亞砷酸鈉致成年SD大鼠皮膚損傷的研究

李文波 郎 曼 迪力娜爾·買買提 袁翠杰 陳佩弟 謝惠芳

慢性砷中毒是一個重大的公共衛(wèi)生問題，近70個國家，超過2億人長期飲用砷超過10μg/L的飲用水[1, 2]。而飲用水中的砷主要以無機砷的形式存在，1979年，無機砷被國際癌癥研究中心確認為人類皮膚及肺的致癌物[3, 4]。皮膚損傷是慢性砷中毒最突出的臨床癥狀，輕度損傷表現為接觸性皮炎，重度損傷可能出現色素沉著、角化過度、細胞癌變等[5]。砷致皮膚損傷的機制至今仍不明確。本研究通過14周亞砷酸鈉(NaAsO2)慢性染毒SD大鼠的體內實驗，記錄大鼠體質量、臟器質量，鏡下觀察皮膚組織病理改變，研究砷對SD大鼠皮膚組織的毒性損傷，為進一步探討砷致SD大鼠皮膚損傷的機制提供理論基礎。

材料與方法

1.實驗動物：健康成年無特定病原級(specific pathogen free，SPF)SD大鼠50只，雌雄各半，體質量206±11g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心[生產許可：SCXK(新)2016-0003；使用許可：SYXK(新)2016-0002]。實驗期間大鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，室內動物照明燈，照度15～20lx，12h晝夜交替。

2.主要試劑：NaAsO2(德國MERCK公司)，N-乙酰半胱氨酸(上海源葉生物科技有限公司)，水合氯醛(上海山浦化工有限公司)，4%多聚甲醛(BIOSHARP)，乙醇(成都科龍化工試劑廠)。

3.動物分組及染毒：按性別體質量隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和高劑量干預組，每組10只，雌雄各半，以預實驗測得NaAsO2的LD50的0、1/100、1/20、1/4確定染毒劑量為0、0.46、2.3、11.5mg/kg，自由飲水進行染毒，共14周。第10周，高劑量干預組飲用高劑量砷溶液的同時，按照20mg/kg體重的劑量連續(xù)4周每天灌胃N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)。實驗期間觀察大鼠精神及活動狀況，皮毛光澤度，記錄飲水量和進食量，每周測定體質量，染毒結束后，10%水合氯醛處死大鼠。

4.取樣：處死前禁食，正常飲用超純水或含砷水，麻醉后背部脫毛，取全厚皮膚，置于4%多聚甲醛及2.5%戊二醛中，4℃冰箱保存。

5.樣本處理：HE染色，光鏡下觀察各組大鼠皮膚組織形態(tài)；醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，電鏡下觀察各組大鼠皮膚組織超微結構。

6.臟器系數計算：稱量臟器重量，計算臟器系數，臟器系數=臟器重量(g)/體質量(g)×100%。

結 果

1.SD大鼠一般狀況：實驗期間，對照組大鼠生長發(fā)育良好，活動正常，飲水量、飲食量正常，皮毛光滑，無異常表現；與對照組比較，染毒4周時，各劑量組大鼠頸背部出現不同程度毛色發(fā)紅；隨著染毒時間延長，各劑量組大鼠活動減少，應激性差，頸、背部出現不同程度的皮毛脫落，各劑量組大鼠出現不同程度的氣喘癥狀，其中以中、高及高劑量干預組最為明顯；高劑量干預組大鼠灌胃NAC后，氣喘癥狀有所緩解，飲水量、飲食量、活動量增加；染毒第8周，高劑量組1只大鼠出現血尿。

2.SD大鼠體質量變化情況：前4周，大鼠體質量增長最快；第8周，除對照組外，其他劑量組大鼠體質量增長緩慢，雄性高劑量組體質量下降，與雄性對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；第12周，高劑量組大鼠體質量低于其他劑量組大鼠，與低劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。第14周，同雄性低劑量組比較，雄性中、高劑量組體質量明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。染毒期間，各組雌性大鼠體質量存在一定差異，但差異無統計學意義(P>0.05，表1，表2)。

表1 NaAsO2對雄性SD大鼠體質量的影響

表2 NaAsO2對雌性SD大鼠體質量的影響

3.臟器系數變化：與對照組比較，中劑量組大鼠心臟及肺部臟器系數增大，差異有統計學意義(P<0.05)。其他臟器系數間比較，差異無統計學意義(P>0.05，表3)。

表3 NaAsO2對各組SD大鼠臟器的影響

4.SD大鼠皮膚組織病理學變化：(1)光鏡下變化：對照組大鼠皮膚組織形態(tài)正常，各層結構清晰，細胞排列正常；低劑量組角質層、顆粒層增厚，皮下血管慢性炎細胞浸潤；中劑量組表皮層較薄，顆粒層增厚，炎細胞浸潤；高劑量組表皮層明顯變薄萎縮，棘細胞增多，排列紊亂，皮下部分結締組織纖維黏液樣變化，黑色素細胞增多；高劑量干預組表皮層萎縮，炎細胞浸潤(圖1)。(2)透射電鏡下變化：對照組大鼠皮膚組織層次清晰，結構完整，連接緊密，未見異常；低劑量組角質層、顆粒層增厚，棘細胞核輕微異常；中劑量組角質層增厚，細胞間隙增寬，連接松散，棘細胞異形增多，細胞質溶解，細胞核固縮；高劑量組異形核細胞增多，異染色質增多、黑素小體增多，細胞器減少，微絲減少；高劑量干預組細胞核腫脹、畸形，細胞器溶解，透明度增加，橋粒減少(圖2)。

