基于群體感應的單增李斯特菌生物膜形成與控制研究進展

劉昀閣，羅 欣,2,3，董鵬程，朱立賢，毛衍偉，梁榮蓉，楊嘯吟，韓廣星，張一敏,2,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，山東 泰安 271018；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；4.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000）

生物膜是指附著于物體表面，由細菌和自身分泌的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的多糖蛋白復合物。其中，多種EPS（多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等）組成了生物膜三維結(jié)構(gòu)的基本骨架，其對細菌在固體表面黏附以及連接起到關(guān)鍵的作用[1]。細菌生物膜可以在食品表面（如農(nóng)產(chǎn)品或動物胴體）或與食品接觸的底層（如設備和加工環(huán)境）附著并生長，已經(jīng)在食品工業(yè)中引起了特別的關(guān)注[2]。此外，生物膜為微生物提供棲身之所，微生物對環(huán)境壓力具有很強的抵抗力，如對消毒劑和抗微生物處理的耐受[3]。因此，在肉類、魚類、乳制品和家禽加工中與生物膜形成相關(guān)的問題是司空見慣的。

食源性致病菌在食品加工接觸面形成生物膜是一個動態(tài)演變過程，根據(jù)生物膜中菌群聚集的規(guī)律，其形成過程可分為以下5 個階段[4-6]：1）浮游態(tài)階段，細菌表面的黏附蛋白對物體表面進行特異性識別，進而黏附在物體表面上；2）可逆黏附階段，細菌在經(jīng)過第一步的黏附后，進行分泌胞外多糖的代謝活動，形成一定的細菌群落，對此階段的黏附菌體施加溫和的作用力就可使其從接觸表面脫落；3）不可逆黏附階段，隨著胞外多聚糖基質(zhì)的不斷合成分泌，逐漸形成有一定組織形態(tài)的生物膜結(jié)構(gòu)，此時的黏附菌體與接觸表面間連接牢固，溫和的外界作用力不能輕易地使其從接觸表面脫離；4）生物膜成熟階段，此階段的生物膜分泌大量的EPS，菌體不斷繁殖，形成了具有一定空間結(jié)構(gòu)的細菌群體，此階段細菌內(nèi)部的功能基因開始表達并伴隨產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物；5）生物膜的主動分散階段，此階段生物膜內(nèi)部細菌開始凋亡，同時細菌分泌的酶類物質(zhì)會使生物膜結(jié)構(gòu)分解；作為生物膜生命周期的最后一步，活的細菌可分散到周圍的環(huán)境中去，重新變?yōu)楦∮螤顟B(tài)[7]。

食源性病原體在食品接觸面產(chǎn)生的生物膜持續(xù)存在，關(guān)于其影響食品質(zhì)量和安全的報道相當多。與生物膜有關(guān)的病原體暴發(fā)案例通常與單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7有關(guān)[8]。在乳品加工中，與引起腐敗的假單胞菌和蠟狀芽孢桿菌相比，Lm在乳品加工的各個環(huán)節(jié)均有檢出[9]，Lm在冷藏環(huán)境中的耐受性強，Sim?es等發(fā)現(xiàn)Lm在乳品加工設施中存在可長達7 年之久[10]。

影響生物膜形成過程的調(diào)節(jié)因素可分為環(huán)境條件（溫度、底物性質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)可利用性、pH值、水分活度和脅迫劑等）和微生物特征（菌株、細胞表面、生長期和代謝活性等）[11]。生物膜可以在食品加工環(huán)境中作為持久的交叉污染和微生物污染物的儲庫，導致食源性疾病發(fā)生的風險更高，并且降低食品保質(zhì)期。在食品工業(yè)和環(huán)境中，要采取控制措施，預防生物膜形成或根除現(xiàn)有的生物膜，以盡量降低因食用受污染食品而廣泛傳播致病菌株的潛在風險。

