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    As(Ⅲ)和As(Ⅴ)在香菇栽培基質(zhì)和子實體中的遷移規(guī)律

    2019-12-03 01:08:08唐慶強曹曉鋼夏林兵陳錦麗張鳳珍羅順玉王丹紅
    食品科學(xué) 2019年21期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)料香菇無機

    唐慶強,曹曉鋼,夏林兵,陳錦麗,張鳳珍,羅順玉,王丹紅*

    (1.三明海關(guān),福建 三明 365000;2.拉薩海關(guān),西藏 拉薩 850001;3.杭州海關(guān),浙江 杭州 310016;4.福州海關(guān),福建 福州 350001)

    香菇具有高蛋白、低脂肪以及食藥兼用的特點,被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦為健康食品,經(jīng)常食用能夠增強人體免疫力,此外香菇還具有防癌抗癌、降低血壓和膽固醇的作用[1]。為滿足消費需求并且降低成本,人工栽培香菇的原料已從單純椴木、木屑等轉(zhuǎn)向棉籽殼、玉米芯、秸桿、麥麩等農(nóng)林副產(chǎn)品,同時會加入一定量的石灰、石膏、過磷酸鈣等添加劑[2],甚至?xí)褂玫焦I(yè)廢料(如廢紙漿、煙草莖稈、酒糟等),這些原料由于來源不同,砷的含量也明顯不同。香菇的生長過程中會吸收和富集培養(yǎng)料中的重金屬[3],從而導(dǎo)致砷元素從培養(yǎng)料中向香菇子實體中遷移。砷的化合物形態(tài)主要包括有機砷和無機砷兩大類,無機砷包括亞砷酸鹽(As(III))和砷酸鹽(As(V)),有機砷包括一甲基砷酸鹽(monomethylated arsenic,MMA)、二甲基砷酸鹽(dimethylated arsenic,DMA)、砷甜菜堿(arsenobetaine,AsB)、砷膽堿和砷糖等[4-5]。不同形態(tài)的砷毒性差異明顯,砷糖、AsB等有機砷幾乎沒有毒性,而無機砷的毒性卻很高。國際癌癥研究中心已將無機砷及其化合物確認(rèn)為I級致癌物質(zhì),并將MMA和DMA列為潛在的致癌物質(zhì)[6]。近年來關(guān)于香菇中檢出砷等重金屬元素的報道[7-12]不斷增加,對于砷的形態(tài)分析[13-28]也不斷增多,但對香菇中無機砷的吸收富集規(guī)律方面報道較少,更缺乏對香菇培養(yǎng)料中無機砷臨界值的研究。

    本實驗在兩個生長年份中向香菇培養(yǎng)料中添加不同含量的As(III)和As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用高效液相色譜聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography coupled with inductivity coupled plasma mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)[29]檢測香菇及其培養(yǎng)料中5 種形態(tài)砷含量,并研究香菇對培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的吸收富集規(guī)律和臨界值,以期為香菇生產(chǎn)質(zhì)量安全控制提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    As(III)、As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液((999±5)μg/mL)美國Inorganic Ventures公司;MMA(C)、DMA(C2H7AsO2)、AsB(C5H11AsO2) 中國計量科學(xué)研究院;其他試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純;實驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》中規(guī)定的一級水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Altus A-10型HPLC儀、NexION 300D型ICP-MS儀美國PerkinElmer公司;3-18K高速離心機 德國Sigma公司;VERSASTAR型酸度計 美國Thermo Scientific公司;MS3D S25型漩渦振蕩儀 德國IKA公司。

    1.3 方法

    1.3.1 香菇栽培條件及實驗設(shè)計

    室內(nèi)溫度25~26 ℃,室外為自然氣溫,采用高棚層架袋栽培方式。

    初步實驗:第一年度進行初步實驗。將As(III)、As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至合適濃度后,在培養(yǎng)基拌料時加入香菇培養(yǎng)料中并充分拌勻。設(shè)置0、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/kg 7 個添加量范圍較大的實驗組,每組各投入24 kg培養(yǎng)料,分裝成12 個菌袋,7 組共84 個菌袋。

    精密實驗:在初步實驗獲得結(jié)果中,As(III)和As(V)的臨界值在0.35 mg/kg附近。在此基礎(chǔ)上,于第二年度在臨界值附近進行精密實驗,使用與初步實驗相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加方式,設(shè)置0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38 mg/kg 6 個As(III)和As(V)添加量實驗組,每組各投入24 kg培養(yǎng)料,分裝成12 個菌袋,6 組共72 個菌袋。

