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    一種假單胞菌Pseudomonas sp.導(dǎo)致的側(cè)耳屬細(xì)菌病害*

    2019-12-03 01:49:24柴紅梅張小雷趙永昌蘇開美陳衛(wèi)民
    中國食用菌 2019年11期
    關(guān)鍵詞:假單平菇單胞菌

    柴紅梅,張小雷,趙永昌,蘇開美,陳衛(wèi)民

    (云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,云南 昆明 650205)

    假單胞菌屬細(xì)菌是主要的食用菌病菌,能引起平菇 (Pleurotus ostreatus)、雙孢菇 (Agaricus bisporus)、香菇 (Lentinula edodes)、金針菇 (Flammulina velutipes)等的褐斑病[1-4],其繁殖速度快、傳播范圍較廣,容易給食用菌栽培場造成極大的損失。因此,及時(shí)鑒別危害病菌的種類和特征、較早預(yù)防,可以有效減輕病菌危害。

    在食用菌栽培生產(chǎn)中,目前已知的最為普遍的細(xì)菌性病原菌為托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonas tolaasiiPaine),它能通過產(chǎn)生一種脂多糖類的細(xì)胞外毒素tolaasins,有效地破壞食用菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),致使細(xì)胞破裂[5-6],受感染的子實(shí)體表面發(fā)粘腐爛并發(fā)生褐變。托拉斯假單胞桿菌能侵染多種栽培食用菌,其傳播介體為空氣、土壤、帶病子實(shí)體、昆蟲等,能夠在較短時(shí)間內(nèi)感染子實(shí)體、產(chǎn)生病斑并快速蔓延。除了托拉斯假單胞桿菌,熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)[7]、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)[8]、洋蔥假單胞菌 (Pseudomonas cepaica)[9]、施氏假單胞菌 (Pseudomonas stutzeri)[10]及綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)[11]等也都會(huì)對(duì)不同的食用菌造成比較大的危害。從平菇和雙孢菇中分離到了托拉斯假單胞菌、熒光假單胞菌和Pseudomonas gingeri[12-13]。另外,在河南的杏鮑菇子實(shí)體中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性病害,表現(xiàn)為子實(shí)體畸形,菌肉呈水漬狀,并逐步腐爛,但沒有鑒定出該病原菌的種類[14]。

    盡管已有多種方法被用來進(jìn)行假單胞病原菌的殺滅,包括噴灑二氧化氯、次氯酸鈣及鏈霉素等,但病變發(fā)生后很難徹底控制病原菌,因此提前檢測菇房環(huán)境并進(jìn)行阻斷,更有利于后期的生產(chǎn)開展。統(tǒng)計(jì)病原菌種類,掌握其生物學(xué)特征,特別是DNA序列,可以有效的進(jìn)行類別鑒定。本研究從云南陸良平菇及杏鮑菇種植場分離獲得了2株假單胞桿菌菌株,分離純化后,擴(kuò)增其16S rDNA片段,進(jìn)行序列分析和分類地位分析,為假單胞病原菌在分子水平的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    從云南陸良種植場采集感染病菌的平菇(P.ostreatus)和杏鮑菇(P.eryngii)子實(shí)體,分別挑取一個(gè)染病部位的菌斑置于無菌水中,吸取菌液涂布到酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基(蛋白胨0.2%、酵母粉0.2%、葡萄糖2%、瓊脂粉1.5%,pH自然) 固體平板,培養(yǎng)獲得單菌落,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 PCR擴(kuò)增及序列測定

    用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物對(duì)16SF(5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’) 和 16SR(5’-TACG GTTACCTTGTTACGACTT-3’) 擴(kuò)增菌株的16S rDNA片段。平菇和杏鮑菇樣品所分離的2株病原菌落中,都分別隨機(jī)挑選3個(gè)菌落,進(jìn)行菌落PCR。反應(yīng)體系為:2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL(天根生化科技有限公司),10 μmol·L-1引物各2 μL,DNA模板1 μL,無菌去離子水補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增在BIO-RAD公司的C1000TM Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行,程序如下:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性 30 s,50℃退火 30 s,72℃延伸 1 min 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,對(duì)符合預(yù)測大小的片段膠回收后進(jìn)行測序。本試驗(yàn)所用引物的合成及PCR產(chǎn)物序列測定均在昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成。

    1.3 序列特征及聚類分析

    采用DNAStar軟件包SeqMan程序?qū)λ?6S rDNA序列進(jìn)行拼接,并提交GenBank進(jìn)行Blast搜索,從而獲得近緣種的相似序列。采用ClustalX程序比對(duì)拼接序列,去除兩端長短不一和模糊的部分,使序列長度基本一致。采用Mega 4軟件中的鄰接法(Neighbor JoiningAnalysis,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在分析過程中,將Alignment序列中出現(xiàn)的空缺視為信息丟失。采用自舉法進(jìn)行分支支持率分析,設(shè)1000次重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)菌侵染子實(shí)體特征

