虎皮魚熱激蛋白PtHsp70基因序列與低溫表達(dá)分析

劉麗麗，王曉雯，朱建亞，張 蓉，朱 華，田照輝

( 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068 )

熱激蛋白(HSP)是一類在不同生命形式間高度保守的蛋白質(zhì)[1]，能夠抵御環(huán)境壓力、促進(jìn)細(xì)胞生長[2]。熱激蛋白家族根據(jù)蛋白序列同源性和分子質(zhì)量，可以分為HSP40、HSP70、HSP90、HSP100和HSP110等，其中HSP70蛋白主要以胞內(nèi)分子伴侶的形式參與蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞生長、存活和凋亡過程發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。部分Hsp70基因沒有內(nèi)含子，這使得開始啟動轉(zhuǎn)錄就可產(chǎn)生成熟的mRNA以適應(yīng)Hsp70基因大量快速表達(dá)的需要，阻止應(yīng)激源對其mRNA前體的影響[5]，這促進(jìn)了HSP70蛋白作為環(huán)境脅迫分子標(biāo)志物的研究。在溫度刺激、重金屬脅迫、自由基攻擊和微生物感染等環(huán)境下，HSP70蛋白能夠迅速并準(zhǔn)確響應(yīng)，因此作為響應(yīng)外界環(huán)境刺激的生物標(biāo)志物得到深入研究[3]。

魚類屬于變溫動物，極易受溫度等環(huán)境影響，HSP蛋白在魚類應(yīng)對溫度變化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]?；⑵~(Puntiustetrazona)原產(chǎn)于印度尼西亞的蘇門答臘島、加里曼丹島和馬來西亞的內(nèi)陸水域，體型為典型的紡錘形，側(cè)扁，長5～7 cm。體表淺黃色，上覆四條垂直的濃黑色條紋，似虎紋，故名虎皮魚?；⑵~吻部和各鰭呈紅色，相映成趣，群游，性情活潑、行動敏捷，是廣受市場歡迎的小型熱帶魚。虎皮魚是狹溫?zé)釒~類，對溫度變化十分敏感，適宜水溫為23～28 ℃，溫度降低則影響其繁殖、攝食和生存。HSP70蛋白是魚類中研究廣泛的一類熱激蛋白。目前已從廣溫魚類草魚(Ctenopharyngodonidella)[3]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[7]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[8]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[9]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[10]、達(dá)氏鰉(Husodauricus)[11]等，冷水魚類施氏鱘(Acipenserschrenckii)[12]、銀海鯛(Sparussarba)[13]等和少數(shù)熱帶魚類斑馬魚(Daniorerio)[14]、黃雀鯛(Pomacentrusmoluccensis)等擴(kuò)增到Hsp70基因的cDNA序列，但是Hsp70基因在虎皮魚體內(nèi)的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)機(jī)制尚未見報(bào)道。

在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，虎皮魚Hsp70(PtHsp70)基因mRNA水平可能受到低溫脅迫的影響(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。為此，筆者克隆PtHsp70基因cDNA的完整編碼序列，分析序列同源性，預(yù)測其編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu)，通過qRT-PCR技術(shù)檢測分析PtHsp70基因在不同組織中的特異性表達(dá)，分析低溫脅迫下PtHsp70基因表達(dá)水平的變化，探明PtHsp70基因在成年虎皮魚體內(nèi)存在的表達(dá)特征。

1 材料和方法

1.1 虎皮魚梯度低溫脅迫試驗(yàn)

試驗(yàn)用虎皮魚購自虎皮魚漁場(山東棗莊)，在本實(shí)驗(yàn)室完成馴化，并長期養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件為：水溫25～27 ℃，pH 6.5～7.4，kH 6～7，24 h不間斷通氧，水體循環(huán)過濾，每日喂食商品干飼料2次。

挑選體型大小相近、健康活潑的8月齡虎皮魚150尾，用于梯度低溫脅迫試驗(yàn)。將150尾虎皮魚隨機(jī)分為5個養(yǎng)殖缸，每個養(yǎng)殖缸30 L，含有30尾虎皮魚。試驗(yàn)第1 d水溫保持為27 ℃，次日起每24 h降低溫度如下：△T1=4 ℃/d，△T2=4 ℃/d，△T3=4 ℃/d，△T4=2 ℃/d，其他條件維持不變。直至水溫降至13 ℃，繼續(xù)處理24 h，結(jié)束低溫脅迫試驗(yàn)。每個溫度處理結(jié)束后，每缸隨機(jī)取3尾虎皮魚，立即解剖用于總RNA提取，試驗(yàn)共5個生物學(xué)平行。

