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    鄰苯二甲酸二丁酯的光敏毒性作用及機(jī)制

    2019-12-03 01:08:18李志軍包海鷹
    食品科學(xué) 2019年21期
    關(guān)鍵詞:染毒日光灌胃

    李志軍,包海鷹*

    (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菌物資源及開發(fā)利用重點(diǎn)研究室,食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長春 130118)

    鄰苯二甲酸酯(phthalate esters,PAEs)是鄰苯二甲酸的酯化衍生物。作為塑化劑,PAEs被廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、油墨的生產(chǎn)中,同時(shí)也可添加于驅(qū)蟲劑、發(fā)膠噴霧劑、指甲油和火箭燃料中,但PAEs對(duì)人類健康具有嚴(yán)重危害[1]。PAEs是全球最普遍的環(huán)境激素類污染物,在食品、飲用水、人體體液中被不同程度檢出[2]。美國國家環(huán)保局將PAEs列為環(huán)境優(yōu)先污染物,同時(shí)其也被人們稱為“第二個(gè)全球性多氯聯(lián)苯污染物”。PAEs經(jīng)口進(jìn)入人體后主要以水解產(chǎn)生單酯的形式被吸收,單酯被認(rèn)為是產(chǎn)生毒性的主要化合物。哺乳動(dòng)物腸黏膜細(xì)胞中的腸酯酶及小腸中的細(xì)胞外膜可將PAEs水解成單酯[3],如鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)進(jìn)入體內(nèi)后可水解為鄰苯二甲酸單丁酯(mono-n-butylphthalate,MBP)。PAEs被吸收后主要以蛋白結(jié)合體的形式通過血液分布于全身各器官[4]。PAEs類化合物感染大鼠后,在大鼠肝臟、腎臟、心臟、肺、睪丸等各臟器中均可檢出其原型及代謝產(chǎn)物,甚至還可以通過血腦屏障在腦組織中檢出[5]。研究表明,MBP生物活性更高、毒性更強(qiáng),其不僅對(duì)生殖、發(fā)育、體內(nèi)激素、核受體、炎癥和肥胖等方面都能產(chǎn)生影響,甚至還可以致死、致畸、致突變[6];因此MBP成為PAEs毒性研究的新熱點(diǎn)[7-11]。MBP灌胃染毒大鼠后,肝臟和腎臟中活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量較高,谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量較低。MBP的暴露與大鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷存在直接聯(lián)系[12-13]。據(jù)Cao Yuchun[14]和白璐[15]等報(bào)道,在食用膠質(zhì)菌中含有天然的PAEs類物質(zhì)并具有光敏活性,但目前尚鮮見對(duì)DBP導(dǎo)致的光敏體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及機(jī)制的研究。本研究以DBP為對(duì)象,從自由基損傷和肝臟、腎臟毒性角度探討DBP的光敏毒性、致毒機(jī)制和體內(nèi)代謝過程,以期為全面評(píng)價(jià)PAEs對(duì)人體健康的影響提供更豐富的信息,為全面了解PAEs毒性提供依據(jù),為安全性評(píng)價(jià)和毒性機(jī)制的研究提供參考資料。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、材料與試劑

    雄性Wistar大鼠(體質(zhì)量200~220 g)購自吉林大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(吉)2016-0003。

    DBP標(biāo)準(zhǔn)品、MBP標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%) 美國Sigma公司;甲基叔丁基醚(純度≥99.0%) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;冰醋酸、三氯乙酸、氯仿(均為分析純)、甲醇(色譜純) 美國Tedia公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;1K15高速離心機(jī) 美國Sigma公司;MVS.1漩渦混合器 北京北德科學(xué)器材有限公司;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;ME204E型萬分之一天平梅特勒-托利多(常州)稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司;電子轟擊質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司;電噴霧離子源浙江好創(chuàng)生物技術(shù)有限公司;RM2126RT切片機(jī)德國Leica公司;BX51光學(xué)顯微鏡(附帶DP75數(shù)碼相機(jī)) 日本Olympus公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DBP和MBP質(zhì)量濃度的測定

    色譜柱:C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B:體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液。梯度條件:0~5 min,80%~95% A;5~9 min,95%~100% A;9~10 min,100% A;10~13 min,100%~80% A;13~15 min,80% A。流速:0.25 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

