刺梨果渣栽培平菇過(guò)程中蛋白質(zhì)含量變化研究

楊勇　楊禮壽　羅忠圣

摘要 為充分利用刺梨果渣中的氮源，利用刺梨果渣作為培養(yǎng)基主料栽培平菇，通過(guò)凱氏定氮法，研究不同階段下培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量變化。結(jié)果表明，刺梨果渣栽培平菇的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為126%，刺梨果渣、刺梨果渣培養(yǎng)基、菌絲長(zhǎng)滿后培養(yǎng)基、平菇菌絲、子實(shí)體、菌糠的蛋白質(zhì)含量分別為8.05%、9.12%、12.68%、20.74%、19.90%、9.89%。證明刺梨果渣中的氮源可以滿足平菇生長(zhǎng)的需求。

關(guān)鍵詞 刺梨果渣;平菇;凱氏定氮法;蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào) S646.1+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）21-0051-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.016

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Changes of Protein Content in the Cultivation of Pleurotus ostreatus with Roxburgh Rose Fruit Residue

YANG Yong1，2，3，YANG Lishou1，2，LUO Zhongsheng1，2

（1.State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants，Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou? 550025;2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang，Guizhou? 550014;3.Beijing Youhekang Biomedical Technology Co.，Ltd.，Beijing? 100176）

Abstract In order to make full use of the nitrogen source in the fructus rosae roxburghii pomace，fructus rosae roxburghii fruit residue was used as the main material to cultivate Pleurotus ostreatus in the expriment，and then the protein content variables of the medium under different stages were explored by Kjeldahl method.The results showed that the biological transformation rate of Pleurotus ostreatus cultivated Pleurotus ostreatus was 126%.The protein contents of fructus rosae roxburghii pomace，fructus rosae roxburghii pomace medium，mycelium overgrown medium，Pleurotus ostreatus hyphae，fruit body，bacillus were 8.05%，9.12%，12.68%，20.74%，19.90%，and 9.89%，respectively.Experiments have shown that the nitrogen source in the fructus rosae roxburghii pomace could meet the growth requirements of Pleurotus ostreatus.

Key words Epimedium dregs;Pleurotus ostreatus;Kjeldahl method;Protein

基金項(xiàng)目

貴州省科技重大專項(xiàng)“刺梨資源高值化利用技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)化-刺梨高值化新產(chǎn)品研制及示范”（黔科合重大專項(xiàng)字〔2013〕6006-4）。

作者簡(jiǎn)介 楊勇（1989—），男，侗族，貴州貴陽(yáng)人，碩士，從事藥物化學(xué)研究。通信作者，副主任藥師，從事健康產(chǎn)品研究與開發(fā)。

收稿日期 2019-04-23

貴州刺梨資源豐富，刺梨中富含維生素與礦物質(zhì)。何照范等[1]對(duì)刺梨果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其果實(shí)中含有多糖、有機(jī)酸、單寧等成分。刺梨果渣是刺梨果實(shí)經(jīng)榨汁后，所余下的固態(tài)部分，包括果皮、果肉、果梗等。貴州省每年榨汁后的刺梨果渣約1 000 t[2]，刺梨果渣中剩余的功能性成分含量仍很高，尤其是脂溶性成分及不溶性成分，如粗蛋白、纖維素、黃酮類、三萜類等，有再利用價(jià)值。李達(dá)等[3]對(duì)刺梨果渣進(jìn)行了成分分析，發(fā)現(xiàn)刺梨果渣中含有水分76.70%、灰分0.86%、總糖4.67%、單寧0.16%、粗纖維11.20%、蛋白質(zhì)421%。平菇是一種木腐生型的食用菌，具有適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求不高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，將刺梨果渣用作平菇栽培，不僅能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)能解決刺梨果渣帶來(lái)的環(huán)境問題。

凱氏定氮法作為蛋白定量分析的經(jīng)典方法，該方法易于實(shí)現(xiàn)、簡(jiǎn)單可行，且測(cè)試準(zhǔn)確度較高，但該方法存在檢測(cè)過(guò)程較繁瑣、費(fèi)時(shí)[4]、關(guān)鍵點(diǎn)控制不準(zhǔn)等缺陷。特別是手動(dòng)凱氏定氮法，不僅耗時(shí)更長(zhǎng)，準(zhǔn)確度與精密度受人為操作的影響較大，穩(wěn)定性、重復(fù)性與重現(xiàn)性相對(duì)較差。半自動(dòng)或自動(dòng)凱氏定氮法，可以減小人為操作誤差[5]，縮短定量分析的時(shí)間。筆者使用刺梨果渣栽培平菇，通過(guò)平菇的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率分析該栽培方式的可行性;同時(shí)用SKD-100自動(dòng)凱氏定氮儀分別對(duì)不同生長(zhǎng)階段的平菇及其培養(yǎng)料中蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，分析其蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

