烏頭霜霉病傳播機(jī)制初步研究

陳茂婷1 書劍琴1 李文敏1 胡琪琪1 王光志1 歐 洪2

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137

毛茛科烏頭屬植物烏頭(AconitumcarmichaeliDebx．)為常用藥用植物，其干燥子根附子具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛等功效，母根川烏具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛等功效，均為著名川產(chǎn)道地藥材[1]。主產(chǎn)區(qū)為四川江油、布拖。其中江油市作為烏頭的道地產(chǎn)區(qū)，已有一千多年的栽培歷史。隨著川烏、附子的需求量日益增大，烏頭的種植規(guī)模也逐漸增大，但在栽培過程中，發(fā)現(xiàn)多種植物病害。其中，對(duì)附子藥材產(chǎn)量影響較大的有霜霉病、根腐病和白絹病，這幾種病害常常相互交叉影響，嚴(yán)重時(shí)可引起50%以上的減產(chǎn)[2]。

霜霉病是一種發(fā)病率較高的葉類病害，具有發(fā)病時(shí)間早、傳播速度快、防治困難等特點(diǎn)。在經(jīng)濟(jì)作物和農(nóng)作物中有較深入的研究[3-4]，并且研制出了防治效果較好的生防試劑[5-6]，但在藥用植物中的研究較少。烏頭霜霉病病原菌是余永年在1979年發(fā)現(xiàn)的一種新的病原菌[7]，病原物主要是鞭毛菌亞綱卵菌目霜霉科霜霉屬烏頭霜霉PeronosporaaconiteYu. 。本課題組在前期的工作中，基于顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)烏頭霜霉病的病原物進(jìn)一步進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，并建立了該病原物的快速檢測(cè)技術(shù)[8-9]。但目前缺乏關(guān)于烏頭霜霉病病原菌的繁殖方式及傳播機(jī)制的研究，防治問題依然困難。

病害防治是植物栽培過程中很重要的環(huán)節(jié)，及時(shí)有效地防止病害發(fā)生能提高藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。為了找到適當(dāng)?shù)姆椒ㄗ韪舨≡姆敝?，減少病原菌的傳播，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)查不同種源地烏頭幼苗的患病情況，采用光學(xué)顯微觀察烏頭不同部位的石蠟切片，掃描電子顯微觀察烏頭病葉，對(duì)烏頭霜霉病病原菌的繁殖方式和傳播機(jī)制進(jìn)行了初步探究。

1 材料

1.1 植物來源 于2015年11月從北川縣小壩鄉(xiāng)(104°10′33.70″E，32°00′18.13″N，海拔1413m)、青川縣房石鎮(zhèn)(104°57′20.11″E，32°21′50.52″N，海拔1133 m)、青川縣大壩鄉(xiāng)(105°09′24.16″E，32°30′10.52″N，海拔906 m)安縣茶坪鄉(xiāng)(104°15′29.04″E，31°42′49.94″N，海拔1041 m)采集烏頭種苗，隨機(jī)選擇各地部分種根浸泡于F.A.A固定液中，將其余種根種植于實(shí)驗(yàn)田里，每種源地幼苗各栽培40株。2016年2月底，待實(shí)驗(yàn)田里烏頭出苗后，觀察并采集烏頭霜霉病病株。從四川省江油市普照村優(yōu)質(zhì)無公害附子GAP生產(chǎn)基地(104°41′27.24″E，31°43′47.00″N，海拔512 m)，采用“隨機(jī)采樣法”[10]，每個(gè)點(diǎn)采集3份不同發(fā)病程度的烏頭霜霉病病株。置采樣箱中保濕，并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室備用。同時(shí)，在周圍5 m范圍內(nèi)無霜霉病株地點(diǎn)采集健康烏頭植株。

1.2 試劑 拿大樹膠(BDH Chemicals Ltd.)；番紅(上海化學(xué)試劑有限公司)；固綠(上海標(biāo)本模型廠)；石蠟(成都雅榮生化設(shè)備部)；麝香草酚(成都化學(xué)試劑廠)；無水乙醇、二甲苯、甲醛、冰醋酸和丙三醇均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.3 儀器 DM2000型光學(xué)顯微鏡、DFC-495科研數(shù)碼攝像頭(德國LEICA公司)；JSM-6390LV電子掃描電鏡(日本電子株式會(huì)社)；PCD-E3000恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；HM335E型切片機(jī)；AP280-123型包埋機(jī)(德國MICROM公司)。