    1.3.2 DBP體外實(shí)驗(yàn)

    對(duì)6 只健康Wistar雄性大鼠眼眶取血10 mL,置于肝素化的離心管中,3 000×g離心15 min,吸取血清4 mL作為空白。分別取40 mg DBP溶于2 mL生理鹽水和2 mL大鼠血清中,避光30 ℃放置12 h(避光組);分別取40 mg DBP溶于2 mL生理鹽水和2 mL大鼠血清中,置于日光下12 h(日光組)。3 000×g離心15 min,取血清0.2 mL,添加0.6 mL甲醇,漩渦振蕩1 min,離心,上清液70 ℃下烘干,再用0.2 mL甲醇超聲溶解,離心,微孔濾膜過濾。取上清液10 μL,按照1.3.1節(jié)方法測定DBP和MBP質(zhì)量濃度。

    1.3.3 DBP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

    1.3.3.1 DBP血藥濃度的測定

    對(duì)大鼠一次性給予2 000 mg/kgmbDBP灌胃染毒。對(duì)照組以等體積玉米油進(jìn)行灌胃。分別設(shè)置避光組和日光組,避光組置于暗室中,調(diào)節(jié)暗室內(nèi)溫度與室外一致,日光組置于室外日光下,每組6 只大鼠。大鼠灌胃后分別于5、15、30、45 min和1、2、3、4、5、8、12、24、48 h眼眶取血0.8 mL,置于肝素化的離心管中,3 000×g離心15 min,取血清0.2 mL,添加0.6 mL甲醇,漩渦振蕩1 min,離心,上清液70 ℃下烘干,再用0.2 mL甲醇超聲溶解,離心,微孔濾膜過濾。取上清液10 μL按照1.3.1節(jié)方法測定DBP和MBP質(zhì)量濃度。

    1.3.3.2 MBP組織分布的測定

    按1.3.3.1節(jié)方法對(duì)大鼠灌胃進(jìn)行200 mg/kgmbMBP染毒。溶劑對(duì)照組以等體積玉米油進(jìn)行灌胃。日光組和避光組分別設(shè)置為5、15、30、45 min和1、2 h組,每組6 只大鼠。各組大鼠經(jīng)灌胃染毒后觀察并記錄體征變化。染毒結(jié)束后處死大鼠,分取肝臟、心臟、肺、腎臟和脾臟。臟器用生理鹽水沖洗表面血跡,濾紙吸干,稱質(zhì)量,磨碎。用20 mL甲醇超聲提取,取上清液1 mL,烘干,再用0.2 mL甲醇超聲提取,離心,微孔濾膜過濾。取上清液10 μL按照1.3.1節(jié)方法測定MBP質(zhì)量濃度。

    1.3.3.3 臟器損傷相關(guān)指標(biāo)的測定

    按1.3.3.2節(jié)方法對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃染毒,日光組和避光組分別設(shè)置為5、15、30、45 min和1、2 h組,每組6 只大鼠。對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶取血,以灌胃染毒前采血樣品為空白對(duì)照,離心10 min后吸出上層血漿,分別檢測血漿中MDA、GSH、ROS含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力。隨后取大鼠的部分肝臟和腎臟組織,先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液漂洗,然后稱取適量組織,加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.5),制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液,低溫離心后取上清液,參考文獻(xiàn)[13]測定ROS、GSH、MDA含量和SOD活力。

    1.3.3.4 組織病理學(xué)變化觀察

    按1.3.3.2節(jié)方法對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃染毒,取大鼠部分肝臟和一側(cè)的腎臟,用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定,脫水,透明,浸蠟,包埋,切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)變化。

    1.3.3.5 代謝樣品的采集

    取健康Wistar雄性大鼠12 只,隨機(jī)分為避光組和日光組,每組各6 只。分置于代謝籠中,給藥前禁食,實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食與飲水。以2 000 mg/kgmbDBP給大鼠灌胃染毒。分別收集避光組與日光組給藥前(空白)及給藥后0~4、4~8、8~12、12~24 h各時(shí)間段的尿樣和糞樣,記錄尿樣體積,置于-80 ℃保存待測。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和簡單相關(guān)性分析。用SIMCA-P 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DBP體外實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

