氨基糖苷類抗生素質(zhì)量控制進展

袁耀佐 張玫 金少鴻

(1 國家藥監(jiān)局化學藥品雜質(zhì)譜研究重點實驗室，南京 210019；2 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210019；3 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

1 氨基糖苷類抗生素概述

氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotics)是臨床使用較早的一類抗生素，其與β-內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合使用時有良好的協(xié)同作用，用藥方便，價格低廉，有臨床應用價值的品種達200余種，但部分品種臨床不良反應特別是耳腎毒性嚴重限制了使用，目前臨床常用的品種僅20種左右，它們的化學結(jié)構(gòu)(圖1～3)、來源、分類、原研公司等基本信息在相關文獻中已有系統(tǒng)總結(jié)[1]。文獻[2]按結(jié)構(gòu)特點、抗菌譜和耐鈍化酶等，將氨基糖苷類抗生素類抗生素發(fā)展分為3個階段，或稱為3代：第1代以卡那霉素為代表，其結(jié)構(gòu)特點是完全羥基化的氨基糖與氨基環(huán)醇相結(jié)合，不抗銅綠假單胞菌；第2代以慶大霉素為代表，其結(jié)構(gòu)中均含有脫氧氨基糖，具有抗銅綠假單胞菌的特點；第3代則是氨基環(huán)醇上1-N位取代的半合成衍生物，代表性品種有阿米卡星、奈替米星、依替米星、異帕米星等，其特點是保留了母體的抗菌活性，耳腎毒性較母核小，并對耐藥菌的鈍化酶有良好的抵御作用，其中依替米星為我國自主研發(fā)的一類新藥；2018年由Achaogen開發(fā)并獲美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市的新型氨基糖苷類抗生素普拉佐米星(plazomicin)，可治療多重耐藥性的腸桿菌科菌引起的嚴重感染?？上У氖?，由于“監(jiān)管方面的不利因素以及唯一的抗生素品種市場非常有限，抗生素企業(yè)市場環(huán)境艱難、資金來源不斷減少”等原因，Achaogen于2019年4月申請破產(chǎn)[3]，但此新型氨基糖苷類抗生素普拉佐米星(500mg/10mL)已被WHO基本藥物目錄第21版(2019)收入。氨基糖苷類抗生素的歷史變遷如圖4所示。

圖1 常見的4,6雙取代脫氧鏈霉胺的氨基糖苷類抗生素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of deoxystreptamine aminoglycosides,4,6-disubstituted

圖2 常見的4,5雙取代脫氧鏈霉胺的氨基糖苷類抗生素的化學結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of deoxystreptamine aminoglycosides,4,5-disubstituted

圖3 藥典中收載過的其它氨基糖苷類抗生素的化學結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of some other aminoglycosides antibiotics incorporated in pharmacopeia (s)

2 氨基糖苷類抗生素國內(nèi)外藥典標準現(xiàn)狀

圖4 氨基糖苷類抗生素變遷過程示意圖Fig.4 Evolution paths of aminoglycosides antibiotics

目前全球藥典約50余種[4]，作為一類重要的抗生素，氨基糖苷類抗生素原料及其制劑在國內(nèi)外主要藥典均有收載，但各藥典收載的品種、劑型不盡相同，設置的控制項目、測定方法及限度也不完全一致，為協(xié)調(diào)的標準，1990年ICH率先成立藥典討論工作組(Pharmacopeia Discussion Group,PDG)，并成立專家工作組(Expert Working Group,EWG)，試圖在ICH成員國之間進行標準協(xié)調(diào)。2012年，WHO通過溝通、合作、協(xié)作和組建聯(lián)盟等手段，也在積極尋求藥典標準的一致性，但迄今為止，效果甚微。為了方便讀者了解氨基糖類抗生素國內(nèi)外藥典標準的現(xiàn)狀，特將中國藥典2015年版(ChP2015)、美國藥典42版-處方集37版(USP42-NF37)、英國藥典2019(BP2019)、韓國藥典第10版(KPX)、印度藥典2010年版(IP2010)、國際藥典第8版(Ph.Int.8th)中氨基糖苷類抗生素的原料及制劑的收載情況進行歸納總結(jié)，并對標準中相關內(nèi)容進行評述。

