不同部位牦牛肉肌纖維特性與肉品質(zhì)差異

楊玉瑩，張一敏，毛衍偉，梁榮蓉，董鵬程，楊嘯吟，朱立賢,*，羅 欣,2,*，張文華，曹 暉

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中衛(wèi)試驗站，寧夏 中衛(wèi) 755000；4.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系寶雞試驗站，陜西 寶雞 721000）

我國牦牛資源豐富，主要分布于青海、甘肅、西藏、四川、新疆和云南省，占世界牦牛總量的95%[1]。牦牛肉富含蛋白質(zhì)，脂肪含量低，含有人體所需的多種脂肪酸，能夠滿足人們對高品質(zhì)牛肉的需求[2-3]。牛肉富含多種氨基酸和礦物質(zhì)元素，具有消化吸收率高等特點，深受人們喜愛[4]。近幾年，隨著居民消費水平的提高，對牛肉的消費量也越來越大，人們更加重視牛肉和牛肉制品的品質(zhì)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維的形態(tài)特征（如肌纖維總數(shù)和肌纖維橫截面積）與肌纖維的收縮及代謝特性是影響肉品質(zhì)的主要因素[7-8]。

骨骼肌主要由不同類型的肌纖維組成，不同類型的肌纖維具有不同形態(tài)特征和收縮及代謝特性。根據(jù)氧化代謝酶[9]和肌球蛋白三磷酸腺苷酶（myosn adenosine triphosphatase，mATPase）的染色情況[10]分類，可以將肌纖維類型分為I型（慢速氧化型）、IIA型（快速氧化型）和IIB型（快速酵解型）。Lefaucheur等[11]利用免疫組化的方法將豬骨骼肌纖維類劃分為I、IIA、IIB和IIX型，分別對應(yīng)于慢速氧化型（I）、快速氧化型（IIA）、快速酵解型（IIB）和中間型肌纖維（IIX），其收縮速率為I＜IIA＜IIX＜IIB[12-13]。

影響骨骼肌中肌纖維類型組成、直徑、面積比和數(shù)目比的因素很多，如性別、年齡、品種、激素和身體活動等，其中部位是一個重要因素。關(guān)于肌纖維特性和肉品質(zhì)特性之間關(guān)系的研究在豬肉中較多，在反芻動物（如牛、羊）中的研究較少[14]。郎玉苗等[15]研究了中國西門塔爾牛背最長肌、腰大肌和半腱肌肌纖維特性和肉品質(zhì)特性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同部位肌肉肌纖維特性可以影響牛肉品質(zhì)。關(guān)于韓牛不同部位肌肉肌纖維特性和肉品質(zhì)間的關(guān)系也有報道[16]。解祥學(xué)等[17]研究對比了利木贊牛、皮埃蒙特牛、中國西門塔爾牛、魯西牛、秦川牛和晉南牛的肌纖維特性，發(fā)現(xiàn)不同牛種間也存在顯著差異。王莉[18]研究了牦牛不同部位肌纖維特性對牛肉嫩度的影響，發(fā)現(xiàn)I型肌纖維比例越高，宰后嫩度改善效果越好，但鮮見牦牛肉背最長肌、腰大肌和半膜肌這3 個部位肌肉肌纖維特性和肉品質(zhì)之間關(guān)系的相關(guān)報道。

因此本研究選取牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌為研究對象，采用酶組織化學(xué)染色法和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法測定牦牛的肌纖維特性，包括肌纖維類型、直徑、面積比和數(shù)目比，并測定了這3 個部位肌肉的剪切力、肌節(jié)長度、肉色、蒸煮損失率和pH值，以期從肌纖維角度解釋不同部位肌肉的品質(zhì)差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取青海省海北州海晏縣牦牛2～3 歲健康放牧公牛10 頭，胴體質(zhì)量（98.15±8.45）kg。