    圖 1 MBP和DBP的液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of MBP and DBP

    圖1結(jié)果表明,DBP與血清混合后,在避光和日光下放置12 h均有MBP生成。但DBP與生理鹽水混合后,在避光和日光下放置12 h均無MBP的生成。在空白血清中沒有檢測到MBP和DBP。對(duì)MBP進(jìn)行分離,其電子轟擊質(zhì)譜圖如圖2所示。

    圖 2 MBP的電子轟擊質(zhì)譜圖Fig. 2 Electron impact mass spectrum of MBP

    2.2 DBP體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

    圖 3 DBP和MBP在大鼠體內(nèi)的質(zhì)量濃度變化Fig. 3 Changes in blood concentrations of DBP and MBP in rats

    對(duì)大鼠單獨(dú)灌胃1/10半數(shù)致死量的DBP后,DBP在大鼠體內(nèi)的質(zhì)量濃度變化見圖3。隨著時(shí)間的延長,DBP在大鼠血液中的質(zhì)量濃度不斷增加,在15 min左右避光組與日光組出現(xiàn)最大值,避光組為0.063 μg/mL,日光組為0.026 μg/mL;之后DBP質(zhì)量濃度均下降,到3 h左右避光組出現(xiàn)第2個(gè)峰值(0.017 μg/mL);同時(shí),根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果,從大鼠血液中還檢測到MBP。日光組大鼠在2 h左右全部死亡,其血液中的MBP質(zhì)量濃度高于避光組大鼠,在2 h時(shí)達(dá)到0.133 μg/mL。避光組大鼠血液中的MBP質(zhì)量濃度在1 h時(shí)出現(xiàn)最大值(0.054 μg/mL),之后趨于平穩(wěn),12 h后開始下降,24 h左右MBP質(zhì)量濃度降到0.001 μg/mL。

    2.2.2 MBP在大鼠體內(nèi)的分布

    大鼠灌胃DBP并在日光下照射2 h左右后出現(xiàn)急性中毒死亡,因此選擇將組織分布實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)計(jì)在0~2 h。DBP灌胃大鼠后主要以水解產(chǎn)生MBP的形式被吸收,因此以MBP作為研究對(duì)象。圖4結(jié)果表明,MBP灌胃大鼠后,避光條件與日光條件下,肝臟與腎臟中MBP質(zhì)量濃度均高于脾、肺和心臟。肝臟和腎臟在避光條件與日光條件下MBP分布表現(xiàn)出較大差異:在避光條件下,肝臟中MBP質(zhì)量濃度在45 min左右達(dá)到最大值(0.030 μg/mL),然后趨于平穩(wěn);腎臟中MBP質(zhì)量濃度在45 min左右達(dá)到最大值(0.254 μg/mL),之后趨于平穩(wěn);日光組肝臟與腎臟中MBP質(zhì)量濃度均在30 min左右達(dá)到最大值,肝臟中為0.048 μg/mL,腎臟中為0.043 μg/mL,之后MBP質(zhì)量濃度先下降后趨于平穩(wěn)。

    圖 4 MBP在大鼠體內(nèi)的分布Fig. 4 Distribution of MBP in rats

    2.2.3 臟器損傷相關(guān)指標(biāo)的測定

    表 1 MBP對(duì)大鼠肝臟中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影響Table 1 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat liver

    由表1、2可見,與空白對(duì)照組相比,避光組和日光組大鼠肝臟和腎臟中的ROS和MDA含量均升高,但灌胃30 min后日光組ROS含量明顯高于避光組。避光組和日光組大鼠肝臟和腎臟中GSH含量和SOD活力均降低,但灌胃15 min后日光組明顯低于避光組。

    表 2 MBP對(duì)大鼠腎臟中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影響Table 2 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat kidney

    2.2.4 大鼠肝臟組織切片觀察結(jié)果

    圖 5 大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果(×100)Fig. 5 Hematoxylin eosin staining of liver tissue(× 100)

