慢性氨氮脅迫對“新吉富”羅非魚幼魚生長及血清生化指標的影響

唐首杰，劉辛宇，吳太淳，趙金良

( 上海海洋大學，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306 )

“新吉富”羅非魚(Oreochromisniloticus)是上海海洋大學以1994年引入的尼羅羅非魚“GIFT”品系第3代為基礎群體(F0)，歷經(jīng)10年系統(tǒng)選育而成的羅非魚新品種(登記號GS01-001-2005)[12]，至2016年已選育至第20代(F20)。目前，該品種已成為我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的主養(yǎng)品種之一。但隨著羅非魚集約化養(yǎng)殖密度的提高，養(yǎng)殖水體中殘餌、糞便等不斷累積，致使部分地區(qū)羅非魚長期處于較高含量氨氮的養(yǎng)殖環(huán)境中，從而導致其生長性能下降，影響了羅非魚養(yǎng)殖效益[13]。鑒于此，在選育系F20的基礎上，研究氨氮對“新吉富”羅非魚的慢性毒性效應，探索氨氮的慢性脅迫機制已成當務之急。目前，國內(nèi)外學者在尼羅羅非魚慢性氨氮脅迫方面的研究主要集中在氨氮對尼羅羅非魚幼魚生長[8,14-16]、血清及肝臟生理功能影響[14-17]等領域，但慢性氨氮脅迫對“新吉富”羅非魚生長及生理功能的影響尚未見報道。本研究根據(jù)氨氮對“新吉富”羅非魚幼魚的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度(待發(fā)表資料)，采用實驗生態(tài)學方法研究不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫對“新吉富”羅非魚幼魚生長性能及血清生化指標的影響，以期為“新吉富”羅非魚的健康養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗魚為“新吉富”羅非魚選育系F20幼魚，初始體質(zhì)量為(38.6±0.2) g，取自上海海洋大學魚類種質(zhì)研究試驗站。試驗魚用3%氯化鈉和2%碳酸氫鈉消毒，然后放入水族箱暫養(yǎng)14 d以適應環(huán)境。投喂寧波天邦公司生產(chǎn)的羅非魚浮性顆粒飼料，含粗蛋白32%。日飽食投喂2次(9:00，16:00)。氯化銨(純度大于99.5%)購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。

1.2 試驗方法

根據(jù)氨氮對“新吉富”羅非魚幼魚的急性毒性試驗的結(jié)果(待發(fā)表)設定試驗的氨氮質(zhì)量濃度梯度。以96 h半致死質(zhì)量濃度(144.287 mg/L)的10%為慢性脅迫試驗的中間質(zhì)量濃度，將慢性脅迫試驗設4個氨氮質(zhì)量濃度組，其總氨氮質(zhì)量濃度分別為7.22、14.43、28.86、57.72 mg/L，同時以未添加氯化銨的正常飼養(yǎng)用水作為對照組。每組試驗魚15尾，設3個平行組。

試驗于0.60 m×0.45 m×0.40 m的玻璃水族箱(試驗實際水體為64.8 L)中進行。以氯化銨準確配置母液，再按試驗設計分別稀釋成各組試驗液。試驗用水為充分曝氣處理的自來水，連續(xù)24 h充氣，溶解氧6.5～7.2 mg/L，水溫(28.0±1.0) ℃，pH 7.7±0.2，定時用納氏試劑法[18]測定各組總氨氮質(zhì)量濃度，并用母液及時調(diào)整至試驗設定的表觀質(zhì)量濃度。在試驗過程中，每日飽食投喂2次(9：00，16：00)，早晚定時用虹吸管清除糞便，每晚(18：00)定時更換預先配置成相應質(zhì)量濃度、等溫的氯化銨溶液，用飽和碳酸鈉溶液使水的pH維持相對穩(wěn)定。

分別于氨氮暴露的第10、20 d和30 d時自各箱中分別取5尾試驗魚進行生長性狀、血清生化指標分析。測定各項指標前，將試驗魚迅速撈起并投入200 mg/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(Sigma，美國)溶液中進行深度麻醉。