包埋劑 日本Sakura公司；Tris-base 美國Sigma公司；ATP鈉鹽 北京Solarbio公司；硝酸鈷、硫化銨、二甲苯、蔗糖 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR?Premix ExTaq?（Tli RNaseH Plus）、RNAiso、RNase-free水 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CRYOSTAR NX50型冰凍切片機 美國Thermo公司；819型切片刀 德國徠卡儀器有限公司；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng) 日本尼康公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；SP62型便攜式色度儀 美國愛色麗公司；實時熒光定量PCR儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；核酸測定儀德國Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

牦牛宰后45 min分別取背最長肌、腰大肌和半膜肌1 cm×1 cm×2 cm樣品后用錫紙包裝后放置于液氮中保存，用于mATPase染色。取1 g肉柱于凍存管中，放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入－80 ℃超低溫冰箱保存，用于提取RNA。在宰后48 h進行分割，取背最長肌、腰大肌和半膜肌放入泡沫箱（加冰袋）運回實驗室（到達實驗室為成熟第3天），用于品質(zhì)指標的測定。

1.3.2 pH值的測定

用SenvonGo便攜式pH計分別測定背最長肌、腰大肌和半膜肌的pH值，將pH計探頭插入3 cm左右，當pH值穩(wěn)定后讀取數(shù)值，3 次重復(fù)取平均值[19]。

1.3.3 肉色的測定

取牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌上成熟3 d的肉樣，在空氣中發(fā)色30 min，用便攜式色度儀測定L*、a*、b*值，測定6～8 個位點取平均值[19]。

1.3.4 剪切力的測定

參考Hou Xu等[20]的測定方法，分別從成熟3 d的背最長肌、腰大肌和半膜肌上取厚度約為2.5 cm的牛排樣品，真空包裝后80 ℃水浴加熱至肉塊中心溫度70 ℃，之后0～4 ℃冷卻過夜。用空心取樣器（直徑為1.27 cm）沿肌纖維方向取肉柱，注意避開筋腱和結(jié)締組織，用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀的HDP/BSW探頭測定肉柱的剪切力。

1.3.5 肌節(jié)長度的測定

參考Cross[21]與Li Ke[22]等的方法，并稍作修改。選取2 g牦牛肉樣品，加入18 mL的0.25 mol/L蔗糖溶液（提前放于4 ℃預(yù)冷），低速勻漿（轉(zhuǎn)速約為6 000 r/min）1 min，用懸浮液制作載玻片，在光學(xué)顯微鏡下放大1 000 倍觀察并拍照。每個樣品取5 個平行，選取30 張照片，用Image-Pro Plus Version 6.0軟件測量肌節(jié)長度，測量結(jié)果的平均值即為該樣品的肌節(jié)長度。

1.3.6 蒸煮損失率的測定

分別取牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌的肉樣稱其質(zhì)量（m1），包裝后將溫度計插入肉的中心部位，80 ℃水浴加熱肉塊至中心溫度70 ℃，在室溫冷卻20 min后放于0～4 ℃過夜，取出肉塊，表面汁液用濾紙吸干，稱質(zhì)量（m2）[19]。蒸煮損失率按下式計算。

1.3.7 組織化學(xué)分析測定肌纖維指標

參考Brooke等[10]的方法，并稍加修改。將牦牛肉用冷凍切片機切成10 μm的新鮮切片，進行堿孵育mATPase染色。5 g Tris-base加入0.449 g CaCl2，加入蒸餾水，定容至250 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至10.4。再配制pH 9.4工作液，每10 mL加15 mg的ATP鈉鹽，充分溶解，調(diào)節(jié)pH值至9.4。將未經(jīng)固定的新鮮組織冰凍切片自然晾干，在pH 10.4的工作液中孵育5 min，傾去孵育液，在pH 9.4的工作液中孵育30 min，傾去孵育液，用CaCl2溶液清洗3 次，每次2 min。再用質(zhì)量分數(shù)1%硫化銨溶液處理30 s，流水沖洗5 min。將切片依次浸入無水乙醇3 次，每次5 min；后浸入二甲苯2 次，每次5 min，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.3.8 基因相對表達量測定

