不同生態(tài)因子對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

蓋春蕾，許 拉 ，樊 英，于曉清，葉海斌，王 西，曹海鵬

( 1.山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266002； 2.上海海洋大學(xué)，國家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306 )

鹵蟲(Artemia)無節(jié)幼體卵黃含有較多蛋白質(zhì)和脂肪，是水產(chǎn)育苗過程中必不可少的生物餌料，占育苗成本的50%～70%，深受蝦苗場(chǎng)的重視[1]。近年來，我國在鹵蟲的繁殖、鹵蟲卵的孵化技術(shù)及其作為生物餌料對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)用研究方面做了大量的工作[2-9]。然而，鹵蟲卵孵化出無節(jié)幼體過程中，其孵化水體(暫名：鹵蟲卵孵化水體)中易滋生大量弧菌(Vibrio)，導(dǎo)致鹵蟲無節(jié)幼體受弧菌污染問題越來越突出，嚴(yán)重影響了作為水產(chǎn)種苗生物餌料的鹵蟲質(zhì)量，而影響鹵蟲卵孵化的鹽度、pH、孵化密度等一些重要生態(tài)因子[10]對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響卻鮮有報(bào)道，這極大地阻礙了優(yōu)質(zhì)鹵蟲的生產(chǎn)進(jìn)程。鑒此，本試驗(yàn)觀察了脫殼時(shí)間、鹽度、pH、抑菌微生物制劑、孵化密度等生態(tài)因子對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響，以期為優(yōu)質(zhì)鹵蟲的培育奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹵蟲卵(無棣海吉水產(chǎn)有限公司)；漂白液(江西草珊瑚消毒用品有限公司)；硫代硫酸鈉溶液，有效含量為2%(上海傲之珊實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板(上海綠奧生物科技有限公司)；碳酸鈉[國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司]；抑菌微生物制劑，主要成為為復(fù)合抑菌微生物(上海綠奧生物科技有限公司)；海水晶(浙江藍(lán)海星制品有限公司)；根據(jù)海水晶說明書配制的鹽度為15、20、25、30、35的人工海水，均于121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2 脫殼液的配制

參照文獻(xiàn)[5]的方法配制。即425 g干蟲卵對(duì)應(yīng)的脫殼液組成為漂白液1700 mL、氫氧化鈉30 g、水3400 mL。具體配制用量根據(jù)鹵蟲卵的質(zhì)量計(jì)算。

1.3 脫殼時(shí)間對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理5、10、15、20、25 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度20、pH 8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測(cè)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。弧菌密度的檢測(cè)方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.4 鹽度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度分別為15、20、25、30、35，pH為8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測(cè)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測(cè)方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.5 pH對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度為20，pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測(cè)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。弧菌密度的檢測(cè)方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.6 抑菌微生物制劑對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

參照文獻(xiàn)[11]建議的1 g/L孵化密度將鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，接著用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度為20，終質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的抑菌微生物制劑，pH為8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，在孵化24 h后檢測(cè)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測(cè)方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.7 孵化密度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

將孵化密度分別0.25、0.5、1、2、4 g/L的鹵蟲卵在脫殼液中進(jìn)行脫殼處理10 min，隨后用硫代硫酸鈉溶液去除余氯，然后將鹵蟲脫殼卵放入鹽度20、pH 8.0的人工海水中，置于30 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱并利用小型增氧機(jī)進(jìn)行恒溫增氧孵化，孵化24 h后，檢測(cè)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度?；【芏鹊臋z測(cè)方法采用稀釋涂布硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan′s檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 脫殼時(shí)間對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

脫殼處理10 min時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(3.4×104cfu/mL)，分別較在脫殼處理5、15、20、25 min后的鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少22.87%(P>0.05)、79.56%(P<0.05)、73.94%(P<0.05)和65.50%(P>0.05)(圖1)。因此，脫殼處理10 min更有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

圖1 脫殼時(shí)間對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響圖中小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).下同.

2.2 鹽度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

鹽度為35時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(5.6×104cfu/mL)，分別較鹽度為15、20、25、30時(shí)的鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少69.89%(P<0.05)、93.92%(P<0.05)、94.97%(P<0.05)和6.47%(P>0.05)(圖2)。因此，鹽度為35時(shí)有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

2.3 pH對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

pH為9.0時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(7.5×103cfu/mL)，分別較pH為7.0、7.5、8.0、8.5時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少46.43%(P>0.05)、39.02%(P>0.05)、98.12%(P<0.05)和93.12%(P<0.05)(圖3)。因此，pH為9.0時(shí)更有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

圖2 鹽度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

圖3 pH對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

2.4 抑菌微生物制劑對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

抑菌微生物制劑使用時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度顯著降低。抑菌微生物制劑在用量為0.2～1.0 mg/L時(shí)，鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度較對(duì)照組減少70.12%～74.27%(P<0.05)(圖4)。其中，抑菌微生物制劑用量為1.0 mg/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(4.5×104cfu/mL)，分別較用量為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少2.83%(P>0.05)、9.42%(P>0.05)、13.87%(P>0.05)和1.54%(P>0.05)。因此，抑菌微生物制劑的使用有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

2.5 孵化密度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖5。孵化密度為0.25 g/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低(1.2×104cfu/mL)，分別較孵化密度為0.50、1、2、4 g/L時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度減少32.79%(P>0.05)、96.42%(P<0.05)、95.55%(P<0.05)和99.12%(P<0.05)。因此，孵化密度為0.25 g/L更有利于減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度。