1.2 總RNA提取

分別對27、23、19、15、13 ℃處理24 h后的虎皮魚提取總RNA。間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉后，解剖分別取其腦、鰓、肝臟和肌肉組織，同種組織混合存放，立即使用RNAiso Plus(TaKaRa公司，D9108A)試劑提取總RNA，操作按照試劑說明書進(jìn)行。Nanodrop2000核酸蛋白濃度檢測儀測定總RNA含量和污染情況，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA第一鏈合成與保守序列克隆

以各組織總RNA為模板，采用1st strand cDNA合成試劑盒(TaKaRa公司，6110A)合成cDNA第一鏈，操作方法按照試劑說明書進(jìn)行。Nanodrop2000核酸蛋白濃度檢測儀測定cDNA合成產(chǎn)物濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中報(bào)道的魚類Hsp70基因cDNA保守序列，設(shè)計(jì)引物HSP70CDS-F和HSP70CDS-R(表1)，Ex Taq酶(TaKaRa公司，DRR001A)PCR擴(kuò)增獲得PtHsp70基因cDNA部分序列。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后送交擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.4 RACE克隆

基于得到的PtHsp70基因cDNA部分保守序列，Primer3Web(http:∥primer3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)引物HSP70-GSP1和HSP70-GSP2，用于5′RACE和3′RACE。采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech，634858)試劑盒，按照說明書配制反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別克隆得到PtHsp70基因cDNA的5′和3′ RACE產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，凝膠DNA回收試劑盒(TaKaRa公司，9762)回收目的條帶DNA，送交擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，采用SeqMan軟件對測序片段與得到的PtHsp70基因cDNA部分保守序列進(jìn)行拼接。

1.5 序列結(jié)構(gòu)分析

拼接序列經(jīng)Blastn在線(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，結(jié)果表明該序列與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫公布的Hsp70基因mRNA序列具有高度同源性；使用Clustal X 2和DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比對，ORF Finder在線(http:∥www.expasy.ch/tools/)預(yù)測開放閱讀框和編碼氨基酸序列。BLASTP在線(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進(jìn)行氨基酸序列比對和結(jié)構(gòu)分析(數(shù)據(jù)庫：CDSEARCH/cdd v3.16 ，2018年4月26日)。

1.6 實(shí)時熒光定量qRT-PCR

以本研究中獲得的腦、鰓、肝臟和肌肉組織cDNA為模板，根據(jù)獲得的PtHsp70基因cDNA序列，Primer3Web(http:∥primer3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)引物HSP70-qF和HSP70-qR用于熒光定量PCR(表1)。熒光定量PCR試驗(yàn)以虎皮魚Gapdh基因?yàn)閮?nèi)參基因，使用天根熒光定量PCR試劑盒(FP209)，ABI StepOne Plus儀器收集熒光信號。

2 結(jié) 果

2.1 PtHsp70基因cDNA全序列結(jié)構(gòu)分析

本研究克隆到的序列經(jīng)過測序、拼接和序列比對，發(fā)現(xiàn)與斑馬魚、鯉魚、鯽魚(Carassiusauratus)、光唇魚(Acrossocheilusfasciatus)和齊口裂腹魚Hsp70基因cDNA全序列的相似度分別為94%、91%、91%、91%和90%，確認(rèn)該序列為PtHsp70基因cDNA序列(表2)。全長2317 bp，其中5′非編碼區(qū)長120 bp，3′非編碼區(qū)長266 bp，編碼區(qū)長1932 bp，對應(yīng)的開放閱讀框?yàn)?21～2052 bp，編碼643個氨基酸。

表1 本研究所用引物信息表

表2 PtHsp70基因cDNA序列BLAST比對結(jié)果

將PtHsp70基因編碼區(qū)與鯉魚、鯽魚、斑馬魚Hsp70基因編碼區(qū)序列進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)其序列相似性為95.43%(圖1)，表明PtHsp70基因編碼序列高度保守。

