１２株奶牛乳房炎鏈球菌的分離、鑒定和耐藥性分析

王海燕 李碧春 陳琳

摘要：為了解揚(yáng)州、泰州地區(qū)引起奶牛乳房炎的主要病原體，于2015年11月至2017年6月期間對(duì)揚(yáng)州、泰州地區(qū)奶牛場(chǎng)送檢的乳房炎奶牛的乳樣進(jìn)行病原體分離，共分離鑒定出11株無(wú)乳鏈球菌菌株，1株乳房鏈球菌菌株。使用卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢西丁、多黏菌素B、紅霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、氧氟沙星、阿奇霉素等藥物進(jìn)行了耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離菌對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林和多黏菌素B等藥物有一定的耐藥性，對(duì)其他幾種藥物敏感。

關(guān)鍵詞：奶牛;乳房炎;病原菌;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.23? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2019）10-0005-03

奶牛乳房炎是指病原微生物侵入奶牛乳腺組織或外傷、化學(xué)刺激乳腺組織所引起的奶牛乳房炎癥[1]。乳房炎是奶牛最常見的疾病，不僅會(huì)影響產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)，也因治療時(shí)間長(zhǎng)、大量使用多種抗生素，造成藥物殘留和細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。我國(guó)關(guān)于奶牛乳房炎發(fā)病率的報(bào)道在46%～70%[2，3]。

引起奶牛乳房炎病原菌種類較多，有時(shí)為多重感染，最常見的是金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌[4]。鏈球菌屬致病菌，感染奶牛乳房后所引起的臨床癥狀不明顯，從而不易被牛場(chǎng)察覺(jué)，危害極大，最直觀的經(jīng)濟(jì)損失是奶牛乳產(chǎn)量下降，牛奶品質(zhì)變差。鏈球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，有莢膜[5]，莢膜及其M蛋白在致病過(guò)程中起到重要作用[6]。無(wú)乳鏈球菌屬于B群鏈球菌，莢膜多糖、神經(jīng)氨酸酶等是其重要的毒力因子[7]，一些菌株具有溶血特性。部分β型溶血型鏈球菌致病力強(qiáng)，可引起多種化膿性疾病，產(chǎn)生溶血素、CAMP因子、透明質(zhì)酸酶和神經(jīng)氨酸酶等毒性因子[8]。停乳鏈球菌（GCS）為溶血鏈球菌，能分泌透明質(zhì)酸、O型溶血素和纖維蛋白溶解酶[9]。這些毒力因子在致病過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

為了解揚(yáng)州、泰州地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原體，對(duì)送檢的牛乳樣本進(jìn)行了病原分離和鑒定，并進(jìn)行了耐藥性試驗(yàn)。

1? 方法

1.1? 細(xì)菌分離

將送檢乳樣無(wú)菌接種于綿羊血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落生成并進(jìn)行3次傳代純化，最終記錄菌落結(jié)果。

1.2? 染色鏡檢

對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.3? 生化試驗(yàn)

利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，操作方法與判定標(biāo)準(zhǔn)參照說(shuō)明書）對(duì)分離所得菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，與對(duì)照管比對(duì)，觀察反應(yīng)結(jié)果并記錄。

1.4? PCR擴(kuò)增與測(cè)序、分析

使用TaKaRa 16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒對(duì)分離株的16s rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，體系見表1。PCR反應(yīng)參照試劑盒提供的條件：94 ℃預(yù)變性5 min，變性1 min，退火溫度53 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，再延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定、BLAST，根據(jù)同源性高低確定細(xì)菌種屬。

1.5? 藥敏試驗(yàn)

使用卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢西丁、多黏菌素B、紅霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、氧氟沙星、阿奇霉素等藥物進(jìn)行分離菌株的耐藥性試驗(yàn)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 細(xì)菌分離結(jié)果和菌落形態(tài)

牛乳樣本接種血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后長(zhǎng)出菌落，挑取菌落進(jìn)一步鑒定。分離出12株菌落的形態(tài)和特征見表2和圖1。

2.2? 染色鏡檢

12株菌株均呈短鏈狀，革蘭氏染色均有不同程度的藍(lán)色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，符合鏈球菌的特征。

2.3? 生化結(jié)果

對(duì)分離的12株鏈球菌菌株進(jìn)行了生化特性試驗(yàn)，符合鏈球菌的生化特性，結(jié)果見表3。

2.4? 測(cè)序結(jié)果

16s rRNA基因序列進(jìn)行了BLAST分析，均為鏈球菌，其中無(wú)乳鏈球菌11株，乳房鏈球菌1株，序列提交GenBank，登錄號(hào)見表4。

2.5? 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林和多黏菌素B等藥物有一定的耐藥性，對(duì)其他幾種藥物敏感（表5），判定標(biāo)準(zhǔn)見表6。

3? 討論

3.1? 奶牛乳房炎病原菌

試驗(yàn)分離得到的12株鏈球菌菌株，其中無(wú)乳鏈球菌11株，乳房鏈球菌1株，說(shuō)明該地區(qū)的奶牛乳房炎病例中無(wú)乳鏈球菌較多。乳房炎病例中，金黃色葡萄球菌是最多的病原菌[10]，鏈球菌分離率僅次于金黃色葡萄球菌，鏈球菌性乳房炎引起的臨床癥狀不明顯，不易被察覺(jué)，但造成的危害極大，使奶牛乳產(chǎn)量明顯下降，品質(zhì)變差，它們不僅感染乳房腺體，也會(huì)對(duì)奶牛乳腺組織造成不可逆的損傷與破壞，導(dǎo)致乳腺泌乳功能受損甚至完全喪失[11]。無(wú)乳鏈球菌專性寄生于奶牛乳腺、乳頭和生殖道，可引起嬰幼兒的敗血癥、腦膜炎、肺炎[12]，對(duì)青霉素、氯霉素、慶大霉素、紅霉素等較為敏感。根據(jù)本試驗(yàn)得到的結(jié)果可以看出，受試藥物中有部分藥物，如紅霉素在奶牛的使用上還有一定的空間。氯霉素在獸醫(yī)上已經(jīng)是禁用藥物，對(duì)慶大霉素有一定的抗藥性，分離菌對(duì)阿莫西林、萬(wàn)古霉素和阿奇霉素等藥物敏感，可用于臨床上的感染控制。

3.2? 奶牛乳房炎的防治

雖然抗生素能有效治療奶牛乳房炎，但藥物殘留危害人類健康，同時(shí)又產(chǎn)生耐藥性，因此不能依賴抗生素。近年來(lái)，中草藥治療乳房炎的研究越來(lái)越多，中草藥通過(guò)提高非特異性免疫和抗菌作用實(shí)現(xiàn)對(duì)奶牛乳房炎的治療[13-15]。奶牛乳房炎發(fā)生時(shí)很多是隱形感染的，擠奶時(shí)交叉感染會(huì)造成大規(guī)模乳房炎，奶牛場(chǎng)本身的管理因素，通風(fēng)不良、衛(wèi)生問(wèn)題等也為病原菌傳播提供了一定條件，因此，及時(shí)對(duì)奶牛進(jìn)行體檢、保證奶牛場(chǎng)環(huán)境也非常重要。

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