2 方法

2.1 不同種源地烏頭霜霉病發(fā)病情況 在實(shí)驗(yàn)田里，采取高壟種植，劃分4塊樣地，每塊樣地種植不同種源地烏頭種苗。待幼苗出土后，觀察并記錄霜霉病發(fā)病情況。

2.2 烏頭患病組織石蠟切片顯微觀察 將2015年浸泡的種根、感染霜霉病的葉、莖進(jìn)行石蠟切片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察不同組織中病原菌的形態(tài)特征，并拍照。

① 固定：將患病組織修剪成合適大小塊狀(0.5 cm×0.5 cm)，放入FAA固定液中固定 48 h。

② 脫水：將固定后的材料用蒸餾水沖洗，然后依次轉(zhuǎn)移至濃度為50%、75%、85%、95%的乙醇溶液中分別脫水1 h，最后轉(zhuǎn)移至無水乙醇脫水1 h。

③ 透明：將材料依次轉(zhuǎn)移至25%二甲苯+75%無水乙醇溶液、50%二甲苯+50%無水乙醇溶液、75%二甲苯+25%無水乙醇溶液、純二甲苯中各透明30 min。最后再轉(zhuǎn)移至純二甲苯透明15 min。

④ 浸蠟：將材料依次轉(zhuǎn)移至提前加熱熔融的75%二甲苯+25%石蠟、50%二甲苯+50%石蠟、25%二甲苯+75%石蠟中各2 h，最后轉(zhuǎn)移至純蠟在63 ℃烘箱中保溫過夜，第二天轉(zhuǎn)移至純蠟中再浸蠟3 h。

⑤ 包埋：提前將包埋用的正方形塑料盒和夾取用的鑷子放在恒溫箱中預(yù)熱。將材料從純蠟中迅速取出并放在塑料盒中央，倒入純蠟。提前打開冷卻臺(tái)開關(guān)，迅速將塑料盒平穩(wěn)移至冷卻臺(tái)，30 min后關(guān)閉冷卻臺(tái)，將蠟塊倒出，選取葉片所在部位將其切成正方形小蠟塊，將小蠟塊用加熱的刀片熱熔后粘貼在小木塊上。

⑥ 切片：將粘貼著蠟塊的小木塊安裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上；調(diào)整好石蠟塊與刀片之間的角度與位置(刀片與石蠟切片約15°左右)；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器，使材料的切片厚度為10 μm；在適宜搖轉(zhuǎn)速度(通常為40～60 r/min)下將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶，當(dāng)蠟帶達(dá)到程鵬飛 20 cm時(shí)，用毛筆輕輕地將蠟帶挑起，輕輕平放在干燥紙上，光滑的切面朝下，將蠟帶切成小段。

⑦ 粘片：在洗凈后干燥的載玻片(無水乙醇浸泡然后用蒸餾水沖洗將其擦干)上滴一小滴蛋白粘貼劑，涂勻后，再滴加兩滴蒸餾水；將蠟帶光滑平整的一面貼于載玻片的中央；然后將制作好的片子放在42 ℃恒溫烘箱中烘干約 4 h。

⑧ 脫蠟：將裝有純二甲苯的玻璃瓶放在約40°熱水中加熱，然后將載玻片放入純二甲苯中脫蠟兩次，每次15 min。

⑨ 復(fù)水染色：將脫蠟后的載玻片依次轉(zhuǎn)移至75%二甲苯+25%無水乙醇溶液、50%二甲苯+50%無水乙醇溶液、25%二甲苯+75%無水乙醇溶液、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中每級(jí)3 min，然后置于番紅中染色30 min；依次轉(zhuǎn)移至50%、75%、85%、95%乙醇中各2 min，然后置于固綠中染色15 s；轉(zhuǎn)移至95%乙醇中 2 min；再次轉(zhuǎn)移至100%乙醇中 2 min，兩次；然后依次轉(zhuǎn)移至75%無水乙醇+25%二甲苯溶液、50%無水乙醇+50%二甲苯溶液、25%無水乙醇+75%二甲苯溶液中各2 min，最后移至純二甲苯中2min，兩次。

⑩ 封片：在平臺(tái)上放一張干凈的吸水濾紙，從二甲苯中取出染色完成的載玻片放在紙上；迅速在切片的中央偏左的位置滴加2～3滴樹膠，封片過程中注意蓋玻片的放置，避免產(chǎn)生氣泡。待整張片子做好后，轉(zhuǎn)移至42 ℃恒溫烘箱中烘干。