按照動物組織RNA提取試劑盒說明書提取背最長肌、腰大肌和半膜肌的RNA。對提取的牦?？俁NA用微量核酸蛋白測定儀分析測定OD260nm/OD280nm及其質(zhì)量濃度，對符合質(zhì)量要求的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)試劑盒的說明步驟去除總RNA樣品中殘存的基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保溫，之后將cDNA放入－20 ℃冰箱保存，用于實時熒光定量PCR測定。本實驗選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，MYH7、MYH2、MYH1、MYH4為目的基因，分別編碼肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）-I、MyHC-IIa、MyHC-IIb和MyHC-IIx，全部實時熒光定量PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計合成，引物序列如表1所示。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μL，按照試劑盒要求進行PCR反應(yīng)液的配制，每個反應(yīng)管3 個平行。反應(yīng)程序參照試劑盒說明書。采用操作相對簡便的2－?Ct法作為相對基因表達量的分析方法[23]，標準曲線通常被用來確定實時熒光定量PCR反應(yīng)的擴增效率，目的基因相對于內(nèi)參基因的表達為ΔCt，ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（GAPDH）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Bio-Rad CFX Manager軟件對熒光定量基因表達數(shù)據(jù)進行相對定量處理以及分析基因的相對表達量。采用Image-Pro Plus version 6.0軟件測定肌節(jié)長度和肌纖維數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，品質(zhì)指標以肌肉部位為固定效應(yīng)進行單因素方差分析；肌纖維直徑、面積比、數(shù)目比和基因相對表達量以肌纖維類型和肌肉部位為固定效應(yīng)進行兩因素的方差分析。數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。用SPSS 18.0軟件的皮爾森相關(guān)性分析來描述肌纖維特性和肉品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性。采用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同肌肉部位品質(zhì)指標分析

如表2所示，牦牛不同肌肉部位間的品質(zhì)指標存在明顯差異。3 個肌肉部位的pH值在5.4～5.7范圍內(nèi)，腰大肌的pH值顯著高于背最長肌和半膜肌（P＜0.05）。肉色是影響消費者購買的主要因素，3 個肌肉部位的L*值沒有顯著性差異（P＞0.05），腰大肌的a*值顯著高于背最長?。≒＜0.05），這與前人研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)腰大肌含有較高的肌紅蛋白含量，且線粒體含量豐富[16]。腰大肌剪切力顯著低于背最長肌和半膜肌（P＜0.05），剪切力背最長?。景肽ぜ。狙蠹?，同時腰大肌的肌節(jié)長度為2.1 μm，顯著高于另兩個部位（P＜0.05），由此說明腰大肌嫩度優(yōu)于背最長肌和半膜肌。蒸煮損失率是反映牛肉保水性的一個重要指標，研究表明極限pH值對牛肉保水性具有一定影響[24]，pH值下降造成的乳酸積累會破壞蛋白質(zhì)與水的結(jié)合并造成肌絲表面靜電荷的減少，從而不利于水分的保持。本研究發(fā)現(xiàn)半膜肌的pH值較低，同時蒸煮損失（27.2%）顯著高于背最長肌和半膜?。≒＜0.05），由此說明半膜肌的保水性較差，而背最長肌保水性較好?？傮w來看，綜合剪切力、肉色、蒸煮損失率、肌節(jié)長度和pH值的結(jié)果，腰大肌肉色較紅、嫩度較好，更能滿足人們對高品質(zhì)牛肉的需求。

表 2 牦牛肉背最長肌、腰大肌和半膜肌品質(zhì)指標分析Table 2 Meat quality traits of yak Longissimus lumborum, Psoas major and Semimembranosus

2.2 酶組織化學(xué)染色法分析肌纖維特性

圖 1 牦牛肉背最長肌、半膜肌和腰大肌ATPase組織化學(xué)染色Fig. 1 Histological sections of three muscles stained for myosin ATPase activity