刺梨果渣（貴州奇昂生物科技有限公司提供），平菇栽培種（天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）;普鈣（過(guò)磷酸鈣與石膏混合物）、石膏、尾礦、石灰粉、重質(zhì)碳酸鈣、玉米面、玉米芯、小麥、馬鈴薯、麩皮、麥秸稈、闊葉樹木屑、棉籽殼;濃硫酸（優(yōu)級(jí)純）、硼砂（優(yōu)級(jí)純），硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚氯、30%雙氧水、硫酸銅、硫酸鉀等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酸式滴定管（北京朋利馳科技有限公司），JKXZ06-20B恒溫消煮儀（上海能共實(shí)業(yè)有限公司），SKD-100自動(dòng)凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 平菇栽培。分別以通用培養(yǎng)基刺梨果渣培養(yǎng)基分別接種平菇栽培種，平菇栽培方法參照單津津等[6]的方法，栽培出菇后計(jì)算平菇的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率[7]。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

1.2.2.1 試劑配制。試劑配制參照GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.2.2.2 0.02 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定。采用減重法。準(zhǔn)確稱量干燥至恒重的優(yōu)級(jí)純硼砂約100.0 mg，置于100 mL錐形瓶中，加20 mL水溶解，滴加2滴甲基紅指示液，用硫酸溶液滴定至粉紅色剛出現(xiàn)，小心煮沸溶液至紅色褪去[8]，冷卻至室溫。繼續(xù)緩慢滴定、煮沸、冷卻，直至剛出現(xiàn)的微紅色在再加熱時(shí)不褪色為止。平行測(cè)定9組，取平均值作為硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。

1.2.2.3 樣品消解。為保證3種樣品消化完全且檢測(cè)結(jié)果能達(dá)到凱氏定氮法的最低檢出限，精密稱取干燥至恒重的供試品粉末各2.00 g[9]，而稱取0.5 g平菇菌絲與平菇粉末，分別置于消化管中，加入優(yōu)級(jí)純濃硫酸10 mL，再加入催化劑粉末（硫酸銅0.05 g，硫酸鉀1.5 g），適當(dāng)搖勻，每個(gè)樣品平行測(cè)定9組。并另取3支消解管，加入等量催化劑和10 mL放入消煮儀中，每一個(gè)消解管上放置一個(gè)小漏斗，350 ℃消解（從100 ℃升溫至350 ℃，防止消解液暴沸），直至消解液澄清略帶藍(lán)綠色[10]且無(wú)碳化物（約4 h）后，加30% H2O2[11]沖洗消解管管壁，繼續(xù)消化20～30 min[12]，關(guān)閉消煮儀，冷卻，用少量水沖洗漏斗[13]和消解管，待測(cè)定。

1.2.2.4 蒸餾和吸收。

檢查凱氏定氮儀的蒸餾水桶和堿液桶水位（若不足，需補(bǔ)充蒸餾水和400 g/L NaOH溶液），打開冷凝水。取一支消解管，加入適量蒸餾水，放入凱氏定氮儀規(guī)定位置，并在吸收導(dǎo)管處放置加蒸餾水的吸收瓶，導(dǎo)管插入液面以下。設(shè)置蒸餾時(shí)間4 min，加堿時(shí)間0 s，沖洗[14]管路4 min，結(jié)束后，消解管的溫度會(huì)降低，吸收瓶的蒸餾水會(huì)倒吸入消解管，則證明該管路氣密性良好，可以進(jìn)行蒸餾。

把裝有樣品的消解管放入凱氏定氮儀規(guī)定位置，并在吸收導(dǎo)管處放置盛有40 mL硼酸溶液的錐形瓶作為吸收瓶（加混合顯色劑的硼酸作為吸收液），注意導(dǎo)管要接觸硼酸液面或液面以下。設(shè)置蒸餾時(shí)間4 min，加堿時(shí)間9 s。當(dāng)蒸餾時(shí)間剩下30 s時(shí)，將吸收導(dǎo)管移除吸收液液面（防止吸收液倒吸），繼續(xù)蒸餾至?xí)r間結(jié)束。蒸餾結(jié)束后，取下消解管和吸收瓶，用少量水沖洗吸收導(dǎo)管下端（沒入液面以下部分），洗液一并并入吸收液中，冷卻，待滴定。