2.1 藥典收載情況

氨基糖苷類抗生素原料及其制劑在國內(nèi)外主要藥典均有收載，各國藥典的收載情況如表1所示，原料共涉及16個品種，ChP2015收載最多，為14種。日本藥典從第15版開始不再收載硫酸阿司米星，USP42-NF37、JP17等也不再收載硫酸西索米星及硫酸奈替米星的原料及制劑。

藥典涉及劑型有注射液、注射用、片劑、緩釋片、膠囊劑、軟膏、眼用軟膏、子宮輸液(uterine infusion)、眼用溶液、口服溶液、注射用混懸液(injectable suspension)、滴耳液、霧化用溶液(nebulizer solution)、吸入液(inhalation solution)等，美國藥典收載的劑型最為全面。氨基糖苷類抗生素主要以注射液、注射用以及外用制劑為主，也有用于腸道疾病治療的口服劑型。藥典中還有很多復方制劑，如USP42-NF37中新霉素的復方制劑就達53種之多。

2.2 藥典標準分析與評述

國內(nèi)外主要藥典中氨基糖苷類抗生素原料藥標準正文部分主要涉及如下14個項目：分子式(chemical formula)、化學名稱(chemical name)、定義(definition)、生產(chǎn)工藝(manufacture/production)、性狀(characters)、鑒別(identification/identities test)、檢查(tests)、含量測定(assay)、類別(categories)、包裝與貯藏(container and storage)、制劑(formulation)、雜質(zhì)列表(impurities)、標簽(labeling)、補充要求或信息(additional requirements/additional information)。不同品種的氨基糖類抗生素藥典標準收載的主要項目基本一致，但因監(jiān)管體系、體例要求、思維方式乃至習慣沿襲等不同，也出現(xiàn)部分收載項目及具體要求有較大的差異。在藥典標準執(zhí)行過程中發(fā)現(xiàn)，有些項目執(zhí)行過程中會出現(xiàn)分歧，本部分主要針對需要關注或者容易出現(xiàn)爭議的項目進行討論。至于制劑方面，由于劑型種類較多，考慮篇幅，本文不進行具體介紹。

表1 氨基糖苷類抗生素原料在國內(nèi)外主要藥典的收載情況Tab.1 List of pharmaceutical substance of aminoglycosides adopted in the main pharmacopeias

2.2.1 性狀

性狀項在大多數(shù)藥典中為強制執(zhí)行項目，一般包含顏色、狀態(tài)、臭味、引濕性等，中國藥典通常還會將溶劑中的溶解度、比旋度等物理參數(shù)列在性狀項中。該項目執(zhí)行過程會出現(xiàn)很多問題，如(1)臭味需要實驗者去聞和嘗，對檢驗者健康存在潛在風險；(2)形狀和顏色因為主觀判斷，容易出現(xiàn)爭議；(3)溶解度也會因工藝不同出現(xiàn)偏差等。為此，USP中性狀項已經(jīng)不再列入正文，而是在Reagents and reference table中以“Description and relative solubility”形式出現(xiàn)，只作為參考信息，不作為強制執(zhí)行項目。另外需要提醒的一點還有“引濕性”，以往藥典描述比較籠統(tǒng)，各國藥典均沒有一個具體的測定方法，中國藥典從2015年版開始，制定了“9103藥物引濕性試驗指導原則”，規(guī)定了具體的測定方法及標準。中國藥典注意到上述問題，正在著手修訂相關內(nèi)容，如中國藥典四部中部分品種已經(jīng)將容易出現(xiàn)爭議的性狀內(nèi)容刪除，部分有重要信息提示的內(nèi)容也是以“注”的形式體現(xiàn)。

2.2.2 鑒別

目前常見氨基糖苷類抗生素藥典方法如表2所示。表中顯示，由于絕大部分氨基糖苷類抗生素無紫外特征吸收，目前常規(guī)的儀器分析方法如UV，HPLC-UV均不適用；通常情況下，紅外分光光度法(IR)因其譜圖能很好地反映特征官能團而具有較佳的專屬性，但對于氨基糖苷類抗生素，由于大多數(shù)特征基團均為氨基和羥基，IR對該類產(chǎn)品的區(qū)分力不強，因此，有采用化學顯色和薄層色譜(TLC)進行補充，中國藥典及歐洲藥典中則采用了專屬性較佳HPLC方法；在歐洲藥典9.0(Ph.Eur9.0)和日本藥局方17版(JP17)的妥布霉素標準中，還將核磁共振氫譜應用于鑒別。在歐美藥典中，還會采用熔點、比旋度等理化特征作為鑒別項目，如硫酸卡那霉素在Ph.Eur.9.0中把熔點作為鑒別的方法之一。