1.2.1 生長性狀測定

分別測定試驗魚的體質(zhì)量、體長、體高等數(shù)據(jù)，按下式計算特定生長率[19]：

特定生長率/%·d-1=[(lnm2-lnm1)/(t2-t1)]×100%

式中，m1、m2分別為時間t1、t2時的體質(zhì)量。

1.2.2 血清生化指標測定

尾靜脈采血后，不加抗凝劑在室溫放置30～40 min，然后3000 r/min，離心10 min，收集上清液。采用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，組織蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，各組間差異用單因素方差分析進行檢驗，并進行Duncan′s多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

本試驗中所提及的氨氮是指水環(huán)境中的總氨氮質(zhì)量濃度，由離子銨和非離子氨組成。通常在計算氨氮的半致死質(zhì)量濃度時還要考慮非離子氨的半致死質(zhì)量濃度。水體中非離子氨在總氨氮中所占的比例與溫度和pH有關(guān)，換算公式如下[20]：

非離子氨質(zhì)量濃度=A/[10(pKa-pH)+1]

pKa=0.09018+2729.92/T

式中，A為總氨氮質(zhì)量濃度，pKa為離解常數(shù)，T為熱力學溫度(T=273+T℃)。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能分析

30 d的慢性氨氮脅迫期間，各組別試驗魚均未出現(xiàn)死亡情況。在整個試驗過程中，隨著氨氮質(zhì)量濃度的升高，各組別試驗魚攝食量呈下降趨勢，其中，低質(zhì)量濃度組(7.22 mg/L)與對照組間攝食量差異不明顯，高質(zhì)量濃度組(28.86、57.72 mg/L)攝食量顯著減少，試驗后期出現(xiàn)停止攝食的情況。各組別試驗魚在整個試驗期間的生長性能見表1。5組試驗魚的初始體質(zhì)量為38.28～38.68 g，30 d時的試驗末體質(zhì)量為32.13～62.07 g，特定生長率為-0.60%/d～1.58%/d。28.86、57.72 mg/L組試驗末體質(zhì)量均低于其初始體質(zhì)量，因此，這2個試驗組的特定生長率均為負值，表明高質(zhì)量濃度氨氮對試驗魚的生長產(chǎn)生了明顯的抑制。組間試驗末體質(zhì)量、特定生長率呈現(xiàn)隨氨氮質(zhì)量濃度升高而遞減的趨勢，即對照組>7.22 mg/L組>14.43 mg/L組>28.86 mg/L組>57.72 mg/L組，Duncan′s多重比較結(jié)果均顯示，對照組和7.22 mg/L組間差異不顯著，并且這2組的生長性能顯著高于其他3個試驗組(P<0.05)；14.43、28.86 mg/L和57.72 mg/L組兩兩間均存在顯著差異。

表1 慢性氨氮脅迫下“新吉富”羅非魚幼魚的生長性能

注：同列數(shù)據(jù)上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05).

5組試驗魚在不同時段內(nèi)的特定生長率變化趨勢見圖1。在0～10 d、10～20 d和20～30 d時段，28.86、57.72 mg/L組的特定生長率均為負值，且57.72 mg/L組的特定生長率最低；在0～10 d和10～20 d時段，對照組特定生長率最高；在20～30 d時段，7.22 mg/L組特定生長率最高。Duncan′s多重比較結(jié)果顯示，在所有3個時段內(nèi)，28.86、57.72 mg/L組的特定生長率均顯著低于其余3個組(P<0.05)；在0～10 d時段，對照組、7.22 mg/L組的特定生長率顯著高于14.43 mg/L組(P<0.05)；在10～20 d時段，對照組的特定生長率顯著高于7.22、14.43 mg/L組(P<0.05)；在20～30 d時段，7.22 mg/L組的特定生長率顯著高于對照組和14.43 mg/L組(P<0.05)。

圖1 不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下“新吉富”羅非魚幼魚特定生長率的動態(tài)變化同一時間段內(nèi)，上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05).