2.3 患病組織超微形態(tài)觀察 取患不同等級(jí)霜霉病的葉片，用無菌剪刀將各組葉片剪成小塊(約5 mm×5 mm)，將樣品用導(dǎo)電雙面膠粘在樣品臺(tái)上，用掃描電子顯微鏡觀察(倍數(shù)為×85～×1500，加速電壓為30 kV)病原菌在葉片上的生長狀態(tài)、萌發(fā)方式以及不同患病等級(jí)葉片的差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同種源烏頭霜霉病發(fā)病情況 對(duì)實(shí)驗(yàn)田中種植的烏頭進(jìn)行霜霉病病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同種源地烏頭幼苗霜霉病發(fā)病情況不同。4塊實(shí)驗(yàn)田中，青川縣房石鎮(zhèn)和大壩鄉(xiāng)烏頭種苗試驗(yàn)地中觀察到發(fā)病植株(圖1，A、B)，房石鎮(zhèn)種源地烏頭幼苗霜霉病發(fā)病率較高，達(dá)到40%。其他實(shí)驗(yàn)田中均未發(fā)現(xiàn)患病植株(圖1，C)。采集病葉，用無菌解剖針挑取少許病葉背面上的菌絲，用水做浮載劑進(jìn)行常規(guī)裝片，對(duì)病葉上菌絲進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)病原菌孢囊梗(圖1，D、F)、孢子囊形態(tài)大小(圖1，E)與課題組前期研究結(jié)果一致。因種植過程中，管理?xiàng)l件均一致，而霜霉病發(fā)病情況不同，說明烏頭霜霉病的發(fā)病可能與種源有聯(lián)系。霜霉病原菌可能存在于烏頭種苗或者根際土壤中，其卵孢子在組織或土壤中越冬后，到來年春天萌發(fā)，侵染烏頭幼苗。不同種源地的烏頭種苗或根際土壤所攜帶的病原菌數(shù)量不同，所以導(dǎo)致不同種源地幼苗的發(fā)病率不一致。

3.2 組織切片觀察 通過對(duì)不同種源地種根、病葉、莖進(jìn)行石蠟切片觀察，在患病烏頭莖(圖2)、葉(圖3)中均發(fā)現(xiàn)了卵孢子。其中在青川大壩鄉(xiāng)的種根中發(fā)現(xiàn)了卵孢子(圖4)，其余種根中未能發(fā)現(xiàn)。卵孢子呈卵圓形、橢圓形、不定形等形狀，直徑平均為(26±2)μm。卵孢子外壁較厚，且內(nèi)部含有豐富的內(nèi)含物。卵孢子主要存在于組織細(xì)胞間隙(圖2，B)，未見卵孢子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。余永年等[1]報(bào)道的烏頭霜霉卵孢子直徑為22.4～37.8 μm，平均值大小(28.76±2.96 )μm，較本文中觀察到的稍大，但本文觀察到的卵孢子直徑在報(bào)道范圍之內(nèi)，結(jié)果基本一致。

圖1 霜霉病發(fā)病情況及顯微特征

圖2 烏頭莖中卵孢子形態(tài)

圖3 烏頭葉中卵孢子形態(tài)

圖4 烏頭根中卵孢子形態(tài)

3.3 病原菌超微形態(tài)觀察 取不同生長階段的烏頭葉片進(jìn)行電子掃描顯微鏡觀察，結(jié)果表明，不同生長期葉片上的氣孔和病原菌孢囊梗、孢子囊等在數(shù)量和形態(tài)表現(xiàn)上不同。在健康的葉片上，葉背面(圖5，A)和葉正面(圖5，B)各結(jié)構(gòu)均正常，保衛(wèi)細(xì)胞正常發(fā)育，氣孔和葉表皮細(xì)胞上未見病原菌孢囊梗、孢子囊或孢子等。霜霉病發(fā)病較輕的烏頭葉上，在病葉背面能夠觀察到少量的孢子囊，部分氣孔中萌發(fā)出了孢囊梗，成熟的孢囊梗分支末端上生有孢子囊(圖6，A)。在發(fā)病嚴(yán)重的葉被上，能夠觀察到大量散落在葉背上的孢子囊以及從氣孔中萌發(fā)的孢囊梗(圖6，B)，大量的孢子囊和孢囊梗交錯(cuò)在一起覆蓋在葉背上(圖6，C)，即形成肉眼觀察下的霜霉菌灰色霉層。