2.2.3 檢查

國內(nèi)外藥典標準分析結(jié)果顯示，氨基糖苷類抗生素原料藥檢查包含“比旋度、酸度、溶液的澄清度與顏色、硫酸鹽、有關物質(zhì)/特定雜質(zhì)、殘留溶劑、干燥失重/水分、重金屬、組分組成、可見異物、不溶性微粒、異常毒性、細菌內(nèi)毒素/熱源、降壓物質(zhì)、無菌、結(jié)晶性、抽針試驗”等17個項目，限于篇幅，本文主要就藥典標準中方法、限度等有較大差異的項目進行分析。

表2 主要藥典中氨基糖苷類抗生素鑒別方法一覽表Tab.2 List of the identification methods of aminoglycosides antibiotics in some pharmacopoeias

(1)比旋度：比旋度可以反映產(chǎn)品的純度，如硫酸新霉素為新霉素B和新霉素C混合物(Ph.Eur.9.0要求新霉素C不小于15.0%)，其比旋度要求在“+53.5～+59.0”；而高純度的新霉素B(福萊霉素，framycetin sulfate，要求新霉素C不得過3.0%)，其比旋度要求在“+52.5～+55.5”；有時還可以作為鑒別項的一部分，如JP17中硫酸卡那霉素(以卡那霉素A為主，卡那霉素B不得過4%)的比旋度要求在“+103～+115”，而硫酸卡那霉素B(bekanamycin sulfate，純度不低于97%)比旋度要求為“+102～+116”。

(2)硫酸鹽與酸堿度：現(xiàn)有藥典收載的原料中，除鹽酸大觀霉素外，其余均為硫酸鹽，氨基糖苷類抗生素分子中含有多個氨基，其可結(jié)合具體數(shù)目的硫酸根，如2分子依替米星結(jié)合5分子硫酸根；但對于發(fā)酵來源的氨基糖苷類抗生素，有些硫酸根數(shù)目不明確，如硫酸卡那霉素；還有些品種可能會出現(xiàn)不同硫酸鹽結(jié)合率的多個產(chǎn)品，如阿米卡星有結(jié)合1.8分子和2分子的硫酸根的產(chǎn)品，因此，標準中需要控制硫酸鹽的含量。傳統(tǒng)的測定硫酸鹽含量的方法采用絡合滴定法，實驗中發(fā)現(xiàn)滴定突躍往往不明顯，很難判斷終點，導致測定結(jié)果誤差大。中國藥典采用HPLC-ELSD法測定氨基糖苷類抗生素中硫酸鹽含量，還有不少文獻報道采用離子色譜法測定硫酸鹽的含量[5]，從誤差的角度分析，離子色譜方法比較準確，但其檢驗成本相對較高，因此，在實際工作中，需要根據(jù)實驗目的進行方法選擇。

還有研究顯示，組分單一的氨基糖苷類抗生素如核糖霉素，其硫酸鹽含量與其特定溶液的pH之間呈明顯的負相關[6]，但是對于多組分氨基糖苷類抗生素如硫酸慶大霉素和硫酸新霉素，中國藥典與歐美藥典中硫酸鹽限度要求一致，但pH值的限度有所差別，導致上述差異的可能原因是由于國內(nèi)外菌種來源、發(fā)酵工藝等差異導致組分分布的差別。因此，在質(zhì)量與療效一致性評價過程中，不能簡單比較藥典的異同，而是需要通過物質(zhì)基礎分析來探討導致上述差異的內(nèi)在原因。另外，硫酸鹽的含量還與主成分的效價或含量直接相關。

(3)溶液的顏色與澄清度：氨基糖苷類抗生素的原料藥藥典標準中，幾乎全部有溶液的顏色與澄清度檢查項，該項目是控制質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，其對有關物質(zhì)等雜質(zhì)控制的重要補充。其中，溶液的顏色是用于控制有色雜質(zhì)，而澄清度則是控制不溶性雜質(zhì)。

