 氯仿，常溫下放置5 min，待離心機(jī)溫度降至4 ℃時進(jìn)行12 000 r/min離心15 min，然后轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL離心管中，加入2倍體積的70%乙醇，進(jìn)行混勻，再次進(jìn)行離心，棄去廢液，此步驟重復(fù)2次。然后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，嚴(yán)格按照試驗操作說明書進(jìn)行，具體反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 s;95 ℃變性 30 s，60 ℃ 退火50 s，72 ℃ 延伸 15 s，40個循環(huán)。最后，利用 NCBI網(wǎng)站搜索目的基因片段，采用 Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物片段由擎科生物有限公司合成。試驗內(nèi)參選用β-actin，內(nèi)參及目的基因引物序列及參數(shù)見表2。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，基因相對表達(dá)量采用 2-ΔΔCt 方法計算，以 β-actin 作為內(nèi)參基因，其中ΔCt = Cttarget gene-Ctβ-actin，統(tǒng)計結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性檢驗采用LSD法和Duncans法，P<0.05表示差異顯著[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加量紅豆杉葉干粉對仙居雞組織 BCL2 mRNA 表達(dá)的影響

由表3可知，在仙居雞肝臟中，B、C組BCL2 mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05），且B、C組均顯著低于D組（P<0.05）。各組仙居雞肺臟中BCL2 mRNA水平差異不顯著（P>0.05）。在脾臟中，C、D組BCL2 mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05），D組顯著低于B、C組（P<0.05）。在腎臟中，B組BCL2 mRNA水平顯著高于A組（P<0.05），各試驗組間差異不顯著（P>0.05）。在十二指腸中，各試驗組BCL2 mRNA均顯著低于A組（P<0.05）。在胸肌中，C、D組BCL2 mRNA水平均顯著高于A組（P<0.05），B組顯著低于A組（P<0.05）。在腿肌中，D組BCL2 mRNA表達(dá)水平顯著高于A組（P<0.05），而C組顯著低于A組（P<0.05）。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年

2.2 不同添加量紅豆杉葉干粉對仙居雞組織 NF-κB mRNA 表達(dá)水平的影響

由表4可知，在肝臟中，B、D組NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著高于A組（P<0.05），D組顯著高于B、C組（P<0.05）。在肺臟中，B、C組雞NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05）;在脾臟中，D組雞NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05）;在腎臟中，各組間差異均不顯著（P>0.05）。

在十二指腸中，各試驗組仙居雞NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05）。

在胸肌中，B、C組仙居雞NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05），而D組顯著高于B、C組（P<0.05）。在腿肌中，C組NF-κB mRNA表達(dá)水平顯著低于A組（P<0.05）。

3 討論

3.1 紅豆杉葉干粉添加水平對仙居雞不同組織 BCL2 mRNA 表達(dá)的影響

BCL2是Bcl家族眾多成員中，被認(rèn)為是最為廣泛的抗凋亡蛋白基因，在細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用，可保護(hù)正常細(xì)胞，控制線粒體中細(xì)胞色素C等凋亡因子的釋放[15]。肖穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉中的紫杉醇具有抗癌作用，可導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。紫杉醇在細(xì)胞凋亡過程中具有參與誘導(dǎo)作用，受到多種機(jī)制的調(diào)控，主要是對紡錘體的檢查點進(jìn)行激活，對微管動力進(jìn)行穩(wěn)定，在細(xì)胞分裂中期誘導(dǎo)停滯有絲分裂，使細(xì)胞在增殖過程中開始凋亡[17]。該試驗在仙居雞飼糧中添加3%紅豆杉葉干粉后BCL2 mRNA在肝臟、脾臟中的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降的趨勢，可能與紅豆杉中的紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。Eguchi 等[18]報道BCL2在成年雞脾臟、腎臟和心臟中均有表達(dá)。高臨路等[19]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)脾淋巴細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡時，BCL2的表達(dá)呈現(xiàn)出下降的趨勢，說明可抑制細(xì)胞凋亡。雞的消化道較短，對飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)不能進(jìn)行充分吸收，大多數(shù)的營養(yǎng)物質(zhì)會隨糞便排出。由于紅豆杉中的紫杉醇具有溶解度差、吸收率低等缺陷[20]，直接服用紫杉醇會對腸道的功能造成一定的影響，出現(xiàn)惡心、嘔吐、黏膜炎等癥狀[21]，致使試驗組腸道BCL2 mRNA表達(dá)量受到紫杉醇的抑制，出現(xiàn)下降趨勢。該研究中4%紅豆杉添加組胸肌和腿肌中BCL2 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，對胸部和腿部肌細(xì)胞的增殖生長具有促進(jìn)作用，可以提高飼養(yǎng)效率。趙燕等[22]研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中添加紅豆杉葉干粉對肉雞的生長和采食量均具有促進(jìn)作用。