圖5 烏頭健康葉電鏡觀察

圖6 烏頭病葉電鏡觀察

3.4 病原菌侵染過程 烏頭霜霉病主要為葉類病害，在葉上的感染與定殖是一個(gè)復(fù)雜的過程。本文通過電子顯微鏡觀察烏頭病葉葉背上的病原菌形態(tài)特征，以及病原菌如何在寄主上生長。在烏頭葉背面的氣孔中觀察到了卵孢子萌發(fā)出的孢囊梗(圖7，A)，病原菌會(huì)從寄主中吸取營養(yǎng)，使得孢囊梗不斷的生長，有時(shí)一個(gè)氣孔中會(huì)伸出多條孢囊梗(圖7，B)，當(dāng)孢囊梗生長到一定的階段，開始進(jìn)行二叉分支(圖7，C)，發(fā)育成熟后在分支頂端產(chǎn)生孢子囊(圖7，D)，當(dāng)孢子囊成熟后就會(huì)脫離孢囊梗，形成游動(dòng)孢子囊(圖7，E)。孢子囊成熟脫落后，受到風(fēng)、雨水等的影響，在適宜的條件下，孢子囊開始萌發(fā)出芽管，芽管會(huì)從氣孔或者葉片傷口等空隙中侵入葉內(nèi)(圖7，F(xiàn))。

圖7 病原菌侵染過程

4 討論

烏頭霜霉病傳播方式復(fù)雜，且在國內(nèi)外研究較少，其病原菌是霜霉科霜霉屬烏頭霜霉(PeronosporaaconitiYu)，它的繁殖速度較快，對(duì)寄主的影響較大。病原菌的繁殖主要包括有性和無性繁殖兩種方式。有性階段主要是通過產(chǎn)生雄器和藏卵器來完成。本實(shí)驗(yàn)文通過對(duì)病葉、病莖進(jìn)行石蠟切片，觀察到了病原菌的卵孢子。卵孢子主要存在于細(xì)胞間隙之中，多呈球形，外壁較厚，含有豐富的內(nèi)含物和卵周質(zhì)，豐富的卵周質(zhì)可以為卵孢子的萌發(fā)提供營養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中只觀察到了受精后的卵孢子，還缺乏對(duì)雄器和藏卵器結(jié)合方式的研究。無性繁殖主要靠產(chǎn)生孢子囊來進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過電子顯微鏡對(duì)烏頭霜霉病葉進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)孢子囊以萌發(fā)芽管而不是產(chǎn)生游動(dòng)孢子的形式進(jìn)行繁殖，這不同于一些其他霜霉科病原菌[12-13]。孢囊梗從氣孔中伸出，主干生長到一定階段便開始進(jìn)行二叉式多次分支，直到孢囊梗成熟便不再生長，這不同于腐霉科孢囊梗的無限生長[12]。孢子囊生長于成熟孢囊梗分支的頂端，成熟后從孢囊梗上脫落，借著風(fēng)力、雨水等傳播，在適宜的條件下萌發(fā)出芽管循環(huán)侵害寄主葉片。

在對(duì)烏頭病葉正面和背面比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，孢子囊和孢囊?；局划a(chǎn)生于葉背，葉正面基本觀察不到，其原因可能是葉背上氣孔較多，而病原菌主要是以通過氣孔等孔隙侵入寄主進(jìn)行循環(huán)傳播侵害。對(duì)采集的不同種源地烏頭種苗石蠟切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在烏頭根中未發(fā)現(xiàn)卵孢子，且根組織結(jié)構(gòu)正常，說明烏頭種根中未攜帶病原菌。對(duì)于實(shí)驗(yàn)田中房石鎮(zhèn)、大壩鄉(xiāng)種源烏頭幼苗發(fā)病率較高的情況，初步認(rèn)為可能是由于采集種根時(shí)根際土中帶有病原菌卵孢子，卵孢子在土壤中越冬后，春天溫度適宜時(shí)開始萌發(fā)侵染烏頭[14]。

據(jù)調(diào)查，烏頭霜霉病病原菌在15～20 ℃時(shí)迅速生長繁殖，在此溫度下霜霉病傳播較快[15]。并且，孢子囊的產(chǎn)生與萌發(fā)都需要一定的濕度條件[16]，因此，春天是烏頭霜霉病發(fā)生與流行的最佳時(shí)期。在此階段，田間管理應(yīng)該注意及時(shí)排水，防止霜霉病的傳播。在收集種根時(shí)及時(shí)檢測(cè)根際土中的病原菌卵孢子也是有效降低烏頭患病率的一個(gè)重要途徑。

綜上，本實(shí)驗(yàn)明確了烏頭霜霉病發(fā)病與種苗是否帶菌有關(guān)，其傳播可能是烏頭霜霉卵孢子在種苗內(nèi)越冬，春天萌發(fā)侵染烏頭，為烏頭霜霉病的防治技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。