溶液的顏色測定方法主要有目視比色法、紫外分光光度法及色差計法3種，但對比發(fā)現(xiàn)，中國藥典和歐美日藥典在該檢測項有較大不同。而對于同一品種，國內(nèi)外對該項目的要求差異還很大，以硫酸慶大霉素為例，中國藥典要求“溶液應澄清無色，如顯色如顯渾濁，與1號濁度標準液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色或黃綠色2號標準比色液比較，均不得更深”。而歐洲藥典規(guī)定“溶液應澄清無色；如顯色，與合適顏色的6號標準比色液比較，均不得更深”。從字面看，二者差異很大，尤其在顏色的要求方面，但對藥典相關通則研讀發(fā)現(xiàn)，中國藥典與歐美藥典的標準色系完全不同(如中國藥典規(guī)定幾乎無色為供試品溶液顏色不深于相應色調(diào)0.5號標準比色液，歐洲藥典則規(guī)定不深于相應色調(diào)的9號標準比色液)，周怡[7]在其研究論文“溶液顏色檢查方法”判定標準色系模型的建立與應用”中詳細介紹了進行溶液顏色檢查的原因，分析了方法間的差異，最后利用色差計法，建立溶液顏色色系模型分析中、歐藥典各色系在模型中所處位置，確定利用色系模型進行溶液顏色判定的方法，彌補了現(xiàn)有結(jié)果判定方法不能統(tǒng)一的不足，為進行溶液顏色檢查提供了新的思路。根據(jù)檢驗的原理，比較現(xiàn)有溶液顏色檢查的3種方法，說明利用色差計進行檢驗的優(yōu)勢。上述研究闡明了目前在該項目國內(nèi)外標準差異的原因所在，為協(xié)調(diào)解決國內(nèi)外藥典規(guī)定的差異提供理論和實踐方面的支持。

(4)有關物質(zhì)：有關物質(zhì)是控制產(chǎn)品質(zhì)量一致性的關鍵指標，而色譜技術是控制有關物質(zhì)和組分的最有效手段，色譜技術的發(fā)展直接反映在有關物質(zhì)控制水平上。但對于氨基糖苷類抗生素，由于其為強極性物質(zhì)，在常用的反相色譜體系下保留很弱，而且絕大多數(shù)氨基糖苷類抗生素無特征紫外吸收基團，無法應用常規(guī)的紫外方法進行檢測，這些都給該類產(chǎn)品有關物質(zhì)和組分測定帶來挑戰(zhàn)。但是，近年來，隨著色譜分離及檢測技術的發(fā)展，多種分離及檢測技術均得到運用，相關的研究進展已經(jīng)有綜述報道[1,8]，但有些研究進展并沒有及時體現(xiàn)在國內(nèi)外藥典標準中，藥典中方法控制現(xiàn)狀如表3。中國藥典收載的14個氨基糖苷類抗生素，有11個品種的有關物質(zhì)均采用HPLC-ELSD法進行控制，由于與ELSD檢測器相兼容的流動相需要揮發(fā)性，這限制了流動相優(yōu)化的空間，使得現(xiàn)有藥典的色譜條件分離能力有限，部分品種的主峰中還會包裹相鄰雜質(zhì)，為此，中國藥典借鑒歐美藥典的做法，引入脈沖安培電化學檢測器，并在2015年版依替米星標準中首載HPLC-PAD的四波形電位法用于有關物質(zhì)和和含量測定，改善了原有標準的分離能力和檢測靈敏度，四波形電位的應用還較大的改善了歐美藥典普遍采用的三電位波形的耐用性[9]；針對某些現(xiàn)有色譜流動相所有試劑昂貴等問題(如配制現(xiàn)有中國藥典中核糖霉素有關物質(zhì)檢測用流動相1升，成本接近3000元人民幣)，袁耀佐等[10-13]對該方法進行條件優(yōu)化，在保證實驗效果更優(yōu)的前提下，檢驗成本直降97%。表3顯示，歐洲藥典更愿意采用HPLC-PAD法進行有關物質(zhì)的控制，但由于歷史原因，他們標準中PAD的電位參數(shù)設置均為三電位波形，該波形下金電極表面容易損耗，影響方法的耐用性，在流動相組成方面，歐洲藥典相關流動相中鹽的濃度也較高，并主要使用烷基磺酸鈉類離子對試劑增加色譜保留，對色譜儀器、色譜柱尤其是電極的耐用性影響較大，方法的重現(xiàn)性也較差，歐洲藥典在執(zhí)行過程也意識到這點，因此對慶大霉素有關物質(zhì)檢查方法進行了改進，采用與中國藥典類似的三氟乙酸體系的流動相，實踐中發(fā)現(xiàn)該流動相體系比原來的高鹽及烷基磺酸鈉流動相體系穩(wěn)定。考慮到特殊檢測器的特殊要求，中國藥典利用末端紫外吸收檢測阿米卡星的有關物質(zhì)，但在實踐中發(fā)現(xiàn)檢測效果并不理想。而日本藥典則采用柱后衍生熒光檢測法測定異帕米星的有關物質(zhì)，張楊慧等[14]還將該方法推廣至新霉素的有關物質(zhì)檢查，發(fā)現(xiàn)效果良好。近年來還有采用LC-CAD[12]及LC-NAQD法[15]檢測相應的氨基糖苷類抗生素的有關物質(zhì)。但其應用于藥典的可行性還需要驗證。