圖 2 牦牛肉肌纖維特性分析Fig. 2 Myofiber characteristics of yak meat

圖1和圖2所示為牦牛3 個肌肉部位的肌纖維特性。如圖2A所示，腰大肌肌纖維直徑（23.9 μm）顯著低于另兩個部位（P＜0.05），I型肌纖維直徑和肌纖維面積比均顯著低于II型肌纖維（P＜0.05）（圖2B、C）。有研究指出不同肌肉中的肌纖維組成不一，對肉的嫩度會產(chǎn)生一定影響。對于同一品種、同一部位肌肉而言，肌纖維直徑越粗，橫截面積越大，肉塊測得的剪切力就越大，肉的嫩度就越差[25]。肌肉部位和肌纖維類型的交互作用顯著影響肌纖維數(shù)目比（P＜0.05），腰大肌I型肌纖維數(shù)目比為50.8%，顯著高于另兩個部位（P＜0.05），其中背最長肌最低，為27.2%，這與Hwang等[26]的研究結(jié)果一致，其報道指出韓牛腰大肌具有較高比例的I型肌纖維數(shù)目比，較低比例的IIB型肌纖維數(shù)目比。

有研究指出基于mATPase和代謝酶分類可能存在不一致性，因為所使用組織化學(xué)反應(yīng)強度不同，并且這種方法難以從混合肌纖維IIA/X中分出單一肌纖維類型，在堿性mATPase染色結(jié)果中強烈反應(yīng)的可能是IIA/X混雜纖維[27]，故本研究只根據(jù)肌纖維的收縮特性分為II型肌纖維和I型肌纖維，然后測量肌纖維類型的數(shù)目比、面積比以及肌纖維直徑。本研究結(jié)果說明不同部位牦牛肉肌纖維的特性差異顯著。

2.3 實時熒光定量PCR法分析肌纖維特性

圖3結(jié)果顯示背最長肌、腰大肌和半膜肌3 個肌肉部位均呈現(xiàn)肌球蛋白重鏈的3 種亞型，即MyHc-I、MyHc-IIa和MyHc-IIx。不同肌肉部位中這幾種亞型的基因相對表達量不同。圖3A為牦牛這3 個部位的MyHcmRNA相對表達量，可以看出腰大肌和半膜肌MYH7mRNA相對表達量均顯著高于MYH2和MYH1（P＜0.05），而背最長肌這幾種基因的mRNA相對表達量沒有差異，其中腰大肌MYH7mRNA的相對表達量顯著高于背最長肌和半膜肌（P＜0.05）。圖3B為mRNA相對表達量所占比例，可以看出腰大肌MYH7mRNA相對表達量所占比例較高，其次為半膜肌和背最長肌。這與前面肌纖維染色結(jié)果相一致，由此可以得出腰大肌的I型肌纖維較II型肌纖維數(shù)目較多。通過實時熒光定量PCR技術(shù)來分析牦牛這3 個肌肉部位的肌球蛋白重鏈（MyHc）mRNA的相對表達量，驗證了牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌中II型肌纖維和I型肌纖維的比例。此外本研究表明MYH4mRNA在牦牛這3 個肌肉部位中未表達，這與前人研究結(jié)果相似，有研究指出在大多數(shù)牛種中，并沒有在其骨骼肌中發(fā)現(xiàn)MYH4mRNA的表達，僅在個別牛種眼肌中發(fā)現(xiàn)過其表達[28]。

圖 3 背最長肌、腰大肌和半膜肌肌纖維相關(guān)基因mRNA表達量（A）和不同基因mRNA相對表達量所占比例（B）Fig. 3 Relative mRNA expression levels of myofiber-related genes (A)and their distribution (B) in Longissimus thoracis, Psoas major and Semitendinosus

2.4 肌纖維特性和品質(zhì)指標相關(guān)性分析

表3顯示牦牛肉肌纖維特性和肉品質(zhì)指標之間的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明II型肌纖維數(shù)目比與剪切力呈極顯著正相關(guān)，而II型肌纖維和I型肌纖維直徑均與剪切力呈顯著正相關(guān)，與肌節(jié)長度呈顯著負相關(guān)。I型肌纖維數(shù)目比和面積比與肌節(jié)長度呈顯著正相關(guān)，相反地，II型肌纖維數(shù)目比和面積比與肌節(jié)長度呈顯著負相關(guān)。

