功能性紅曲菌絲體的液態(tài)發(fā)酵制取方法

楊曉暾

(佛山市真紅生物制品有限公司，廣東佛山 528244)

真菌多糖在國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界稱之為免疫調(diào)節(jié)劑。紅曲菌絲體是利用微生物紅曲菌進行液態(tài)發(fā)酵、大規(guī)模生產(chǎn)最成功的天然微生物之一。多糖紅曲菌絲體蛋白質(zhì)含量非常豐富（含量為干重的36%以上），脂肪含量較低，具有高營養(yǎng)、低熱量的特點。同時，多糖紅曲菌絲體含有一定量的水溶性多糖，通過共價鍵與蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白聚糖發(fā)揮生物學(xué)功能，識別外來組織的細胞等；多糖類物質(zhì)在抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗氧化、抗感染、降血糖血脂和抗輻射、抗衰老中都表現(xiàn)出生物活性；在抗艾滋（AIDS）和抗腫瘤等難治性疾病研究中具有潛在的治療價值。因此，多糖紅曲菌絲體在不久的將來會成為眾人喜愛的健康食材。

因1995年法國學(xué)者P.J.Blanc等在紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到一種對人畜有害的真菌毒素桔霉素(Citrinin)，使紅曲菌產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)應(yīng)用受到限制，P.J.Blanc認為，桔霉素的產(chǎn)生與紅曲菌次生代謝產(chǎn)物的代謝偏高有關(guān)[2]。紅曲桔霉素含量的控制已被各生產(chǎn)企業(yè)定為攻關(guān)目標(biāo)。其代謝途徑與紅曲菌培養(yǎng)方式及培養(yǎng)基組成密切相關(guān)，同一菌株不同條件下可能產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素，不同條件下產(chǎn)桔霉素差異的形成可能與外界因素誘導(dǎo)基因組產(chǎn)生差異表達有關(guān)。日本厚生省在1999年頒布、2003年修訂的《日本食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)》中對紅曲色素的桔霉素含量做了限定，日本限量指標(biāo)定為0.2 mg/kg（色價基準(zhǔn)為5 u/g，1%），韓國食品和功能性食品限量為0.05 mg/kg。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：誘變菌株叢毛紅曲菌(Monascus pilosusZheng YZ101)。

試劑及耗材：馬鈴薯、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硝酸鈉，一切皆可食用的大米粉（除了農(nóng)殘和重金屬超標(biāo)）。

儀器設(shè)備：水浴鍋、752分光光度計、pH酸度計、酒度計、電子臺秤、高壓鍋、超凈臺、生化培養(yǎng)箱、烘箱、種子罐、發(fā)酵罐、烘干機、粉碎機等。

1.2 實驗方法[1]

1.2.1 培養(yǎng)基及方法

1.2.1.1 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基PDA：20%馬鈴薯1000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

分離培養(yǎng)基CYA：蔗糖3%，酵母膏5.0%，磷酸二氫鉀0.1%，硝酸鈉3%，硫酸鎂0.05%，蒸餾水1000 mL，1.5%瓊脂。

KMA：可溶性淀粉3%，麥芽糖3%，蛋白胨2%，瓊脂2%。

1.2.1.2 菌種選育

將已培養(yǎng)好的試管斜面種，接入裝有30～50 mL無菌水的三角瓶，置于搖床振蕩30～40 mL過濾，取10 mL孢子懸浮液，加到Φ9 mL的帶磁力棒的培養(yǎng)皿內(nèi)，在磁力攪拌下進行紫外照射（2～10 min），涂平板（用黑布包扎），于溫度32～35℃下培養(yǎng)6～8 d。

1.2.2 選育步驟[1]

(1)利用原生產(chǎn)菌種為母種，經(jīng)紫外誘變處理后接于平板培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，溫度32～35℃培養(yǎng)6～8 d，在培養(yǎng)過程中不定期觀察其生長變化情況，挑選有代表性的菌落接入試管斜面培養(yǎng)6～8 d。