2.2 血清生化指標分析

5組試驗魚血清中酸性磷酸酶活性的動態(tài)變化見圖2。在10 d時，7.22 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性最高，57.72 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性最低，7.22 mg/L組和對照組間血清酸性磷酸酶活性差異不顯著，14.43、28.86、57.72 mg/L組間血清酸性磷酸酶活性差異也不顯著，7.22 mg/L組、對照組的血清酸性磷酸酶活性均顯著高于其他3個組(P<0.05)；在20 d時，14.43 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性顯著高于其他4個組(P<0.05)，7.22 mg/L組、對照組的血清酸性磷酸酶活性均顯著高于28.86、57.72 mg/L組(P<0.05)，7.22 mg/L組和對照組間血清酸性磷酸酶活性差異不顯著，28.86、57.72 mg/L組間血清酸性磷酸酶活性差異也不顯著，57.72 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性最低；在30 d時，7.22 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性顯著高于其他4組(P<0.05)，57.72 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性最低，14.43 mg/L組和對照組間血清酸性磷酸酶活性差異不顯著，28.86、57.72 mg/L組間血清酸性磷酸酶活性差異也不顯著，14.43 mg/L組、對照組血清酸性磷酸酶活性均顯著高于28.86、57.72 mg/L組(P<0.05)。綜上，7.22、14.43 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性分別在30 d和20 d時顯著高于對照組(P<0.05)。在高質(zhì)量濃度氨氮作用下，28.86、57.72 mg/L組的血清酸性磷酸酶活性在整個試驗過程中均顯著低于對照組(P<0.05)，表明這兩個組的血清酸性磷酸酶活性受到了明顯的抑制，氨氮對“新吉富”羅非魚幼魚血清產(chǎn)生了明顯的毒性作用。

5組試驗魚血清中堿性磷酸酶活性的動態(tài)變化見圖3。在10 d時，對照組的血清堿性磷酸酶活性顯著高于其他4個組(P<0.05)，7.22、14.43、28.86 mg/L間血清堿性磷酸酶活性差異不顯著，且這3組的血清堿性磷酸酶活性均顯著高于57.72 mg/L組(P<0.05)；在20 d時，14.43 mg/L組的血清堿性磷酸酶活性顯著高于其他4個組(P<0.05)，對照組和7.22 mg/L組間血清堿性磷酸酶活性差異不顯著，并且這2組血清堿性磷酸酶活性均顯著高于28.86、57.72 mg/L組(P<0.05)，57.72 mg/L組的血清堿性磷酸酶活性最低；在30 d時，7.22 mg/L組的血清堿性磷酸酶活性最高，對照組和7.22 mg/L組間血清堿性磷酸酶活性差異不顯著，并且這2組血清堿性磷酸酶活性均顯著高于其他3組(P<0.05)，14.43、28.86 mg/L的血清堿性磷酸酶活性均顯著高于57.72 mg/L組(P<0.05)。綜上，7.22、14.43 mg/L組的血清堿性磷酸酶活性分別在30 d和20 d時高于對照組。在高質(zhì)量濃度氨氮作用下，28.86、57.72 mg/L組的血清堿性磷酸酶活性在整個試驗過程中均顯著低于對照組(P<0.05)，表明這2組的血清堿性磷酸酶活性受到了明顯的抑制，氨氮對“新吉富”羅非魚幼魚血清產(chǎn)生了明顯的毒性作用。

圖2 不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下“新吉富”羅非魚幼魚血清酸性磷酸酶活性動態(tài)變化同一時間內(nèi)，同列字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(P<0.05).下同.