肌纖維是骨骼肌的基本構(gòu)成單位，肌纖維的生物學(xué)特性與肉品質(zhì)如嫩度、pH值和肉色直接相關(guān)，肌纖維的類型、數(shù)目和直徑對肉品質(zhì)有重要影響[14]，其中嫩度是決定肉品質(zhì)的一個重要因素，研究指出不同肌纖維類型的組成及直徑對肉的嫩度具有一定的影響，一方面肌纖維類型、直徑、橫截面積等方面與肉的嫩度間存在相關(guān)性，肌纖維的直徑越小，肉嫩度也越好；另一方面，不同的肌纖維類型造成了其結(jié)締組織和肌內(nèi)脂肪的含量不同，從而也影響了肉的嫩度，但目前關(guān)于牛肉嫩度和肌纖維特性的關(guān)系仍存在爭議[29-30]。王莉[18]報道牦牛I型肌纖維比例越高，嫩度越好，與本研究結(jié)果一致，因此可以通過增加I型肌纖維的比例來改善肉的嫩度。

表 3 牦牛肉肌纖維特性與3 種部位肌肉品質(zhì)相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients between myofiber characteristics and meat quality traits for three yak muscles

I型和IIA型肌纖維均包含較多的肌紅蛋白含量[8]，從而導(dǎo)致肉色較紅，但在本研究中沒有將II型肌纖維明確分類為IIA和IIB型，故肌纖維特性和a*值之間沒有相關(guān)性，而II型肌纖維面積比與L*值呈顯著正相關(guān)（r＝0.516；P＜0.05）。肌肉中肌纖維類型的組成對宰后蛋白質(zhì)的降解、糖酵解速率以及pH值下降速率有一定的影響，快收縮IIB型肌纖維含有高的糖酵解纖維，導(dǎo)致其在宰后早期代謝速率較快。如果快速收縮酵解型肌纖維在肌肉中占主導(dǎo)，則會誘導(dǎo)快速糖酵解，造成肌肉中pH值的快速降低，從而導(dǎo)致汁液滲出，這在豬肉研究中比較常見，這是由于豬肉較牛肉含有更高比例的II型肌纖維；然而在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)pH值和肌纖維特性之間存在顯著的相關(guān)性。II型肌纖維數(shù)目比與蒸煮損失率呈顯著負相關(guān)（r＝－0.554，P＜0.05）。以上結(jié)果表明，牦牛3 個部位的肌纖維特性和肉品質(zhì)是密切相關(guān)的。

3 結(jié) 論

牦牛背最長肌、腰大肌和半膜肌品質(zhì)指標差異明顯，其中腰大肌的pH值和a*值較高，嫩度優(yōu)于背最長肌和半膜肌，而背最長肌的保水性較好，腰大肌居中，總體來說腰大肌的肉品質(zhì)較好。3 個肌肉部位的肌纖維特性差異顯著（P＜0.05），其中背最長肌和半膜肌具有較高比例的II型肌纖維，而腰大肌具有較高比例的I型肌纖維和較小的肌纖維直徑。I型肌纖維的數(shù)目比和面積比與肉品質(zhì)性狀存在一定的相關(guān)性。肌纖維數(shù)目比與剪切力呈負相關(guān)，與肌節(jié)長度、蒸煮損失呈正相關(guān)，而肌纖維面積比與L*值呈顯著負相關(guān)。II型肌纖維和I型肌纖維直徑均和肉的嫩度密切相關(guān)（與剪切力呈正相關(guān)和肌節(jié)長度呈負相關(guān)）。本研究結(jié)果表明牦牛的肌纖維特性可以作為衡量牦牛不同肌肉部位品質(zhì)的重要指標，可以通過提高肌肉中I型肌纖維的所占比例，來改善牦牛肉的品質(zhì)。