圖1 光鏡下各組SD大鼠皮膚病理學改變情況(HE，×200)

圖2 電鏡下各組SD大鼠皮膚病理學改變情況(醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色)

討 論

砷作為環(huán)境致癌物，通過多種途徑造成人體內蓄積并引起多臟器損傷及功能障礙，嚴重時可引發(fā)癌前病變[6, 7]。然而，也有相關研究證實低劑量砷對機體生長發(fā)育有促進作用，本實驗中，低劑量組大鼠生長發(fā)育良好，體質量呈上升趨勢，飲水量飲食量不斷增加，尤其是雄性大鼠，第8周后，體質量逐漸超過其他劑量組，第12周，體質量明顯高于雄性高劑量組，第14周，明顯高于雄性中、高劑量組，差異均有統計學意義。長期飲用高劑量砷溶液對機體的損傷作用也得到證實[8]。本實驗中，隨著染毒劑量的增加，中、高和高劑量干預組大鼠飲水量和飲食量逐漸減少。從第8周開始，雄性高劑量組大鼠體質量明顯降低。此外各染砷劑量組大鼠均出現不同程度的健康狀況惡化，高劑量組1只大鼠出現血尿，提示長期飲用高劑量砷水可能對腎臟造成損傷；染毒期間，各染砷劑量組均出現氣喘等癥狀，以中劑量組最為明顯，分析臟器系數可知，中劑量組大鼠心臟、肺部臟器系數明顯高于對照組，證實了長期飲用含砷水會對機體肺部造成損傷，與徐夢偉等[9]的研究結果一致。高劑量干預組在給予NAC后，健康狀況好轉，呼吸系統癥狀有所改善，與黃佳等[10]的報道一致，不同染砷劑量組間，臟器系數除心臟、肺部外，其他臟器系數存在輕微差異，但差異無統計學意義。

皮膚作為砷毒作用的主要器官，是最早出現病變的部位[11, 12]。本實驗中，除部分大鼠頸背部毛發(fā)發(fā)紅、脫落外，沒有出現色素沉著、角化異常等肉眼可見的皮膚病理改變。流行病學調查發(fā)現，砷暴露達到一定積累劑量時，皮膚損傷癥狀可呈劑量-反應關系，低于積累計量時，其皮膚損害作用并不明顯[13]。建立砷致皮膚損傷的動物實驗模型仍存在一定困難，染毒的劑量設計、實驗動物的選擇、染毒方式、染毒周期及造模終點的確定尚需開展大量研究。因此目前大多通過皮膚組織病理切片來觀察砷對皮膚組織的損傷，本實驗中，與對照組比較，光鏡下各組出現不同程度慢性炎細胞浸潤，表皮層萎縮，結締組織纖維黏液樣變化等；電鏡下可見各組出現不同程度角質層增厚，細胞間連接松散，異染色質增多，色素沉著，細胞質溶解，微絲減少，細胞核固縮、畸形等。表明亞砷酸鈉染毒可導致皮膚細胞損傷。

砷易與皮膚組織中的巰基結合，形成穩(wěn)定的絡合物或環(huán)狀化合物，抑制多種巰基依賴酶活性，影響細胞正常代謝、氧化呼吸及染色體結構[14]。因此砷中毒最突出的早期癥狀表現為皮膚脫色、著色和角化。NAC已廣泛應用于臨床，主要用于肺部疾病的治療。本實驗中，NAC作為巰基補充物，給藥后，高劑量干預組大鼠健康狀況明顯好轉，與高劑量組比較發(fā)現，光鏡下高劑量組皮下部分結締組織纖維黏液樣變化，黑色素細胞增多；電鏡下高劑量組黑素小體明顯增多。相關研究證實砷攝入會抑制巰基活性導致酪氨酸酶活性增加，進而產生黑色素，最終形成色素沉著。NAC作為巰基補充劑，可抑制酪氨酸激酶的激活，從而降低黑色素的生成。在砷致小鼠皮膚黑色素合成實驗中發(fā)現NAC可以減緩砷對小鼠皮膚的損傷[15]。目前國外對NAC在皮膚疾病中的治療報道較多，NAC臨床治療皮膚疾病具有療效好、不良反應較少等優(yōu)勢[16]。我國治療砷中毒型皮膚損傷藥物以二巰基丙磺酸鈉為主，但該藥物不良反應明顯，NAC是否能作為砷中毒型皮膚損傷的治療藥物仍需要進一步研究。

綜上所述，通過長期飲水砷暴露，會對SD大鼠產生不同程度的毒性作用，皮膚損傷以細胞壞死、表皮萎縮、黑色素增多、角化過度為主，且毒性作用隨著劑量增大而加重，進行NAC的干預治療后，可能在一定程度上緩解NaAsO2對SD大鼠皮膚組織的損傷。