表3 主要藥典中氨基糖苷類抗生素有關物質(zhì)測定方法一覽表Tab.3 List of the methods of related substances of aminoglycosides antibiotics in some pharmacopoeias

(5)組分組成：目前所有藥典均將硫酸慶大霉素作為以慶大霉素C組分為主的多組分抗生素，中國藥典和美國藥典也將硫酸新霉素作為含有新霉素B和新霉素C的雙組分抗生素，但歐洲藥典將新霉素C作為有關物質(zhì)；中國藥典及美國藥典中將巴龍霉素作為含有巴龍霉素I和II的雙組分；歐洲藥典還將鹽酸大觀霉中的雙氫大觀霉素作為有效成分，藥典收載的其他品種均為單一組分。

由于生產(chǎn)工藝、臨床研究及使用的情況不同，各藥典對組分之間比例的規(guī)定也不盡相同，如硫酸慶大霉素在不同藥典中慶大霉素C組分的比例要求見表4。這些要求之間的協(xié)調(diào)比較困難，這給該產(chǎn)品的進出口之間帶來巨大的挑戰(zhàn)，目前李繼安等[16]發(fā)明了慶大霉素聯(lián)產(chǎn)工藝很好地解決這一難題。

目前主流藥典對氨基糖苷類抗生素組分之間的比例計算主要是面積歸一化方法，該方法有時無法反映各組分在原料中真實含量，中國藥典2015版采用外標法測定慶大霉素C組分的含量，再依據(jù)含量計算各自的比例，并且規(guī)定按外標法計算，4個組分的含量和應不少于50%，該方法在一定程度上推動了國產(chǎn)慶大霉素質(zhì)量的提高[17-19]。

(6)干燥失重/水分：氨基糖苷類抗生素除鹽酸大觀霉素中含有結(jié)晶水外，其余藥典收載的品種中均無結(jié)晶水的描述。本類抗生素均為引濕性，不同品種含有的吸附水差異較大，因此藥典要求也不同，如硫酸慶大霉素美日韓藥典要求干燥失重不得過18.0%；而硫酸卡那霉素則規(guī)定干燥失重不得過4.0%或5.0%。對于測定方法，目前主要有兩種方法，即干燥失重法和卡爾費休氏法。干燥失重法還分為常壓法和減壓法，不同藥典關于干燥失重的終點判斷也不完全一致；而卡爾費休氏法中所用溶劑主要有甲醇、不同比例的甲酰胺-甲醇/乙二醇-甲醇。

實驗過程發(fā)現(xiàn)，干燥失重法如采用中國藥典常用的干燥至恒重作為實驗終點，絕大多數(shù)品種需要較長的時間才能達到，考慮到本品含水量均較大，從不確定度的角度來評價，恒重與否帶來的誤差幾乎可以忽略，綜合平衡檢驗成本與結(jié)果準確的風險，采用特定條件下干燥一定的時間(如3h或24h)進行測定比較科學經(jīng)濟。但在進行方法的選擇確定時應進行科學的評估?？紤]到卡爾費休氏法測定的便捷快速，在方法開發(fā)時用其替代干燥失重方法是自然的想法，國內(nèi)外藥典中也有部分品種采用該方法，但是氨基糖苷類抗生素在常用的無水甲醇中溶解性較差，會因終點很難達到導致測定時間較長，并且往往測定結(jié)果重復性欠佳。為此，部分品種采用不同比例的甲酰胺-甲醇/乙二醇-甲醇的混合溶液替代無水甲醇作為測定溶劑，在一定程度上改善上述不足，但實際效果往往也不夠理想。