2.2 氨基酸序列預(yù)測與結(jié)構(gòu)分析

研究預(yù)測PtHsp70基因cDNA序列共翻譯643個氨基酸，其中親水性氨基酸215個，疏水性氨基酸161個，虎皮魚HSP蛋白分子量為70.54975 ku，等電點(diǎn)為5.375(圖2)。SMART分析顯示，虎皮魚HSP蛋白氨基酸序列含有典型的蛋白結(jié)構(gòu)域coiled coil(514～536 aa)。

虎皮魚HSP70蛋白的氨基酸序列包含典型的熱激蛋白保守結(jié)構(gòu)域，例如核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)、BAG/HSP70結(jié)合位點(diǎn)、NEF/HSP70結(jié)合位點(diǎn)等(圖3)?；⑵~HSP70蛋白氨基酸序列與已經(jīng)公布的HSP70蛋白質(zhì)一級序列具有高度相似性(表3)，表明PtHsp70基因高度保守。

2.3 PtHsp70基因mRNA組織特異性與溫度誘導(dǎo)表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果表明，PtHsp70基因mRNA在成年虎皮魚的腦、鰓、肝臟和肌肉組織中的表達(dá)水平各不相同(圖4a)。在腦組織中，PtHsp70基因mRNA含量最低，鰓組織PtHsp70基因mRNA含量是腦組織的2.1倍(P<0.01)，肌肉組織PtHsp70基因mRNA含量是腦組織的19.8倍(P<0.01)，虎皮魚肝臟組織中PtHsp70基因mRNA含量最高，是腦組織的78.8倍(P<0.01)。研究表明，PtHsp70基因mRNA在虎皮魚體內(nèi)的表達(dá)水平具有明顯的組織特異性，表達(dá)水平依次為肝臟>肌肉>鰓>腦(圖4a)。

在低溫脅迫環(huán)境下，虎皮魚腦、鰓和肌肉組織PtHsp70 mRNA水平均表現(xiàn)為顯著上調(diào)(圖4b)。其中，腦組織PtHsp70基因mRNA水平在15、13 ℃條件下分別為對照組的15.3、18.6倍(P<0.01)；鰓組織PtHsp70基因mRNA水平在15、13 ℃條件下分別是對照組的2.8和5.3倍(P<0.01)；肌肉組織19、15、13 ℃處理組PtHsp70基因mRNA水平分別是對照組的8.8、10.9和15倍(P<0.01)。而在肝臟組織中，隨著溫度降低，PtHsp70基因表達(dá)水平呈先降后升的趨勢，當(dāng)溫度至23 ℃和19 ℃時，mRNA水平與對照組相比變化不顯著，當(dāng)溫度繼續(xù)降至15 ℃時，mRNA水平僅為對照組0.4倍，溫度繼續(xù)降至13 ℃時，PtHsp70基因mRNA表達(dá)水平反而呈上升趨勢，是對照組的1.5倍(P<0.01)。

圖1 Hsp70基因cDNA序列比對結(jié)果

圖2 虎皮魚HSP蛋白氨基酸序列預(yù)測

圖3 虎皮魚HSP70蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)預(yù)測

名稱登錄號描述序列位置E值PTZ00009PTZ00009熱激蛋白70 ku3～6430e+00HSP70pfam00012HSP70蛋白8～6140e+00HSPA1-2_6-8-like_NBDcd10233HSPA1-A/-B/-L/HSPA-2等的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域8～3830e+00prok_dnaKTIGR02350細(xì)菌分子伴侶蛋白DnaK (HSP70蛋白)8～6140e+00DnaKCOG0443大腸桿菌分子伴侶DnaK (HSP70蛋白) 1～6140e+00

圖4 PtHsp70基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平定量分析a.虎皮魚腦、鰓、肝臟和肌肉組織PtHsp70基因mRNA表達(dá)水平定量分析，其中以腦組織為對照組，所有樣品處理溫度均為27 ℃；b.低溫脅迫下虎皮魚各組織PtHsp70基因mRNA表達(dá)水平定量分析，每個組織中以27 ℃處理組作為對照組. 圖中所有數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差. *表示與對照組有顯著差異(P<0.01).