    1.3.2 5 種形態(tài)砷和總砷含量的測定

    如南宋.梁楷《李白行吟圖》畫唐朝大詩人李白,未畫任何背景,也不講究人體比例,只在表現(xiàn)人物精神上下功夫,寥寥幾筆,便意溢神足,使李白灑脫飄逸的形象躍然紙上。

    取部分接種栽培后第2、60、99天的培養(yǎng)料樣品、初步實驗和精密實驗第一潮出菇時的香菇子實體。采用GB 5009.11—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機砷的測定》[30]中方法測定香菇及培養(yǎng)料中總砷含量,用本課題組前期建立的HPLC-ICP-MS方法[29]測定香菇及培養(yǎng)料中5 種形態(tài)砷的含量,并觀察記錄不同添加量下各菌袋香菇的產(chǎn)量。稱取4.0 g香菇子實體或香菇培養(yǎng)料,加入38 mL純水,漩渦混勻后在70 ℃水浴中超聲提取40 min,加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%乙酸溶液沉淀蛋白,于冰箱中4 ℃靜置10 min,于4 ℃高速離心機中以18 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm水系濾膜后上機測定。色譜柱:Dionex IonPac AS19(250 mm×4.0 mm,3.5 μm)陰離子交換柱;Dionex IonPac AS19(50 mm×4.0 mm,3.5 μm)陰離子保護柱;流動相:A相為10 mmol/L乙酸鈉、3 mmol/L硝酸鉀、2 mmol/L磷酸二氫鈉、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鐵鈉,用氨水調(diào)節(jié)至pH 10.7;B相為無水乙醇;等度洗脫,A相體積分?jǐn)?shù)99%;流速:1.0 mL/min;進樣量:50 μL;ICP-MS功率:1 350 W;以高純氬氣為載氣;泵速20 r/min;駐留時間:1 000 ms;采集質(zhì)荷比m/z75;采集模式:標(biāo)準(zhǔn)模式。

    1.3.3 富集系數(shù)及減產(chǎn)率的計算

    以各添加量下香菇與培養(yǎng)料中As(III)或As(V)含量之比計算富集系數(shù)。以各添加量下香菇子實體的產(chǎn)量與未添加As(III)和As(V)時產(chǎn)量之比計算香菇的減產(chǎn)率。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    用Empower 3軟件處理檢測結(jié)果和數(shù)據(jù),用Excel軟件處理遷移規(guī)律數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 香菇及培養(yǎng)料中5 種形態(tài)砷的HPLC-ICP-MS圖譜分析

    圖 1 5 種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-ICP-MS圖Fig. 1 HPLC-ICP-MS chromatogram of five arsenic standards

    圖 2 培養(yǎng)料樣品(A)和鮮香菇樣品(B)的HPLC-ICP-MS圖Fig. 2 HPLC-ICP-MS chromatograms of As species in culture medium (A) and fresh Lentinus edodes fruit bodies (B)

    如圖1、2所示,AsB、DMA、As(III)、MMA和As(V) 5 種形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液得到良好分離,表明該方法能夠應(yīng)用于培養(yǎng)料和鮮香菇中。

    2.2 香菇對培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集規(guī)律

    2.2.1 初步實驗分析結(jié)果

    表 1 香菇對培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集規(guī)律(初步實驗)Table 1 Absorption and accumulation of As(III) and As(V) from culture medium in Lentinus edodes (in the first year)

    從表1可知,在沒有添加任何外源性砷的培養(yǎng)料和香菇子實體中檢出了As(III)和As(V),這表明培養(yǎng)料本身就含有部分的砷元素。隨著外源砷元素添加量的增加,培養(yǎng)料和香菇子實體中的As(III)和As(V)含量也隨之升高,但添加量達到5 mg/kg以上時,所有的菌袋均無法正常生長出香菇,這表明在香菇生長過程中,培養(yǎng)料中外源添加的砷元素會不斷向香菇子實體中遷移,而且隨著外源砷元素添加量的增加,其對香菇的生長產(chǎn)生了抑制作用。各添加量下As(III)和As(V)的富集系數(shù)范圍分別為0.36~0.84和0.82~7.53,香菇子實體中的As(III)含量均小于培養(yǎng)料中的含量,這表明香菇子實體對培養(yǎng)料中的砷元素雖有一定的吸附能力,但不是很強,這與徐麗紅等[31]的研究結(jié)果相似。

    在初步實驗設(shè)定的添加量下,As(III)和As(V)從培養(yǎng)料向香菇子實體中遷移的規(guī)律可以用以下方程表示,As(III):y=-0.365 2x2+0.761 1x+0.04,R2=0.975 9;As(V):y=-0.823 9x2+2.553 8x-0.069 9,R2=0.971 3(x、y分別為培養(yǎng)料和香菇子實體中的As(III)或As(V)含量)(圖3)。