(2)用已培養(yǎng)成熟的菌株作搖瓶跟蹤試驗，淘汰生長慢、發(fā)酵水平低的菌株，篩選生長快、高產(chǎn)多糖、蛋白具有代表性的分離種，再次進行培養(yǎng)基配方試驗。

A.斜面培養(yǎng)基：取麥芽汁10～20 Be作為通用培養(yǎng)基，煮沸，按重量比分別按40%～70%的量裝入試管或茄子瓶，滅菌，冷卻,接種，培養(yǎng)6～8 d。

B.斜面特制培養(yǎng)基：取按照重量百分比計算的可溶性淀粉8%～15%，硝酸鈉0.1%～0.3%，麥芽糖1%～5%，蛋白胨0.1%～0.5%，瓊脂2%～3%與水進行混合，煮沸，與步驟1中培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)基,分別按重量比40%～70%的量裝入試管或茄子瓶，滅菌，冷卻，接種培養(yǎng)6～8 d。

C.液態(tài)搖瓶培養(yǎng)基：選取淀粉8%～15%、硝酸鈉0.1%～0.3%、酵母膏0.1%～0.5%、玉米漿0.2%～0.5%與水進行混合、攪拌均勻，再用乳酸調(diào)節(jié)pH值為3.0～5.0，煮沸，形成液態(tài)搖瓶培養(yǎng)基，分別按重量40%～70%的量裝入三角瓶，滅菌，冷卻、接種搖瓶培養(yǎng)20～30 h。

1.2.3 搖瓶試驗

以米粉為碳源，玉米漿為有機氮源、NaNO30.2%～0.5%為無機氮源，稱重發(fā)酵液菌絲體收得率。

搖瓶配方①：米粉6%～8%，酵母膏0.2%～0.3%，玉米漿0.2%～0.3%，NaNO30.2%～0.5%，稱重發(fā)酵液菌絲體收得率，用乳酸調(diào)節(jié)初始pH3.5。

搖瓶配方②：米粉10%～12%，酵母膏0.2%～0.3%，玉米漿0.2%～0.5%，稱重發(fā)酵液菌絲體收得率，用乳酸調(diào)節(jié)初始pH3.5。

搖瓶配方③：米粉13%～15%，酵母膏0.2%～0.3%，玉米漿0.2%～0.5%，稱重發(fā)酵液菌絲體收得率，用乳酸調(diào)節(jié)初始pH3.5。

1.3 分析方法[4]

菌絲體粗蛋白的測定：凱氏定氮法GB/T 5009.5—2003。

菌絲體粗多糖的測定：水提醇沉法提取，直接干燥法測定。

精確稱取100目樣品10 g，放入250 mL三角瓶中加入300 mL蒸餾水（固液比1∶30），于90℃水浴中提取2 h，間隔振蕩幾次，取出后于3000 r/min，離心5 min去除菌體。將上清液減壓濃縮至50 mL（原體積的1/6），邊攪拌邊加入200 mL（4倍體積）乙醇，4℃沉淀10 h。將混合物移至離心管中3000 r/min，離心15 min，棄去上清液，沉淀（即粗多糖）于60℃干燥至恒重，稱重。

1.4 桔霉素的測定方法

檢測依據(jù)：保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范，中國衛(wèi)生部2003年版。

樣品經(jīng)TEF（固態(tài)樣）、乙醇（液態(tài)樣品）3次萃取后，微濾后直接進樣分析。

高效液相色譜儀及色譜條件：

儀器：HP1100；檢測器：熒光檢測器；(λex=331,λem=500)。

進樣量：5μL；溫度：28℃；流速：1 mL/min。

桔霉素含量計算公式：

其中：D：稀釋倍數(shù)；S2：樣品峰面積；S1：標(biāo)樣峰面積；C1：標(biāo)樣濃度（mg/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵速度的影響（圖1）