1 Lm生物膜特性

Lm為革蘭氏陽性、兼性厭氧型、無芽孢短桿菌，是一種常見的食源性致病菌。Lm引起的疾病可以導致壞血病、腦膜炎或引發(fā)孕婦流產(chǎn)，是一種高住院率、高病死率的嚴重疾病，這種食源性感染主要影響小孩、老人、孕婦和免疫受損的個體[12-13]。據(jù)統(tǒng)計，超過99%的人感染Lm的患者是由于食用了受污染的食品，特別是冷藏食品和即食食品（如熟肉制品、乳制品、熏魚和海鮮）[14-15]。Lm是一種嗜冷菌，極易在食品或加工環(huán)境中殘留，與大部分食源性致病菌相比，Lm可耐受食品加工環(huán)境中各種不利條件（如低溫、高滲透壓和低pH值等），它可以在pH 4.6～9.5、水分活度低至0.92的條件下生長，甚至在溫度低于0 ℃條件下仍可繁殖[16]。根據(jù)Carpentier等的研究表明，Lm的控制之所以成為食品工業(yè)的難題，主要歸因于其較強的生物膜形成能力[16]。生物膜結(jié)構(gòu)賦予細菌對于消毒劑更強的耐受性，據(jù)報道，Lm生物膜在食品加工設備、傳送帶、管道、地板等場所能夠持續(xù)附著數(shù)月甚至數(shù)年，造成交叉污染和器械腐蝕等后果[17]，Lm生物膜獨特的持久性也與其在低溫環(huán)境下的生存和繁殖能力有關(guān)。Lm生物膜在食品工業(yè)的設備和環(huán)境中，特別是在不利條件下長期持續(xù)存在的能力，自上個世紀末期就引起了科學界的研究興趣。

Lm生物膜主要形成于親水性表面（不銹鋼和玻璃等），在疏水性表面（聚四氟乙烯、尼龍和丁腈橡膠等）形成能力較弱[18]。Lm在接觸表面上生物膜的形成能力強是由于其在較短接觸時間內(nèi)可以利用鞭毛、膜蛋白附著，且附著能力良好。Lm生物膜在接觸表面的黏附是由疏水相互作用、范德華力和靜電作用引起的，這些作用受鞭毛形成、纖維產(chǎn)生以及胞外多糖合成的影響[19]，如鞭毛的產(chǎn)生影響靜電斥力作用，增強了細胞向非生物或生物表面特定附著點的運動[20]。此外，Tresse等研究發(fā)現(xiàn)在pH 5.0下鞭毛蛋白合成下調(diào)對Lm在聚苯乙烯表面黏附能力的影響，結(jié)果表明鞭毛形成對pH值具有敏感性[21]。

最初研究表明，Lm的生物膜結(jié)構(gòu)為三維蘑菇狀（圖1A）[20]。隨后，Rieu等通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在動態(tài)條件下LmEGD-e菌株的生物膜為三維球形網(wǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)（圖1B）[22]。Pan等使用掃描電子顯微鏡（圖1C）、熒光顯微鏡、原子力顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等成像技術(shù)研究了Lm生物膜的形成和發(fā)展過程[23]。研究表明，Lm在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的生物膜結(jié)構(gòu)不同，包括貼壁細胞單層結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)、多層結(jié)構(gòu)、蜂窩狀結(jié)構(gòu)、蘑菇狀結(jié)構(gòu)、針織鏈結(jié)構(gòu)、無組織聚集結(jié)構(gòu)等[24-25]。

Lm生物膜的EPS由蛋白質(zhì)、多糖、核酸和脂類組成，它們?yōu)榧毦郝涮峁┍Ｗo、隔離金屬和毒素、防止生物殺菌劑進入并可作為生物膜形成過程中的基質(zhì)[26]。研究表明，Lm具有產(chǎn)生EPS的能力，這是其生物膜形成的標志之一[27]。而Lm產(chǎn)生的EPS中存在核酸（胞外DNA）和蛋白質(zhì)是生物膜成熟的標志[28]。其中，胞外DNA會調(diào)節(jié)酸堿作用以增強Lm在不同接觸表面的初始黏附[15]。生物膜相關(guān)蛋白是Lm形成EPS中的另一個重要組成部分，如(p)ppGpp合成酶（RelA和Basl）在細胞間通信中起重要的作用[29]。在生物膜發(fā)育過程中，很多蛋白表達被上調(diào)，如丙酮酸脫氫酶、30S核糖體蛋白（YvyD和RpsB）、傳感蛋白（CysK）、6-磷酸果糖激酶、超氧化物歧化酶、DNA修復蛋白（RecO）和細胞分裂起始蛋白（DivIVA），它們在應激反應、碳水化合物代謝、DNA修復、細胞增殖和群體感應（quorum sensing，QS）調(diào)節(jié)中起著重要作用[1]。

圖 1 Lm在不銹鋼表面形成生物膜的掃描電子顯微鏡及激光共聚焦圖像（2 d）[20,22,24]Fig. 1 Observation of L. monocytogenes biofilm formation on stainless steel on the 2nd day[20,22,24]

2 生物膜與QS系統(tǒng)