測(cè)試完一種樣品，應(yīng)沖洗一次管路，防止上次試驗(yàn)殘留的NH4+干擾[15]下次測(cè)試樣品的試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2.5 滴定。用標(biāo)定過(guò)的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定吸收液，直至藍(lán)色完全消失，略帶灰色為滴定終點(diǎn)。記錄消耗硫酸體積，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式：

X=2（V1-V2）c×141 000 m×F×100%[16]

式中，X為蛋白質(zhì)含量，%;c為標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液濃度，mol/L;V1為消耗鹽酸的體積，mL; V2為空白消耗鹽酸的體積，mL; m為稱取樣品的質(zhì)量，g; F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)6.25。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇生物學(xué)轉(zhuǎn)化率

由表1可知，刺梨果渣栽培平菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好，平菇生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為126%，高于通用培養(yǎng)基對(duì)照組的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率108%。因此，證明應(yīng)用刺梨果渣中的碳氮源能滿足平菇的生長(zhǎng)需求，同時(shí)能帶來(lái)較高經(jīng)濟(jì)效益[17]。

2.2 平菇不同生長(zhǎng)階段的蛋白質(zhì)含量

由圖1可知，刺梨果渣、刺梨果渣培養(yǎng)基、菌絲長(zhǎng)滿時(shí)刺梨果渣培養(yǎng)基、菌絲體、平菇、完全出菇過(guò)后菌糠的粗蛋白含量分別為8.05%、912%、12.68%、20.74%、19.90%、9.89%。其中二級(jí)種原種蛋白質(zhì)含量最高，藥渣中蛋白質(zhì)含量最低。由于二級(jí)種、菌絲、菌糠與栽培底料混合在一起，因此其蛋白質(zhì)含量與栽培底料的蛋白質(zhì)含量有直接關(guān)系。菌絲的生長(zhǎng)需要大量氮源[18]，出菇之后，氮源的需求量減少，可適當(dāng)調(diào)低氮源所占百分比，同時(shí)調(diào)高碳源的百分比，有利于實(shí)現(xiàn)平菇的增產(chǎn)。平菇利用藥渣中的氮源，但降解利用之后，菌糠的蛋白質(zhì)含量并未變低，說(shuō)明食用菌降解藥渣并不能顯著改變培養(yǎng)基質(zhì)物料的蛋白質(zhì)含量，但藥渣的總質(zhì)量發(fā)生了顯著改變，說(shuō)明平菇生長(zhǎng)過(guò)程中，碳源需求量遠(yuǎn)高于氮源。

3 結(jié)論

刺梨果渣作為一種可循環(huán)利用的中藥資源，不僅可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還可以應(yīng)用于飼料加工、污水處理[19]、有機(jī)肥生產(chǎn)等工業(yè)方面，具有廣泛的應(yīng)用前景。該試驗(yàn)以刺梨果渣栽培平菇的生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為126%，平菇蛋白質(zhì)含量為1990%，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與產(chǎn)率均較高，說(shuō)明利用刺梨果渣栽培平菇是可行的。此方法不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)刺梨果渣資源的二次利用，而且可以獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益，既降低了其帶來(lái)的環(huán)境污染，也降低了平菇的生產(chǎn)成本，是一種高效的生態(tài)農(nóng)業(yè)[20]模式。

刺梨果渣、刺梨果渣培養(yǎng)基、菌絲長(zhǎng)滿時(shí)刺梨果渣培養(yǎng)基、菌絲體、平菇、完全出菇過(guò)后菌糠的粗蛋白含量分別為8.05%、9.12%、12.68%、20.74%、19.90%、9.89%，說(shuō)明菌絲體生長(zhǎng)至出菇前，需要大量的氮源合成生物酶類[21]，在此階段菌絲體細(xì)胞新陳代謝旺盛[22]，調(diào)整合理氮源比例，有利于提高菌絲的生長(zhǎng)速度[23]和平菇藥用活性成分含量[24]，同時(shí)降低木霉菌感染[25]的風(fēng)險(xiǎn)，為科學(xué)合理地利用植物廢渣栽培平菇提供理論依據(jù)。