圖3 不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下“新吉富”羅非魚幼魚血清堿性磷酸酶活性動態(tài)變化

5組試驗魚血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的動態(tài)變化見圖4。在10 d時，57.72 mg/L組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最高，對照組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最低，各組間血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性差異不顯著；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在20 d時和30 d時具有相同的變化趨勢，即57.72 mg/L組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于其他4組(P<0.05)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性呈現(xiàn)出隨氨氮質(zhì)量濃度升高而顯著升高的趨勢，57.72 mg/L組>28.86 mg/L>14.43 mg/L組>7.22 mg/L組>對照組，57.72、28.86、14.43 mg/L組的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，7.22 mg/L組和對照組間血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性差異不顯著。綜上，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨氨氮質(zhì)量濃度升高和脅迫時間的延長而顯著升高。

圖4 不同質(zhì)量濃度氨氮脅迫下“新吉富”羅非魚幼魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性動態(tài)變化

3 討 論

3.1 慢性氨氮脅迫對“新吉富”羅非魚幼魚生長性能的影響

大量研究表明，長期的氨氮脅迫可使魚類生長速度降低，隨著水體中非離子氨含量的升高和脅迫時間的延長，魚類攝食量下降，大部分能量用于機體的消耗，從而導致魚類生長率下降甚至生長停滯[8,21-24]。因此，在集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)中，將水體中非離子氨含量控制在不影響魚類生長的安全范圍內(nèi)顯得尤為重要。所謂安全限制含量，是指對水產(chǎn)動物生長、繁殖和生存沒有明顯影響的非離子氨含量[8]。許多學者通過實驗生態(tài)學方法研究了非離子氨對養(yǎng)殖魚類的安全限制含量。Alderson[25]曾報道，非離子氨對歐洲鰨(Soleasolea)和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚的安全限制質(zhì)量濃度分別為0.066 mg/L和0.11 mg/L。而Szumski等[26]認為，非離子氨對暖水性魚類的安全限制質(zhì)量濃度為0.08 mg/L。Person-Le Ruyet等[27]報道，非離子氨對大菱鲆幼魚的安全限制質(zhì)量濃度為0.18～0.33 mg/L。Foss等[21]的研究表明，當非離子氨質(zhì)量濃度大于0.06 mg/L時，大西洋鱈(Gadusmorhua)幼魚的日攝食量減少，特定生長率顯著低于對照組，大西洋鱈幼魚養(yǎng)殖水體中非離子氨的安全限制質(zhì)量濃度為0.06 mg/L。Lemarie等[22]研究發(fā)現(xiàn)，舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)幼魚質(zhì)量增加率與非離子氨質(zhì)量濃度成負相關(guān)，養(yǎng)殖水體中非離子氨的安全限制質(zhì)量濃度為0.26 mg/L。El-Shafai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當水體中非離子氨質(zhì)量濃度高于0.068 mg/L時，尼羅羅非魚幼魚特定生長率顯著低于對照組，由此提出尼羅羅非魚幼魚養(yǎng)殖水體中非離子氨的安全限制質(zhì)量濃度為0.068 mg/L。本研究中，當非離子氨質(zhì)量濃度為0.24 mg/L時，試驗魚的特定生長率與對照組間差異不顯著；當非離子氨質(zhì)量濃度為0.48 mg/L時，試驗魚的生長率顯著低于對照組，與已有研究結(jié)果相比，本研究中的“新吉富”羅非魚幼魚能耐受的非離子氨質(zhì)量濃度相對較高，究其原因，可能是因為魚類對非離子氨的耐受性存在種間差異，也可能與試驗魚規(guī)格、養(yǎng)殖密度及試驗條件(如pH、溫度、溶解氧及鹽度等)等不同有關(guān)。

此外，在本研究中，當水體中非離子氨質(zhì)量濃度為0.24 mg/L時，試驗魚在初始階段(0～10 d)、中間階段(10～20 d)和最后階段(20～30 d)的特定生長率分別為1.10%/d、1.23%/d和2.00%/d，呈逐漸升高的趨勢。這一結(jié)果與Foss等[21]對大西洋鱈慢性氨氮耐受性的研究結(jié)果類似，F(xiàn)oss等[21]研究表明，在整個96 d試驗的初始階段(0～28 d)，非離子氨質(zhì)量濃度為0.11 mg/L和0.17 mg/L試驗組的特定生長率分別比對照組降低11%和23%，而在試驗最后階段(57～96 d)，這兩個試驗組的特定生長率分別比對照組降低7%和9%，且與對照組間無顯著差異，試驗組的特定生長率呈緩慢升高的趨勢。在對花狼鳚(Anarhichasminor)[28]和舌齒鱸[22]的慢性氨氮脅迫研究中，也觀察到了類似的現(xiàn)象。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，可能是魚類對環(huán)境脅迫具有適應和自我調(diào)節(jié)能力，在慢性氨氮脅迫過程中，魚類機體能逐漸適應非離子氨的毒性，并通過多種方式阻止非離子氨在體內(nèi)的積累，如減少體內(nèi)氨的合成、加速氨的排泄、或?qū)鞭D(zhuǎn)化為無毒的物質(zhì)[29]。Randall等[30]研究發(fā)現(xiàn)，魚類通過減少體內(nèi)蛋白質(zhì)水解和氨基酸的代謝可以阻止氨氮在體內(nèi)的累積。許多魚類通過增加體內(nèi)谷氨酰胺合成酶的活性使氨氮快速轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，或者通過鳥氨酸尿素循環(huán)將氨氮轉(zhuǎn)化為尿素[29,31]。