2.1 QS概述

細菌生物膜的形成分為5 個階段，細菌在接觸表面一旦進入不可逆黏附階段，參與細胞表面蛋白表達和EPS生成的基因就會通過一種稱為“QS”的過程被激活，該過程用于細胞間的通信[30]。QS是細胞與細胞之間的一種交流，這種交流是由特定的信號分子（即自誘導物（auto-induce，AI））完成的，積累到一定水平的信號分子可與細胞內(nèi)的特定受體結(jié)合，進而調(diào)控相應基因的表達，從而轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄠€細胞之間共同協(xié)作的生理特性[31]。QS效應與細菌生物膜的形成、毒力侵襲特性和應激響應等生理特性密切相關(guān)。QS主要作用于生物膜形成的聚集階段，細菌在受到不利外界條件脅迫后，會通過QS系統(tǒng)發(fā)出信號，使細菌聚集并形成生物膜[32]。

為了抵御環(huán)境的變化，細菌已經(jīng)發(fā)展出一些機制來感知周圍的環(huán)境，整合信號并使其在波動條件下繁殖。在這些機制中，細菌在細胞之間交換信息的能力已經(jīng)成為過去40 年來微生物學家感興趣的一個動態(tài)領(lǐng)域[32]。QS賦予細菌通過感應特定信號分子積累來識別菌落密度的能力。只有當菌落密度高時，信號在細胞外環(huán)境中的積累才足以激活應激響應。在結(jié)構(gòu)上，QS信號分子的分子質(zhì)量較低并且屬于多種化學類別，包括?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactone，AHL）、呋喃糖基硼酸二酯（autoinducer-2，AI-2）以及寡肽自誘導因子（autoinducing peptide，AIP）。細菌以合作方式完成生物膜的發(fā)育，是其最常見的合作過程之一[33]。

生物膜是微生物的群落，它們附著于表面或相間，并嵌入自我產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)中。在生物膜內(nèi)部，細菌可以免受環(huán)境壓力，如干燥、免疫系統(tǒng)攻擊、原生動物攝入和抗菌劑[34]的影響。在考慮生物膜發(fā)育與QS之間的關(guān)系時，首先應關(guān)注細菌密度是否達到使QS信號參與生物膜調(diào)節(jié)的閾值水平，初始黏附階段細菌密度無法觸發(fā)信號分子，因為此階段的細菌涌動能力較強。當附著的細菌分裂并形成微菌落時，群體密度增加，QS信號分子達到足夠的水平以協(xié)調(diào)并激活生物膜的成熟和解體[35]。由于QS調(diào)控網(wǎng)絡通常非常復雜，包括多個影響生物膜在不同階段發(fā)育的基因，因此QS最終觸發(fā)生物膜的機制尚不清楚。

2.2 Lm種間信息傳遞和自誘導

在Lm等革蘭氏陽性菌中，QS自誘導物分為AI-2和AIP[36]。其中AIP是革蘭氏陽性菌所特有的信號分子[37]，而AI-2則為革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌所共有[31]。

2.2.1 AI-2系統(tǒng)

AI-2型QS系統(tǒng)最早是在海洋細菌哈氏弧菌中發(fā)現(xiàn)的[36]。在該系統(tǒng)中，核苷酶和S-核糖同型半胱氨酸酶（S-ribosylhomocysteinase，LuxS）兩種酶將S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH）轉(zhuǎn)化成同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮[38]。AI-2信號分子既存在于革蘭氏陰性細菌也存在于革蘭氏陽性細菌中，沒有種族特異性，也是目前所知的唯一能進行種內(nèi)和種間交流的通用信號[39]。

目前在Lm基因組中尚未發(fā)現(xiàn)完整的AI-2的檢測和信號傳遞系統(tǒng)，Belval等研究發(fā)現(xiàn)luxS缺失株累積了AI-2的前體物質(zhì)S-核糖基高半胱氨酸（S-ribosyl homocysteine，SRH）和SAH，用體外合成的AI-2互補突變體菌株對生物膜形成沒有影響，但是添加外源性SRH增加了附著細胞的數(shù)量。因此推測AI-2可能是甲基活化循環(huán)的副產(chǎn)物，僅扮演代謝SAH從而去除SAH毒性的作用，而在細胞QS系統(tǒng)信號傳遞中不起作用[36]。相反，AI-2的前體物質(zhì)SRH在生物膜形成中扮演重要作用，有可能參與細胞之間的通信[40]。

2.2.2 雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)

→Ten boys competed against each other，two of whom came from our school.