    以200 mg/kgmbMBP灌胃后,在顯微鏡下觀察經(jīng)HE染色的大鼠肝臟組織細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞的損傷程度與光照時(shí)間存在明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,大鼠肝細(xì)胞在日光下2 h損傷最明顯。由圖5可看出,避光組灌胃MBP后5 min~2 h內(nèi),肝臟細(xì)胞均以中央靜脈為中心向外呈輻射狀排列,肝竇狀隙規(guī)則分布且細(xì)胞排列較為密實(shí),肝臟細(xì)胞損傷不明顯(圖5A~D)。日光組在灌胃MBP后30 min左右肝細(xì)胞局部伴隨輕微炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞核輕微固縮、局部胞漿空亮和局部細(xì)胞腫大等癥狀;隨著時(shí)間的延長,在1 h左右出現(xiàn)部分肝細(xì)胞水腫、細(xì)胞核固縮、破裂、水解癥狀;2 h左右肝細(xì)胞出現(xiàn)胞漿空亮、核消失、空泡樣變、脂肪滴增大融合、局部細(xì)胞嚴(yán)重壞死癥狀,說明肝細(xì)胞存在嚴(yán)重的氧化損傷(圖5E~H)。因此,在日光下MBP對(duì)大鼠肝臟的損傷程度高于避光條件。

    2.2.5 大鼠腎臟組織切片觀察結(jié)果

    丹皮酚對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 ………………………………… 吳 琪等(11):1500

    圖 6 大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果(×100)Fig. 6 Hematoxylin eosin staining of kidney tissue(× 100)

    顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織切片時(shí)發(fā)現(xiàn),與肝臟組織細(xì)胞相比,日光組大鼠腎臟組織細(xì)胞同樣發(fā)生了嚴(yán)重的組織損傷。灌胃MBP后,避光組大鼠(圖6A~D)出現(xiàn)了局部腎小管上皮細(xì)胞脫落、水樣變性等癥狀,但大鼠腎臟病理切片可見腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,系膜區(qū)無增生及沉積物,基底膜未見病變;隨著時(shí)間的延長,在2 h左右細(xì)胞腎小囊管腔變窄,出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤等癥狀。日光組大鼠(圖6E~H)灌胃MBP后1 h左右,出現(xiàn)了腎小體數(shù)目減少、腎小囊管腔變窄、淋巴細(xì)胞浸潤程度增大等癥狀,且損傷程度明顯高于避光組。結(jié)果表明日光能夠加重MBP對(duì)大鼠的腎臟損傷。

    2.2.6 DBP對(duì)大鼠排泄的影響

    大鼠灌胃DBP后,其主要以MBP的形式從尿液中排泄,且在尿液中沒有檢測到DBP,避光組0~4 h時(shí)尿液中MBP質(zhì)量濃度為0.427 μg/mL,4~8 h時(shí)為0.164 μg/mL,8~12 h時(shí)為0.455 μg/mL,12~24 h時(shí)為0.560 μg/mL。日光組0~4 h時(shí)尿液中MBP質(zhì)量濃度為0.132 μg/mL,4~8 h時(shí)為0.069 μg/mL,8~12 h時(shí)為0.291 μg/mL,12~24 h時(shí)為0.099 μg/mL。在0~24 h內(nèi),避光組大鼠尿液中MBP質(zhì)量濃度高于日光組(圖7A)。MBP和DBP在大鼠糞便中均被檢出(圖7B),且0~24 h內(nèi)避光組大鼠糞便中DBP和MBP質(zhì)量濃度均大于日光組。結(jié)果表明與日光組相比較,避光組大鼠體內(nèi)DBP更容易代謝排出體外。

    圖 7 大鼠排泄物中DBP、MBP的質(zhì)量濃度變化Fig. 7 Changes in urinary and fecal concentrations of DBP and MBP in rats

    3 討 論

    PAEs是全球最普遍的環(huán)境激素類污染物,其中DBP是我國最常使用的增塑劑之一,其可通過飲食攝入、呼吸道吸入和皮膚接觸等途徑對(duì)人體造成危害[16],可導(dǎo)致過敏性皮炎[17]以及生殖[18]、神經(jīng)、肝臟、腎臟和心臟等多種器官系統(tǒng)的損傷[17-23]。DBP導(dǎo)致肝細(xì)胞過氧化物酶增多、肝腫大的問題曾引起專家的重視,盡管該作用機(jī)制還不是十分明確,但是過氧化物酶增生和肝腫大通常發(fā)生在腫瘤形成之前[24]。近年來,有研究者通過測量尿液中DBP代謝物MBP的含量來間接反映DBP的接觸水平,基于樣品的易得到性和檢測方法的成熟性,認(rèn)為MBP是一種較合適的反映DBP暴露的生物標(biāo)志物[25]。