(7)重金屬：氨基糖苷類抗生素藥典標準正文中，不少品種的規(guī)定重金屬檢查項目，測定方法也主要以目視比色法為主。但近年來，隨著元素雜質(zhì)分析技術的發(fā)展，ICH率先提出對重金屬等元素雜質(zhì)的精細化控制，即ICH Q3D，后來美國藥典會從USP41版開始，在原料正文中刪除對重金屬的具體要求，但在通則＜232＞、＜233＞中規(guī)定了所有成品中元素雜質(zhì)的要求。因此，制劑企業(yè)在選擇生產(chǎn)制劑用原輔料時，就必須對他們中的重金屬含量進行評估，也就是說，雖然藥典正文中取消了對重金屬的具體要求，并不等于對重金屬沒有要求，相反，有時候在企業(yè)內(nèi)控標準中對相關元素的要求反而更嚴，這個需要注意。

表4 慶大霉素C組分在主要藥典中的限度要求Tab.4 The specification setting of gentamicin C components in gentamicin sulfate in some pharmacopoeias.

2.2.4 含量測定

國內(nèi)外主要藥典中氨基糖苷類抗生素含量測定方法如表5所示，絕大多數(shù)品種仍采用微生物檢定法控制含量，該方法為經(jīng)典方法，其優(yōu)勢在于測定結(jié)果在一定程度上可以直接反應抗生素的抗菌活性，但是其也存在操作繁瑣、測定時間長等不足。因此，很多企業(yè)在生產(chǎn)實際質(zhì)量控制過程中，采用儀器測定方法替代微生物檢定方法，美國藥典于1994年在藥典論壇(PF)中就發(fā)表了題為“Use of liquid chromatography for the assay of antibiotics.Stimuli to the revision process”的文章，供大家討論采用儀器方法替代微生物檢定法的測定效價的可行性及替代方法驗證的內(nèi)容等，經(jīng)過多年的積累，最后于USP38-NF33-S2推出“＜1223.1＞VALIDATION OF ALTERNATIVE METHODS TO ANTIBIOTIC MICROBIAL ASSAYS”。后來，WHO也于2017年推出類似的討論稿。中國藥典盡管在通則方面落后于上述藥典，但在各論方法的研究方面處于國際領先，常艷等[20-23]在這方面有較為系統(tǒng)的研究，并已經(jīng)成功地建立兩性霉素B[20]、硫酸慶大霉素[21]、萬古霉素和去甲萬古霉素[22]、替考拉寧[23]等HPLC替代微生物檢定法測定效價的方法，其中兩性霉素B的方法已經(jīng)被中國藥典2015年版所收載。

目前，國內(nèi)外藥典在含量測定方法選擇的思路差異較大，以HPLC方法為例，有采用UV(利用紫外末端吸收)和ELSD/PAD方法直接檢測，有利用柱前衍生紫外檢測，也有利用柱后衍生法等，而鹽酸大觀霉素，USP和國際藥典仍采用衍生化的GC-FID方法。鑒于上述現(xiàn)狀，國家藥典委于2019年特設立研究課題“氨基糖苷類抗生素的含量和有關物質(zhì)檢測方法的優(yōu)化與應用”，其中任務之一就是開展氨基糖苷類抗生素含量測定方法的現(xiàn)代化。該課題的另一任務就是希望建立更經(jīng)濟適用的檢驗方法。實際檢驗工作中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有藥典中部分方法檢驗成本較高，如配制中國藥典中硫酸核糖霉素的含量測定用流動相1L約需3000元人民幣；同樣，USP41中配制奈替米星含量測定方法的流動相1升也約需500元人民幣。為此，很多學者開展色譜條件的優(yōu)化工作，如史孫亮等[24]建立的核糖霉素測定用流動相成本僅為藥典方法的3%，趙述強等[25]經(jīng)過優(yōu)化建立的奈替米星含量測定用色譜流動相成本也僅為USP流動相的四分之一。

表5 主要藥典中氨基糖苷類抗生素含量測定方法一覽表Tab.5 List of the methods of assay of aminoglycosides antibiotics in some pharmacopoeias.