在革蘭氏陽性菌中，基于寡肽AIP QS系統(tǒng)的多個通道已被研究證實[41-42]（圖2A）。附屬基因agr系統(tǒng)最早在金黃色葡萄球菌中被提出，經(jīng)證實該系統(tǒng)與金黃色葡萄球菌的許多毒性因子的產(chǎn)生及生物膜的形成有關(guān)[43]（圖2B）。在金黃色葡萄球菌中，AIP是通過雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)產(chǎn)生的，其中AgrC蛋白是膜結(jié)合的組氨酸激酶，AgrA蛋白是反應調(diào)節(jié)器。磷酸化AgrA蛋白分別激活P2和P3啟動子進而編碼agr啟動子（即RNA II）和RNA III。RNA III轉(zhuǎn)錄后激活毒力因子的產(chǎn)生，抑制rot（毒素的抑制因子）的表達，從而使毒力因子的表達不被抑制[44]。有充分的證據(jù)表明，在金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌中，QS相關(guān)基因表達調(diào)控涉及到毒力因子的表達[45]，當?shù)竭_生物膜成熟階段，RNA III刺激α-及β-溶血素、腸毒素等多種分泌毒力因子表達，同時降低幾種表面黏附基因的表達，從而導致毒性增加和生物膜形成減少[46]。

圖 2 革蘭氏陽性菌中肽介導的QS系統(tǒng)模型[35,41-43,47]Fig. 2 Models of peptide-mediated regulatory QS systems found in Gram-positive bacteria[35,41-43,47]

Lm的4 個基因agrB、D、C、A具有與葡萄球菌agrB、D、C、A操縱子相似的調(diào)控機制，其中agrB和agrD編碼跨膜蛋白和前肽AgrD[48]。AgrB蛋白參與將AgrD加工成環(huán)狀AIP并將其運輸?shù)郊毎狻；騛grC和agrA編碼雙組分系統(tǒng)AgrC/AgrA的傳感器激酶和反應調(diào)節(jié)器[49]。研究表明，基因agrD或agrA缺失的LmEGD-e菌株的成膜能力和毒力與母本相比均受到顯著影響[50]。Riedel發(fā)現(xiàn)，在?agrD突變體中，其毒力受到了良好的調(diào)控，毒力相關(guān)基因（hlyA、actA、plcA、prfA和inlA）的表達下調(diào)[49]。Lm中重要的毒力基因是通過毒力轉(zhuǎn)錄因子PrfA調(diào)控的，PrfA調(diào)控毒力因子如李斯特菌溶血素（listeriolysin，LLO）、特異性磷脂酶C（phosphatidylcholine-specific phospholipase C，PC-PLC）和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶等，有報告表明，Lm生物膜的形成與LLO、PC-PLC等毒力因子有關(guān)[51]。

盡管有些革蘭氏陽性菌的agr系統(tǒng)在許多蛋白質(zhì)水平、遺傳特性和表型性狀的調(diào)節(jié)存在相似性，但已知的agr系統(tǒng)在基因調(diào)控機制方面存在差異[52]。在葡萄球菌中大量的agr依賴性基因受RNA III調(diào)節(jié)，而在廣泛的生物信息學調(diào)查和轉(zhuǎn)錄分析中尚未發(fā)現(xiàn)Lm中RNA III的調(diào)節(jié)作用[53]。因此，在葡萄球菌中由RNA III調(diào)控的毒力因子表達及生物膜形成的類似機制，在Lm中仍需進一步探究。

3 Lm生物膜的抑制

現(xiàn)有Lm生物膜的抑制策略包括機械活性、天然和合成化合物的應用、酶解、抗菌藥物的使用、QS的抑制以及對營養(yǎng)物和空間的競爭抑制[51,54]。

3.1 物理方法

物理方法對生物膜的抑制可以有效避免抗生素帶來的細菌抗藥性問題。有研究表明，外加電場對細菌細胞形態(tài)、糖蛋白和膜蛋白均有影響，外加電場增強了細菌與接觸表面的靜電斥力，從而導致生物膜的分離[55]。據(jù)報道，在溫度為28 ℃和31 ℃下，40 kV/cm的脈沖電場可以使牛乳和雞蛋中的Lm失活從而降低其黏附[56]。外加電場與抗生素協(xié)同使用可提高對生物膜的破壞效果。

超聲處理也是去除生物膜的傳統(tǒng)物理方法，然而結(jié)合化學方法（抗生素和消毒劑）在特定頻率和強度下進行超聲處理是一種新思路，可以更好地破壞生物膜EPS基質(zhì)并殺死細菌細胞，這是由于超聲使細胞膜通透性增加，促使抗生素和消毒劑發(fā)揮更佳效果[57]。Torlak等研究表明，室溫下超聲處理雖可減少聚苯乙烯表面Lm生物膜的附著，但與氯化苯扎溴銨聯(lián)合使用可顯著降低生物膜形成量[58]。單純物理或機械方法并不能完全減少或消除生物膜的黏附，因此使用化學方法或生物殺菌劑與物理方法相結(jié)合可有效減少或消除生物膜，是一種極具發(fā)展前景的方法。