    本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用對(duì)比研究,結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法,對(duì)DBP的光敏毒性進(jìn)行研究,旨在找出DBP與光照的關(guān)聯(lián)性以及DBP在光照下毒性加劇的機(jī)理,從整體上闡明光照條件對(duì)大鼠的毒性作用及代謝調(diào)控機(jī)制。本研究采用高效液相色譜法檢測了在光照和避光條件下大鼠體外、體內(nèi)血清中DBP和MBP的質(zhì)量濃度。體外血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DBP在大鼠血清中轉(zhuǎn)化為MBP,與是否光照無關(guān)。因此,對(duì)于MBP在日光下是否會(huì)加劇對(duì)大鼠的毒性作用以及機(jī)理進(jìn)行研究。大鼠代謝實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)口灌胃DBP,其可迅速經(jīng)胃腸道吸收,經(jīng)小腸內(nèi)的非特異性酶代謝成穩(wěn)定的MBP,MBP和其他代謝產(chǎn)物與葡糖普酸結(jié)合后隨尿液排出[3]。大鼠經(jīng)口給予MBP后,在心臟、肝臟、脾、肺和腎臟中均能檢測到DBP,但肝臟和腎臟中MDP質(zhì)量濃度明顯高于其他臟器。

    Jurczuk等的研究表明,ROS超過一定濃度時(shí)會(huì)對(duì)其他生物分子產(chǎn)生不利影響[26],因此ROS的生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)是MBP造成肝臟和腎臟炎癥的主要方式。在灌胃MBP后,日光組大鼠的肝臟和腎臟組織GSH含量下降,這可能是由于MBP持續(xù)氧化產(chǎn)生應(yīng)激產(chǎn)物ROS所引起,同時(shí)GSH由于去除過氧化氫而被消耗。王立蓉等研究表明,細(xì)胞GSH含量降低到一定程度時(shí),細(xì)胞會(huì)受到不可逆損傷[27]。MDA在機(jī)體的新陳代謝過程中發(fā)揮重要作用,可以造成膜的流動(dòng)性與通透性的改變,導(dǎo)致異常生理生化反應(yīng)與免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。SOD可以保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基的損傷,能夠清除H2O2和·OH。當(dāng)MDA含量升高、SOD活力降低時(shí),可以引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),從而損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致某些細(xì)胞的死亡[28]。對(duì)染毒大鼠肝臟和腎臟中關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行測定,結(jié)果表明,ROS和MDA的含量與MBP染毒后光照時(shí)間呈正相關(guān),GSH含量和SOD活力與MBP染毒后光照時(shí)間呈負(fù)相關(guān);相同劑量MBP染毒后,與避光組相比,日光組大鼠血清中ROS和MDA含量較高,GSH含量和SOD活力較低,表明光照能加劇MBP對(duì)大鼠肝臟和腎臟組織的氧化損傷。

    肝臟和腎臟的HE染色病理切片觀察結(jié)果表明,染毒后隨著時(shí)間的延長,日光組大鼠肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、細(xì)胞水腫、空泡樣變、脂肪滴增大融合等癥狀,而避光組損傷程度相對(duì)較輕,結(jié)果表明日光能夠加劇MBP對(duì)大鼠肝臟和腎臟的組織損傷。大鼠排泄物的研究結(jié)果表明,光照條件較避光條件下MBP在大鼠體內(nèi)更不易排出體外。說明DBP是一種對(duì)雄性大鼠具有潛在危害的光敏毒性物質(zhì)。

    DBP可通過食物、飲水等多種途徑被人體攝入[29]。張鵬等研究表明,在膠陀螺中含有一定量的天然DBP[30],且近年來更有膠質(zhì)菌食用不當(dāng)而引發(fā)的急性中毒事件的報(bào)道[31]。李志軍等研究表明,不同的浸泡方式對(duì)黑木耳中DBP含量存在相關(guān)性[32],膠質(zhì)菌的急性中毒事件可能與膠質(zhì)菌中存在的DBP有關(guān)。本研究證明了DBP的光敏毒性和在體內(nèi)臟器中的分布規(guī)律,應(yīng)重視DBP對(duì)人體的潛在危害,并對(duì)DBP及含有天然DBP食品的健康危險(xiǎn)度做出更全面的評(píng)價(jià)。

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