3.2 慢性氨氮脅迫對“新吉富”羅非魚幼魚血清生化指標的影響

血液生化參數(shù)是反映魚體健康狀況和生理狀態(tài)的主要指標，也是魚類疾病診斷的依據(jù)之一，在慢性氨氮脅迫下，水體中的非離子氨通過魚鰓的吸收，進入血液，會對血細胞及血清中的酶類產(chǎn)生影響。酸性磷酸酶是一種對魚類的生理代謝有著重要影響的酶[32]，在魚類各組織器官中廣泛分布；堿性磷酸酶主要參與生物體對物質(zhì)的消化、吸收、轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)動物體內(nèi)鈣、磷的吸收，維持鈣、磷的平衡，是魚類生長發(fā)育的重要酶類之一[33]。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均參與了生物在環(huán)境毒物脅迫下產(chǎn)生的適應性反應，常用于評估環(huán)境毒物的毒性程度[34]。本研究中，血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性在慢性氨氮脅迫下的動態(tài)變化趨勢基本一致，即7.22、14.43 mg/L組的血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性分別在30 d和20 d時高于對照組，28.86、57.72 mg/L組的血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性在整個試驗過程中均顯著低于對照組(P<0.05)。究其原因，可能是血清中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶主要來源于血細胞[35]，在低質(zhì)量濃度氨氮(7.22 mg/L)長時間(30 d)脅迫下，或在較高質(zhì)量濃度氨氮(14.43 mg/L)較長時間(20 d)脅迫下，魚體血細胞受損，其中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶進入血漿；同時，魚體在氨氮脅迫下，可能產(chǎn)生了毒物興奮作用[36]，導致酸性磷酸酶、堿性磷酸酶誘導合成，從而引起血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性顯著上升。而在高質(zhì)量濃度氨氮(28.86、57.72 mg/L)脅迫下，血清的電解質(zhì)平衡遭到破壞，酸性磷酸酶、堿性磷酸酶誘導作用受到抑制，導致酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性顯著下降，這與Jee等[37]的研究結(jié)果類似。本研究表明，“新吉富”羅非魚幼魚血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶對氨氮具有一定耐受性，但超出生理耐受閾值后，其活性會受到顯著影響。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶是廣泛存在于動物組織細胞內(nèi)參與氨基酸合成與分解代謝的重要氨基轉(zhuǎn)移酶，催化谷氨酸與丙氨酸之間的氨基轉(zhuǎn)換，正常血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性不高，但當組織細胞，特別是肝臟和心臟等器官的細胞發(fā)生病變時，能引起血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性明顯升高。因此，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶是肝細胞受損最靈敏的指標之一[38]，其活性的增減可以反映機體中毒或病理變化。本研究中，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨氨氮質(zhì)量濃度升高和脅迫時間的延長而顯著升高。這與鯉魚(Cyprinuscarpio)[39]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[40]受氨氮脅迫后的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化趨勢相似。這可能是由于高質(zhì)量濃度氨氮脅迫導致機體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，肝細胞腫脹、壞死，管壁細胞與基膜分離、管壁破裂等，影響肝胰腺正常生理功能所致[40-41]。