圖4 抑菌微生物制劑對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

圖5 孵化密度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響

3 討 論

鹵蟲卵孵化出的無節(jié)幼體應(yīng)用于水產(chǎn)育苗已經(jīng)納入了我國水產(chǎn)育苗技術(shù)規(guī)范(GB/T 30890—2014)，但有報(bào)道指出，鹵蟲卵孵化過程中的弧菌滋生增加了水產(chǎn)種苗弧菌污染的風(fēng)險(xiǎn)[12]。因此，鹵蟲卵孵化水體中弧菌滋生對(duì)鹵蟲無節(jié)幼體的污染問題必須予以重視。這是國內(nèi)首次報(bào)道不同生態(tài)因子對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響，本研究對(duì)優(yōu)質(zhì)鹵蟲的培育、減少弧菌對(duì)鹵蟲的污染具有指導(dǎo)意義。

3.1 脫殼時(shí)間

脫殼是鹵蟲卵孵化的重要步驟。由于脫殼卵較不脫殼卵具有更高的孵化率，所以生產(chǎn)上通常對(duì)鹵蟲卵進(jìn)行脫殼處理。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹵蟲卵在脫殼時(shí)間為10 min時(shí)其孵化水體中弧菌密度最低，但水體中弧菌密度的變化未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，尤其是脫殼時(shí)間在15～25 min時(shí)，水體中弧菌密度反而增加。究其原因，可能是因?yàn)槊摎r(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致死卵增多，死卵含有豐富的蛋白質(zhì)，其腐化分解進(jìn)而導(dǎo)致孵化過程中水體弧菌滋生。研究表明，鹵蟲卵在脫殼時(shí)間為10 min和15 min時(shí)孵化率較高[11]。因此，為了生產(chǎn)上既要達(dá)到高孵化率，同時(shí)又要減少鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度，建議脫殼時(shí)間選取10 min。

3.2 鹽度、pH

鹵蟲脫殼卵在不同鹽度的水體中的孵化率不同。廖永巖等[11]認(rèn)為，鹵蟲卵可以通過改變自身的代謝狀況適應(yīng)不同鹽度的水體，并指出，鹵蟲脫殼卵在鹽度為35時(shí)孵化率最高。此外，pH對(duì)鹵蟲卵孵化也具有重要的影響。一般情況下，鹵蟲卵在孵化時(shí)，對(duì)孵化用水的pH要求在7.5～11.0，最佳pH為8.5～11.0[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽度為35、pH為9的鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度最低。因此，考慮到生產(chǎn)上既要達(dá)到高孵化率，同時(shí)又要盡量減少鹵蟲卵孵化水體中弧菌的污染，建議孵化用水的鹽度選取35、pH選取9。

3.3 抑菌微生物制劑

鹵蟲對(duì)水產(chǎn)用化學(xué)殺菌劑極其敏感。薛俊增等[15]研究表明，硫酸鋅、硫酸銅對(duì)鹵蟲的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.55、0.05 mg/L。因此，生產(chǎn)上一般不采用化學(xué)殺菌劑處理鹵蟲卵孵化水體中的弧菌，這也是本試驗(yàn)選取安全無毒的抑菌微生物制劑對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌進(jìn)行處理的原因。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，抑菌微生物制劑在用量為0.2～1.0 mg/L時(shí)，使鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度降低了70.12%～74.27%。根據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《漁藥臨床試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》中關(guān)于養(yǎng)殖環(huán)境改良劑效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]，能使主要指標(biāo)改善50%以上為顯效，10%～40%為有效，10%以下為無效，說明抑菌微生物制劑對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的控制效果為顯效?？紤]到生產(chǎn)上抑菌微生物制劑的使用成本，建議用量為0.2 mg/L。

3.4 孵化密度

鹵蟲卵在生產(chǎn)上的孵化都是在高密度下進(jìn)行的[17]，但高孵化密度并不一定產(chǎn)生高孵化率。趙乃剛[18]觀察了不同孵化密度(0.1～2 g/L)對(duì)鹵蟲卵孵化率的影響，結(jié)果表明，以0.1 g/L時(shí)的孵化率最高，說明孵化密度低更有利于提高鹵蟲卵的孵化率。此外，在鹵蟲卵孵化過程中空氣等介質(zhì)向鹵蟲卵孵化水體中引入了大量弧菌[19]。由于鹵蟲卵含有豐富的蛋白質(zhì)[20]，鹵蟲卵殼也是一種含鐵脂蛋白，含有58.91%蛋白質(zhì)和多種無機(jī)元素[21]，鹵蟲卵在孵化過程中因孵化密度高導(dǎo)致出現(xiàn)大量死卵與積累的鹵蟲卵殼，這無疑為弧菌滋生提供了豐富的營養(yǎng)，極易使弧菌在條件適宜的孵化水體中快速繁殖起來。因此，應(yīng)該考慮孵化密度對(duì)鹵蟲卵孵化水體中弧菌密度的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在孵化密度最小(0.25 g/L)時(shí)鹵蟲卵孵化水體中的弧菌密度最低，再加上孵化密度低更有利于提高鹵蟲卵的孵化率[18]，故為了提高孵化率，減少鹵蟲卵孵化水體中的弧菌污染，建議生產(chǎn)上選擇低孵化密度。