3.2 化學方法

化學消毒劑，如堿、酸、表面活性劑、酶和金屬離子通過干擾未成熟生物膜的附著和發(fā)育來阻止生物膜的形成[59]。化學消毒劑的效果取決于使用的消毒劑的種類、使用量、接觸時間、pH值、生物活性類型以及表面類型等因素[60]。

化學方法在Lm生物膜去除的應用中存在各自不同的優(yōu)缺點，在后續(xù)的研究中需要揚長避短，研究出更加有效且危害低的生物膜抑制劑。

3.3 植物提取物法

隨著傳統(tǒng)抗生素抗性菌株的出現(xiàn)，天然植物提取物的利用已成為食品工業(yè)中抑制食物病原體傳播的一種趨勢[70]。植物提取物不僅具有抗菌活性，而且可以抑制生物膜的產(chǎn)生和發(fā)展[71]。

精油是芳香植物中產(chǎn)生的天然揮發(fā)性酚類化合物，作為次生代謝物產(chǎn)生，如丁香精油、肉桂精油、百里香精油、麝香草精油、檸檬草精油和牛至精油，具有抗菌和抗生物膜的特性[72-73]。研究表明，從香辛料中提取的肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里酚能夠有效地控制Lm生物膜的生成[63,74]。de Oliveira等用肉桂精油處理大腸桿菌和Lm混合培養(yǎng)的生物膜16～20 min，結(jié)果表明，除精油使用量和處理時間外，pH值對消毒效果也有顯著影響[75]。蓍草精油可以有效抑制Lm在不銹鋼表面的黏附，并抑制其生物膜的生長，且隨著處理時間的延長其抑制效果越明顯。有趣的是，在0.5 倍最小抑制濃度（minimal inhibit concentration，MIC）下蓍草精油抑制Lm生物膜形成的效果要顯著優(yōu)于2.0 倍MIC，這與浮游菌的抑制存在顯著差異[76]。Liu Qianjin等研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛、丁香酚、麝香草酚與鏈霉素協(xié)同作用對Lm生物膜的抑制效果更好，此結(jié)果表明植物精油可以促進抗生素進入細菌生物膜，這可能是由于植物精油可以影響細菌間的信號交流，從而影響其生物膜的穩(wěn)定[77]。

天然植物提取物是減少或消除浮游細菌細胞和生物膜商用化學殺菌劑的有效替代品。在多數(shù)情況下，這些天然化合物的活性相當于甚至優(yōu)于化學殺菌劑。

3.4 植物提取物對細菌QS的抑制

目前，植物提取物中斷QS系統(tǒng)的能力逐漸得到人們的關(guān)注，它可以成為抵御細菌入侵的有效機制。植物性食物提取物或植物化學物質(zhì)之所以被認為是理想的QS抑制劑，是由于其作為抗生素替代品化學穩(wěn)定性強、分子質(zhì)量低，且對人體健康無害[78-79]。

表 1 天然抑菌物質(zhì)對細菌QS的抑制Table 1 Inhibition of bacterial QS by natural antimicrobial substances

由表1可以看出，目前使用天然抑菌物質(zhì)對于Lm生物膜抑制的研究還大多停留在表觀研究，對于其抑制機理的研究較少，特別是從QS角度闡明其生物膜抑制機制的研究更是鮮有報道。因此，基于QS對天然抑菌物質(zhì)抑制Lm生物膜的研究將成為該領(lǐng)域進一步研究的熱點及方向。

4 結(jié) 語

食源性致病菌形成生物膜黏附于物體表面且難以清除，可以抵抗逆性環(huán)境，是導致食源性致病菌持續(xù)污染食品的重要因素之一。因此，研究Lm生物膜的形成和抑制機制對于食品加工中微生物的安全控制具有重要意義。目前研究表明QS系統(tǒng)可能參與生物膜形成和毒力因子表達的調(diào)控，研究LmQS系統(tǒng)與生物膜形成和毒力因子表達的潛在機制將成為一個重要的研究方向，將為群體猝滅手段徹底清除Lm生物膜和研制新型抗菌物質(zhì)提供參考，對控制Lm食源性污染及其危害形成機制研究具有重要的意義。