3 討 論

3.1 PtHsp70基因cDNA與氨基酸序列

HSP70蛋白家族被兩種不同的基因編碼，一種是組成型的Hsc70基因，一種是誘導(dǎo)型的Hsp70基因，兩種基因的編碼蛋白均作為分子伴侶發(fā)揮重要作用，通常認(rèn)為誘導(dǎo)型Hsp70基因在機(jī)體和細(xì)胞應(yīng)對溫度脅迫的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。魚類中也存在組成型和誘導(dǎo)型的HSP70蛋白，特別是在冷水魚類和極地魚類中，普遍存在兩種類型的HSP70蛋白，分別被組成型Hsc70基因和誘導(dǎo)型Hsp70基因編碼[15-17]。而在熱帶魚類和溫帶魚類中發(fā)現(xiàn)的HSP70蛋白與其他脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的熱誘導(dǎo)型HSP70蛋白高度同源，相似性達(dá)到75%～80%，因此普遍認(rèn)為魚類HSP70蛋白屬于熱誘導(dǎo)型HSP70蛋白家族[18]。本研究克隆到含有完整編碼區(qū)的虎皮魚Hsp70(PtHsp70)基因，其cDNA序列高度保守，與斑馬魚、鯉魚、鯽魚、光唇魚等鯉科魚類的Hsp70基因cDNA序列相似度超過90%，其中與斑馬魚相似度最高(94%)，因此推測本研究克隆到的PtHsp70基因cDNA與斑馬魚、鯉魚、鯽魚等的Hsp70基因同源。本研究預(yù)測PtHsp70基因cDNA序列共翻譯643個氨基酸，全序列包含典型的熱激蛋白保守結(jié)構(gòu)域，例如核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域、BAG/HSP70結(jié)合位點(diǎn)、NEF/HSP70結(jié)合位點(diǎn)等。

3.2 PtHsp70的組織特異性表達(dá)

當(dāng)受到外界刺激時，細(xì)胞中組成型Hsc70基因轉(zhuǎn)錄本水平不變或略有上升，而誘導(dǎo)型Hsp70基因從本底水平被大幅誘導(dǎo)表達(dá)，這一過程由熱激因子1(HSF1)三聚體結(jié)合到Hsp70基因啟動子區(qū)域介導(dǎo)[13]。本研究檢測了PtHsp70基因在虎皮魚不同組織中的本底表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PtHsp70基因表達(dá)水平具有組織特異性，在肝臟和肌肉中的表達(dá)水平高于腦和鰓組織。

本研究中，虎皮魚肝臟PtHsp70基因mRNA本底表達(dá)水平非常高，是腦組織的78.8倍，表明PtHsp70基因在虎皮魚肝臟中有較高的本底表達(dá)水平。此前曾有報(bào)道，在伯氏肩孔南極魚(Trematomusbernacchii)、博氏南冰(Pagotheniaborchgrevinki)、南極綿鳚(Lycodichthysdearborni)等南極抗凍魚中[19]，Hsp70基因普遍表現(xiàn)為高水平的組成型表達(dá)，從而在魚類應(yīng)對長期低溫環(huán)境中發(fā)揮重要作用。HSP蛋白主要發(fā)揮分子伴侶的作用，幫助蛋白折疊[20]，輔助多聚蛋白復(fù)合體組裝和解聚[21]，參與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)[22]和降解[23]，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]等。當(dāng)HSP70蛋白處于二磷酸腺苷結(jié)合態(tài)時，對多肽底物有高親和力，結(jié)合多肽底物；而當(dāng)HSP70蛋白處于三磷酸腺苷結(jié)合態(tài)時，與底物的結(jié)合能力減弱[25-26]。由此推測，虎皮魚肝臟PtHsp70基因高水平本底表達(dá)模式是為適應(yīng)肝臟作為主要代謝器官，及時應(yīng)對各種環(huán)境脅迫的需要。

3.3 低溫脅迫下PtHsp70的誘導(dǎo)型表達(dá)