    由于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中未對香菇中As(III)、As(V)或無機砷的限量做出規(guī)定,只有GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[32]規(guī)定食用菌中總砷含量不得高于0.5 mg/kg。從表1可知,當(dāng)As(III)和As(V)的添加量為0.3 mg/kg時,香菇子實體中的總砷含量為0.427 mg/kg,與GB 2762—2017限量要求十分接近,據(jù)此可以估算出培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的臨界添加量在0.35 mg/kg附近。

    圖 3 香菇對培養(yǎng)料中As(III)(A)和As(V)(B)的遷移規(guī)律(初步實驗)Fig. 3 Absorption and accumulation of As(III) (A) and As(V) (B) from culture medium in Lentinus edodes (in the first year)

    2.2.2 精密實驗分析結(jié)果

    表 2 香菇對培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集規(guī)律(精密實驗)Table 2 Absorption and accumulation of As(III) and As(V) from culture medium in Lentinus edodes (in the second year)

    根據(jù)初步實驗得出的結(jié)果,為獲得更準(zhǔn)確的遷移規(guī)律臨界值,于第二年度開展精密實驗。從表2可以看出,所有培養(yǎng)料均生長出了香菇子實體,各添加量下As(III)和As(V)的富集系數(shù)范圍分別為0.57~0.63和1.11~1.18,香菇中As(III)和As(V)含量之和占總砷的比例為92.41%~96.47%,表明香菇中的總砷絕大多數(shù)來源于添加的As(III)和As(V),可進一步研究培養(yǎng)料中As(III)和As(V)向香菇遷移的臨界值。由表2可知,當(dāng)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的添加量達0.33 mg/kg時,香菇子實體中總砷的含量為0.497 mg/kg,與限量要求的0.5 mg/kg極為接近,因此,可認(rèn)為0.33 mg/kg為培養(yǎng)料中添加As(III)和As(V)的臨界值。

    在精密實驗的添加量范圍下,As(III)和As(V)從培養(yǎng)料向香菇子實體中遷移的規(guī)律可以用以下方程表示,As(III):y=-1.138 9x2+0.921 6x-0.004,R2=0.973 4;As(V):y=-9.024 3x2-4.388 1x+0.838 7,R2=0.971 6(x、y分別為培養(yǎng)料和香菇子實體中As(III)或As(V)含量)(圖4)。

    圖 4 香菇對培養(yǎng)料中As(III)(A)和As(V)(B)的遷移規(guī)律(精密實驗)Fig. 4 Absorption and accumulation of As(III) (A) and As(V) (B) from culture medium in Lentinus edodes (in the second year)

    2.3 培養(yǎng)料中As(III)和As(V)含量隨時間變化情況及對香菇產(chǎn)量的影響

    從初步實驗中可以看出,培養(yǎng)料中外源添加的砷元素會不斷向香菇子實體中遷移,對香菇的生長產(chǎn)生抑制作用,從而降低香菇產(chǎn)量,甚至使其出現(xiàn)絕收的情況。從表1、2中可以看出,香菇子實體對培養(yǎng)料中As(III)和As(V)中的富集系數(shù)并不高,特別是對于As(III),香菇子實體中的含量均小于添加量和培養(yǎng)料中含量。為進一步研究培養(yǎng)料在不同生產(chǎn)階段As(III)和As(V)含量的變化,取初期(接種后2 d)、菌絲瘤結(jié)期(接種后60 d)、轉(zhuǎn)色期(接種后99 d)3 個階段的培養(yǎng)料,分析其中As(III)、As(V)含量的變化。

    表 3 不同時期培養(yǎng)料中As(III)和As(V)含量及香菇減產(chǎn)率Table 3 Contents of As(III) and As(V) in culture medium at different cultivation times and reduction in mushroom yield

    從表3中可以看出,隨著栽培時間的延長,各添加量培養(yǎng)料中As(III)的含量持續(xù)下降,在第60天的菌絲瘤結(jié)期時已經(jīng)下降到第2天時的一半以下,到第99天時更是下降到了2%左右。結(jié)合培養(yǎng)料中As(III)向香菇子實體中富集系數(shù)不高的情況來看,減少的As(III)并沒有完全轉(zhuǎn)移到香菇子實體中去,可能是轉(zhuǎn)化成了其他形態(tài)的砷,或是受香菇生長環(huán)境的影響而發(fā)生了降解,各添加量培養(yǎng)料中As(V)的含量隨著時間的延長呈現(xiàn)整體增長的趨勢,結(jié)合香菇子實體對培養(yǎng)料中As(V)的富集情況來看,培養(yǎng)料中的As(V)有向香菇中遷移的趨勢,但遷移程度不高;因此,培養(yǎng)料中增加的As(V)可能來自于轉(zhuǎn)化后的As(III)。