3.2 紅豆杉葉干粉添加水平對仙居雞不同組織NF-κB mRNA 表達(dá)的影響

NF-κB作為主要調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[23]，細(xì)胞內(nèi)外反饋調(diào)節(jié)可嚴(yán)密控制其活性[24]。在動物組織受到有毒物質(zhì)的侵害或者受到物理損傷時最早出現(xiàn)的是炎癥反應(yīng)[25]。NF-κB廣泛分布于細(xì)胞當(dāng)中，可促進(jìn)細(xì)胞再生、炎癥反應(yīng)，同時又能抗凋亡等[26]。金山[27]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝臟細(xì)胞受到侵害影響時誘導(dǎo)NF-κB mRNA 表達(dá)量上升使肝臟再生、抗凋亡能力得到提升，肝臟細(xì)胞的增殖生長受到抑制，觸發(fā)了炎癥反應(yīng)。NF-κB在肝臟細(xì)胞中可起到保護(hù)肝臟的作用，同時也有不利影響。該試驗研究發(fā)現(xiàn)4%紅豆杉添加組仙居雞肝臟中NF-κB mRNA 表達(dá)量上升，說明添加紅豆杉葉干粉可能會對肝臟造成一定的損害，同時誘導(dǎo)NF-κB mRNA 表達(dá)影響肝臟的生理功能，且該試驗結(jié)果表明肝臟中NF-κB mRNA表達(dá)量與添加紅豆杉葉干粉的水平成正比。楊冠琦[28]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗炎殺菌、抵抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖等作用。陳小囡等[29]研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉中的紫杉烷對小鼠足趾腫脹具有抗炎作用。王紅崗[30]報道紫杉烷類化合物可以通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子來減輕大鼠肺泡炎癥和肺纖維化程度。該研究中 3%紅豆杉添加組脾臟、十二指腸、胸肌、腿肌中NF-κB mRNA 表達(dá)量均呈現(xiàn)出下降趨勢。這些表現(xiàn)可能與紅豆杉葉干粉中含有的黃酮類和紫杉烷類物質(zhì)有關(guān)。大量研究表明，許多疾病的發(fā)生和某些致病過程與NF-κB相聯(lián)系，在疾病發(fā)生過程中是一個關(guān)鍵點。當(dāng)前很多學(xué)者認(rèn)為對NF-κB的活性進(jìn)行抑制，可治療與NF-κB相關(guān)的疾病，同時可以維持機(jī)體的防御功能和細(xì)胞代謝的平衡，如NF-κB的活性受到長期抑制，可致使機(jī)體的免疫機(jī)能下降、促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[31]。因此，為了達(dá)到對紅豆杉功能成分的最大利用化，應(yīng)當(dāng)遵循適量原則[32]。

4 結(jié)論

在仙居雞日糧中添加不同水平的紅豆杉葉干粉，可以調(diào)節(jié)BCL2、NF-κB mRNA 基因的表達(dá)量，減少炎癥反應(yīng)。

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