3 氨基糖苷類抗生素雜質(zhì)譜研究中遇到的挑戰(zhàn)與對策

3.1 法規(guī)/指南的進展

對藥物雜質(zhì)譜的控制是保證藥品用藥安全的重要環(huán)節(jié)，仿制藥一致性評價研究過程中，雜質(zhì)譜的研究更是與原研制劑質(zhì)量比對的重要指標。目前上市的氨基糖苷類抗生素均為發(fā)酵及半合成來源，與化學合成工藝相比，發(fā)酵工藝更具多變性，不易控制，因此與單純使用化學合成生產(chǎn)的產(chǎn)品相比，生產(chǎn)工藝含有發(fā)酵步驟的活性物質(zhì)的雜質(zhì)分布一般比較復雜和難以預測，ICH Q3指南不適合用于此類產(chǎn)品的雜質(zhì)譜研究。2012年6月，EMA(European Medicines Agency)正式發(fā)布了抗生素有關物質(zhì)標準制訂指導原則[26]，這也是國際上首個針對抗生素雜質(zhì)研究制訂的指導原則。該指南旨在為不適用于 ICH Q3指南的發(fā)酵產(chǎn)品或源于發(fā)酵產(chǎn)品的半合成物質(zhì)中雜質(zhì)質(zhì)量標準的設定提供指導，對于活性成分為發(fā)酵或半合成來源的抗生素制劑產(chǎn)品的相關雜質(zhì)。該指南給出了報告、鑒定和界定閾值，在活性物質(zhì)由多個密切相關的化合物混合組成(family)情況下，對其應用一般的閾值存在困難。針對此，該指南就如何設定閾值和如何論證雜質(zhì)譜給出了具體指導(表6)，但同時特別強調(diào)，該指南不可回顧性使用，即不適用于已完成注冊上市銷售的產(chǎn)品，但可作為歐洲藥典專論修訂的重要參考。

3.2 分離檢測

氨基糖類抗生素在常規(guī)反相色譜柱中不保留，為了增加色譜保留，應在流動相中添加離子對試劑，目前國內(nèi)外藥典中常用的離子對試劑主要采用多氟酸及烷基磺酸鈉兩類。近年來，LC-MS是目前快速推定檢出雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的最有效手段，對于上述兩類流動相，因高濃度的多氟酸嚴重抑制質(zhì)譜離子化信號以及烷基磺酸鈉無法揮發(fā)等因素，無法將現(xiàn)有的藥典色譜條件直接應用于LC-MS，限制了對藥典色譜條件下檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定。

可能由于受當時技術的限制，早期文獻更多關注的是雜質(zhì)的檢出以及對檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定，LC-MS的色譜條件包括以下幾類，(1)采用低濃度的多氟酸流動相[27]；(2)在多氟酸流動相中添加醋酸銨[28]；(3)采用高pH值的氨水-醋酸流動相[29-31]，(4)通過衍生化增加氨基糖苷類抗生素的極性實現(xiàn)LC-MS的分離和檢測[32]。

后來，隨著監(jiān)管部門對雜質(zhì)譜研究要求的提高，需要推定質(zhì)量標準流動相條件下檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對于中國藥典中的多氟酸流動相，袁耀佐等[33]采用TFA-Fix技術，消除三氟乙酸對質(zhì)譜信號的抑制，再后來有巧妙的通過直接在多氟酸流動相添加微量丙酸的方法，在待測物質(zhì)色譜行為無明顯改變的前提下，實現(xiàn)將LC-ELSD的色譜條件直接應用于LC-MS[34]，實踐中發(fā)現(xiàn)，這兩種方法對質(zhì)譜儀器污染嚴重，維護成本較高，且對儀器靈敏度等也有一定的影響，后來有報道[35]通過在質(zhì)譜前串接陰離子滲透膜，成功的在線去除流動相中的多氟酸離子對試劑，實現(xiàn)LC-ELSD與LC-MS的無縫轉(zhuǎn)換，江蘇省食藥檢院在國家評價性抽驗過程也應用該項技術成功地完成了奈替米星、核糖霉素及新霉素的雜質(zhì)譜研究工作。

但是對于烷基磺酸鈉類流動相，其與LC-MS的無縫轉(zhuǎn)換技術還未見報道，有文獻報道[36]，采用最傳統(tǒng)的收集洗脫色譜峰，然后在另外的LC-MS系統(tǒng)中測定其質(zhì)譜信息的辦法，實現(xiàn)對歐洲藥典色譜條件下慶大霉素中檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定，這也可以理解為手動的柱切換。