    栽培2~60 d各添加量下As(III)和As(V)總量整體下降,但到90 d時整體穩(wěn)定并略有上升,這表明在2~60 d時As(III)和As(V)整體上是向菌絲中遷移的,而到60 d后,菌絲富集達到飽和,As(III)繼續(xù)向As(V)轉(zhuǎn)換,但二者總量保持穩(wěn)定。

    添加As(III)和As(V)后的菌袋與未添加的菌袋相比均出現(xiàn)了不同程度的減產(chǎn),減產(chǎn)率隨著添加量的增加而增加。從生長情況來看,正常的香菇菌袋中的菌絲于40 d左右布滿全袋,60 d菌絲開始出現(xiàn)瘤結(jié)并部分開始轉(zhuǎn)色,到90 d左右轉(zhuǎn)色完成,120 d左右菌絲瘤結(jié)完畢進入出菇階段;而添加了As(III)和As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液的菌袋在各個階段均出現(xiàn)了不同程度的生長緩慢和生長抑制現(xiàn)象,走絲、轉(zhuǎn)色、瘤結(jié)的時間比正常生長的菌袋平均推遲3~10 d;而且當(dāng)添加的As(III)和As(V)含量大于5 mg/kg時,香菇的生長被完全抑制,出現(xiàn)部分菌絲直接枯死、轉(zhuǎn)色不完全和無法瘤結(jié)等情況,菌袋已無法生長出香菇。說明培養(yǎng)料中添加As(III)和As(V)會對菌絲的生長起到抑制作用,添加量越高影響程度越大,這可能與砷元素?fù)p傷了菌絲中的某些結(jié)構(gòu)、破壞了營養(yǎng)物質(zhì)的運輸,從而抑制了菌絲對生長必需元素的吸收有關(guān)。

    2.4 香菇中有機砷含量與As(III)和As(V)添加量的關(guān)系

    表 4 As(III)和As(V)添加量對香菇中有機砷含量的影響Table 4 Contents of organic arsenic species in Lentinus edodes cultured with different amounts of As(III) and As(V) added

    從表4可知,除MMA一直未檢出外,香菇子實體中的DMA和AsB兩種有機砷含量隨著培養(yǎng)料中添加的As(III)和As(V)總量的增長而逐漸升高,均高于未添加As(III)和As(V)培養(yǎng)料中生長出的香菇。由于本實驗僅在培養(yǎng)料中添加了As(III)和As(V)這兩種無機砷標(biāo)準(zhǔn)溶液,因此可認(rèn)為香菇子實體中增加的DMA和AsB主要來源于添加的無機砷標(biāo)準(zhǔn)溶液,這可能是因為香菇在生長過程中將部分As(III)和As(V)轉(zhuǎn)化為有機砷。

    3 結(jié) 論

    通過向香菇培養(yǎng)料中添加不同含量的As(III)和As(V)標(biāo)準(zhǔn)溶液,研究香菇子實體對培養(yǎng)料中高毒無機砷的遷移規(guī)律。結(jié)果表明,香菇子實體對添加0.3~10 mg/kg As(III)和As(V)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)的富集系數(shù)范圍分別為0.36~0.84和0.82~7.53;添加0.33~0.38 mg/kg As(III)和As(V)培養(yǎng)料中As(III)和As(V)遷移規(guī)律方程分別為y=-1.138 9x2+0.921 6x-0.004和y=-9.024 3x2-4.388 1x+0.838 7(x、y分別為培養(yǎng)料和香菇子實體中的As(III)或As(V)含量/(mg/kg))。根據(jù)GB 2762—2017對香菇子實體中總砷限量不超過0.5 mg/kg的要求,培養(yǎng)料中添加As(III)和As(V)的臨界值為0.33 mg/kg。培養(yǎng)料中As(III)和As(V)含量的增加會導(dǎo)致香菇子實體的減產(chǎn)甚至絕收。培養(yǎng)料中的As(III)含量隨著栽培時間的延長逐漸減少,As(V)含量略有增加,而As(III)和As(V)的總量則保持相對穩(wěn)定。香菇子實體中的AsB、DMA等有機砷含量隨著As(III)和As(V)添加量的增加而升高,這可能和As(III)在香菇生長時轉(zhuǎn)化為As(V)或有機砷有關(guān)。

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