    在云南陸良種植場出現(xiàn)了大面積的平菇和杏鮑菇病害,從圖1可以看出,平菇顯現(xiàn)出褐腐病特征,受感染子實(shí)體表面發(fā)粘,出現(xiàn)淡乳白色菌落,然后子實(shí)體發(fā)軟萎縮,并且發(fā)生褐變;杏鮑菇子實(shí)體發(fā)病時(shí)表面先出現(xiàn)水漬狀的斑點(diǎn),從里到外腐爛并滲出淡褐色液體,之后整個(gè)子實(shí)體完全消解。另外,該病原感染初期還能造成原基的發(fā)育畸形。

    圖1 病原菌株P(guān)seudomonas sp.造成的平菇(A) 和杏鮑菇(B) 病害Fig.1 Diseases of Pleurotus ostreatus(A)and Pleurotus eryngii(B)caused by Pseudomonas sp.

    2.2 病原菌的分離及分子鑒定

    所采集的病原菌經(jīng)稀釋、平板涂布后挑取單菌落。從平菇和杏鮑菇所獲病原菌菌落中,各隨機(jī)選擇3個(gè)菌落進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

    圖2 病原菌株P(guān)seudomonas sp.的16S rDNA核酸序列Fig.2 16S rDNA sequences of Pseudomonas sp.

    使用特異性引物16S F/R,每個(gè)菌株擴(kuò)增獲得1個(gè)特異性片段,膠回收后進(jìn)行測序。片段含有800多個(gè)堿基,去除兩端模糊序列后,序列長度為734 bp(圖2)。Clustal X比對(duì)發(fā)現(xiàn),從平菇及杏鮑菇分離到的病原菌菌株的16S rDNA序列完全一致,表明它們?yōu)橥粋€(gè)種。序列提交GeneBank blastn分析顯示,與假單胞屬各近似物種的相似度從99.26%到99.56%。根據(jù)16S rDNA分析,可確定所獲病原菌為假單胞菌屬,但不能確定具體種。

    2.3 病原菌株的系統(tǒng)分析

    所分離病原菌Pseudomonassp.與同屬近緣種的16S rDNA序列作聚類分析(圖3),結(jié)果顯示其與P.gessardii、P.fluorescens、P.reactans、P.azotoformans等物種能更好的聚在一起,而與常見的P.tolaasii親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    圖3 Pseudomonas 16S rDNA系統(tǒng)聚類圖Fig.3 Phylogeny of Pseudomonas based on 16S rDNA

    3 結(jié)論

    假單胞菌屬多種菌為食用菌的主要細(xì)菌性病原菌,這些病原菌具有傳播范圍廣、發(fā)病速度快等特點(diǎn),給栽培場帶來極大的危害??焖勹b定病原菌種類并提前預(yù)防可以有效減輕危害帶來的損失,而利用核酸序列進(jìn)行分析是一個(gè)快捷鑒定病原菌的途徑。16S rDNA核酸片段測定已經(jīng)被廣泛用于細(xì)菌物種鑒定,因此本研究使用該方法來對(duì)病原菌株進(jìn)行鑒定。此外,由于細(xì)菌通過形態(tài)難以進(jìn)行區(qū)分,還需要后續(xù)的生理生化試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

    本研究中從平菇和杏鮑菇感染子實(shí)體中分離了假單胞病原菌株P(guān)seudomonassp.,其16S rDNA序列與其他假單胞菌屬真菌相似性最高為99.56%,而聚類結(jié)果表明,它與P.gessardii、P.fluorescens、P.reactans、P.azotoformans等物種的親緣性大于P.tolaasii。目前并不能確定這個(gè)菌株為假單胞屬的哪一個(gè)種,其具體的分類地位仍需后續(xù)的生理生化試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

    根據(jù)序列分析結(jié)果,本研究中所獲得的菌株異于常見的托拉斯假單胞菌,而且該菌能侵染平菇及杏鮑菇,說明其寄主具有廣泛性。以前的研究極少有杏鮑菇病原菌相關(guān)報(bào)道,在此次的研究中,發(fā)現(xiàn)并鑒定了假單胞菌相關(guān)種侵染杏鮑菇并造成病害的相關(guān)特征,為杏鮑菇的種植及病害防治提供了有用的信息。至于其它地區(qū)關(guān)于杏鮑菇病害特征的描述,由于缺乏核酸信息等方面的證據(jù),不能判斷是否為假單胞菌屬相關(guān)物種所造成[14],需要進(jìn)一步予以證實(shí)。這是從杏鮑菇分離到假單胞菌為數(shù)不多的相關(guān)研究之一,給相關(guān)病原菌的鑒定及防治提供了有效支撐,同時(shí)也為食用菌細(xì)菌性病害研究提供了重要的信息。

    此外,根據(jù)該病原菌與同屬其它種的16S rDNA序列相似度比對(duì)來看,假單胞菌作為食用菌的主要病害,其各個(gè)種極為相似,因而需要結(jié)合生理生化特征對(duì)該屬物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,并明確各個(gè)種的寄主和造成病害的特征,以便為病害的鑒定及防治提供指導(dǎo),減輕病原菌給食用菌種植帶來的危害。

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