HSP70蛋白作為分子伴侶，幫助初級多肽鏈正確折疊，介導(dǎo)變性蛋白質(zhì)的修復(fù)和降解，在幫助細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境刺激的過程中發(fā)揮重要作用[27-29]。廣溫性魚類可能通過調(diào)控HSP70蛋白表達(dá)，適應(yīng)棲息環(huán)境溫度變化，以抵御低溫脅迫造成的細(xì)胞和組織損傷，例如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[30]和南亞野鯪(Labeorohita)[31]肌肉組織Hsp70基因mRNA水平在低溫刺激后顯著上升；同樣，低溫刺激下斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)腦組織Hsp70基因表達(dá)上調(diào)[32]，達(dá)氏鰉鰓組織Hsp70基因mRNA水平隨著溫度降低而逐漸升高，4 ℃時達(dá)到峰值[11]。Hsp70基因轉(zhuǎn)錄本水平上升意味著組織中HSP70蛋白合成增加，以抵御細(xì)胞損傷和凋亡。

而在狹溫性魚類中，對HSP70蛋白及其編碼基因的研究還比較少。南極魚類生活在穩(wěn)定的低于-1.9 ℃的環(huán)境中，溫度升高(5～6 ℃)時未檢測到HSP蛋白表達(dá)；黃雀鯛是一種狹溫性熱帶珊瑚魚，高溫(34 ℃)脅迫下，Hsp70、Hsp90、Hsp40等Hsp基因mRNA水平無顯著變化[33]。因此過去認(rèn)為冷水性狹溫魚類可能缺失HSP蛋白[34]，而在熱帶狹溫魚類中表現(xiàn)為組成型表達(dá)，以適應(yīng)長期的熱應(yīng)激環(huán)境[35]。在本研究中，正常條件下狹溫?zé)釒~類虎皮魚Hsp70基因在肝臟中具有較高的本底表達(dá)水平，而低溫脅迫下腦、鰓、肝臟和肌肉組織PtHsp70基因表現(xiàn)為誘導(dǎo)型表達(dá)，表明狹溫?zé)釒~類存在溫度誘導(dǎo)型的Hsp70基因。

以往研究中未見在狹溫性魚類中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型熱激蛋白基因的報(bào)道，一方面可能是因?yàn)楠M溫性魚類的研究比較少，而且這些研究往往集中于極地低溫魚類中，而對狹溫?zé)釒~類的研究非常匱乏；另一方面，組織樣本或脅迫溫度點(diǎn)比較少，如20～21 ℃低溫脅迫下斑馬魚Hsp70基因mRNA轉(zhuǎn)錄本水平無明顯變化[36-37]，而16 ℃低溫脅迫下，斑馬魚熱激蛋白Hsc70基因mRNA水平顯著上調(diào)[38]；最后，HSP蛋白家族基因種類繁多，這些Hsp基因有些屬于溫度誘導(dǎo)型，有些是保守型，例如大黃魚(Pseudosciaenacrocea)17個Hsp70基因中僅2個能被低溫誘導(dǎo)或抑制[39]。已報(bào)道的狹溫魚類Hsp基因僅是其中少數(shù)，所以暫時未發(fā)現(xiàn)溫度誘導(dǎo)型Hsp基因。

虎皮魚不同組織中PtHsp70基因表達(dá)水平均受到溫度影響，在腦、鰓和肌肉組織中，PtHsp70基因mRNA水平隨著溫度降低而逐漸升高，表現(xiàn)為溫度依賴性表達(dá)。因此認(rèn)為，PtHsp70基因具有作為虎皮魚響應(yīng)低溫脅迫分子標(biāo)志物的潛能。

綜上，本研究利用同源克隆和RACE克隆技術(shù)首次在虎皮魚體內(nèi)克隆到PtHsp70基因cDNA全序列，序列全長2317 bp，其中編碼區(qū)長度1932 bp，編碼643個氨基酸，與斑馬魚等鯉科魚類的Hsp70基因cDNA序列高度相似。PtHsp70在虎皮魚肝臟、肌肉、鰓和腦等不同組織中均有表達(dá)，其中在肝臟中的表達(dá)水平最高；PtHsp70基因在虎皮魚不同組織中的表達(dá)水平均能被低溫顯著誘導(dǎo)，具有誘導(dǎo)型表達(dá)的特征。PtHsp70基因在虎皮魚腦、肝臟和肌肉組織中，表現(xiàn)為明顯的溫度依賴性表達(dá)，因此具有作為虎皮魚響應(yīng)低溫脅迫的分子標(biāo)志物的潛能。本研究證明，狹溫?zé)釒~類虎皮魚的Hsp70基因具有組織特異性低溫誘導(dǎo)型表達(dá)的特征。