3.3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推定

表6 EMA抗生素有關物質(zhì)標準制訂指導原則中對報告、鑒定和界定的閾值Tab.6 Reporting,identification and qualification thresholds in guideline on setting specifications for related impurities in antibiotics of EMA

圖6 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推定基本線路圖Fig.6 Sketch paths of deduction of chemical structures of impurities

目前，推定雜質(zhì)檢出雜質(zhì)結(jié)構(gòu)思路基本如圖6所示，該思路也稱為“診斷碎片離子延伸推斷策略(diagnostic fragment ion based extension strategy)”[37]。該策略應用的前提是通過對母體化合物及類似結(jié)構(gòu)已知雜質(zhì)的質(zhì)譜裂解途徑的分析，歸納出其裂解規(guī)律，然后按此規(guī)律，對未知雜質(zhì)的質(zhì)譜碎片離子可能的構(gòu)成進行推測，進而推定可能的結(jié)構(gòu)。對氨基糖苷抗生素質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究文獻很多[38-41]，對相關品種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的推定的文獻更多[42-51]，限于篇幅，本文不做具體展開。另外，李正義等[52]還利用同樣的思路，綜合運用1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC和HMBC一維和二維核磁共振技術，詳細對比研究了依替米星、1,3-二-N-乙基慶大霉素C1a和1,6'-二-N-乙基慶大霉素C1a的結(jié)構(gòu)特點，尤其是乙基所處不同氨基位點對于鄰近碳氫化學位移的影響，建立了一種快速、準確分析氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)的方法。

3.4 雜質(zhì)制備及結(jié)構(gòu)確證

LC-MS主要用于雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的快速推定，但雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的最終確證，還是需要在獲得一定純度的雜質(zhì)后，通過多種波譜分析來確定，如王浩等[53]采用傳統(tǒng)的分離富集純化等手段，成功的鑒定了依替米星中部分雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。后來，李正義等[52]采用半制備型HPLC-ELSD法(柱后分流)的方法，制備了依替米星中的4種微量雜質(zhì)，采用NMR對他們的結(jié)構(gòu)進行了確證。根據(jù)LC-MS推定的結(jié)構(gòu)信息，利用化學反向合成的辦法，是確證半合成氨基糖苷類抗生素雜質(zhì)的另一重途徑。蔣夢虹等[54]采用類似的方法鑒定了卡那霉素中的4個雜質(zhì)。

4 展望

質(zhì)量控制水平的提升，受分析技術整體發(fā)展水平及人們對質(zhì)控理念變化的影響，對于氨基糖苷類抗生素也是如此。就具體質(zhì)量標準的發(fā)展而言，性狀描述會更嚴謹，不遠的將來，有可能參考USP的做法，將性狀項目作為產(chǎn)品的參考消息列入標準，不再作為強制檢驗項目；鑒別項下會更強調(diào)專屬，因此色譜技術應該得到更加廣泛的接受；檢查項下，水分還是干燥失重的選擇以及具體的測定條件優(yōu)化應該受到重視，方法會更為科學；有關物質(zhì)控制的TLC方法應該逐漸被HPLC方法所代替，分離手段會以高柱效的硅膠基質(zhì)的反相色譜為主，也有可能被新的分離機制如HILIC等代替，檢測技術會以直接檢測為目標，但選擇哪種方法會根據(jù)產(chǎn)品本身特點及質(zhì)控目標進行，流動相的優(yōu)化建議借助相關的色譜優(yōu)化軟件進行設計，在保證優(yōu)化質(zhì)量的前提下簡化工作量。隨著科學技術的不斷進步，在質(zhì)控過程中利用快速便捷的儀器分析方法替代繁瑣的抗生素微生物檢定效價法，采用含量替代生物效價(u/mg)作為質(zhì)控指標將成為必然，為保證儀器分析替代抗生素效價測定的轉(zhuǎn)換過程中抗生素臨床劑量的連續(xù)性，明確抗生素中活性物質(zhì)的質(zhì)量(mg)與其效價單位(u)之間的量效關系成為關鍵。

總之，隨著科學技術的發(fā)展，隨著人們對產(chǎn)品關鍵質(zhì)量屬性認識的逐漸深入，隨著標準全球化程度的提高，氨基糖苷類抗生素質(zhì)量控制水平會越來越高。

致謝：感謝陳瑤、馬迪和周丹等幫助收集整理相關資料。