圖1 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵速度的影響

由圖1可知，紅曲液態(tài)發(fā)酵隨著溫度的升高而加快，當(dāng)溫度在28～35℃時，紅曲菌是最適生長溫度，菌絲體繁殖很快，37～40℃達到最高峰，超過40℃就會減緩其發(fā)酵速度至衰老。紅曲菌的生長對溫度較敏感，過高或過低都能明顯地影響其生長繁殖速度。在適宜的溫度范圍下，紅曲菌繁殖代謝旺盛，溫度過高或過低，都會直接影響其生長速度。

2.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)生菌絲體的影響（圖2）

由圖2可知，紅曲菌液態(tài)發(fā)酵隨著時間的延長，發(fā)酵液開始變稠，菌絲體就不斷地增多。在一定的濃度比、通風(fēng)比及最適生長溫度為（28～35℃）條件下，紅曲菌生長繁殖最快，發(fā)酵菌絲體隨著時間的延長而增多，在75～80 h達到最高，隨著發(fā)酵時間不斷延長，繁殖速度會減緩甚至死亡[3]。我們要控制好發(fā)酵工藝條件，及時分析檢測發(fā)酵液pH值、殘?zhí)?，在菌絲體最高濃度、最佳時間終止發(fā)酵。

圖2 發(fā)酵時間對產(chǎn)生菌絲體的影響

2.3 搖瓶試驗（表1）

分別對以上3種配方進行搖瓶分析檢測，所生產(chǎn)的紅曲菌絲體產(chǎn)品進行多糖、蛋白、桔霉素、洛伐他汀分析檢測，基本上未檢出桔霉素、洛伐他汀。經(jīng)多次試驗跟蹤表明，經(jīng)過紫外育種分離篩選的菌種，通過嚴格、特定的工藝控制，在既不產(chǎn)桔霉素和洛伐他汀同時，還可以高產(chǎn)紅曲多糖和紅曲蛋白含量。

2.4 發(fā)酵罐生產(chǎn)工藝[5]（30 m3）

采用工藝流程：米粉——定容（22.0 m3）——滅菌（0.1～0.15 MPa、30 min）——冷卻降溫（30～35℃）——接種（5%～10%）——發(fā)酵培養(yǎng)(65～80 h）——板框壓濾——菌絲體烘干（60～80℃）——粉碎過篩(100～200目)——產(chǎn)品包裝（多糖紅曲菌絲體）

發(fā)酵處理：將米粉發(fā)酵培養(yǎng)基按照重量百分比8%～15%、玉米漿0.2%～0.5%與水進行混合，攪拌均勻后泵入生產(chǎn)發(fā)酵罐，加入自來水至罐體有效體積的60%～80%，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為3.0～5.0，高溫滅菌后冷卻至常溫，將上述生產(chǎn)的液態(tài)搖瓶種接入發(fā)酵液培養(yǎng)基，進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，使菌株生長出紅曲菌絲體；高溫滅菌時間為30～40 min，溫度為121～125℃，壓力為0.1～0.15 MPa。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度為30～35℃，通風(fēng)比為1∶0.～0.6；發(fā)酵罐內(nèi)壓力為0.03～0.06 MPa，時間為65～80 h。

表1 搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果

發(fā)酵后處理：將已培養(yǎng)好的紅曲菌絲體，經(jīng)過壓榨、膜過濾后，分離出固體部分和液體部分。

收集菌絲體：將分離出的固體部分，即紅曲菌絲體，在溫度40～100℃下經(jīng)真空干燥、粉碎，得到功能性紅曲菌絲體粉末。

液態(tài)發(fā)酵制取功能性紅曲菌絲體的原料，不限于大米，也可以是谷類淀粉原料，如大麥、小麥、燕麥、蕎麥、玉米中的一種或幾種混合物制得的淀粉。

2.5 多糖紅曲深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件控制

2.5.1 濃度比

除了摸索紅曲菌合適的發(fā)酵生產(chǎn)配方外，碳、氮比，料液濃度比也是高產(chǎn)菌絲體、低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素最基本保證，一般控制碳、氮比8∶1.5較為合適；pH4.0～6.5條件下對紅曲菌生長有利。

2.5.2 溫度[6]

紅曲菌的最適生長溫度為32～35℃，從節(jié)能降耗考慮，相對提高紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)溫度，縮短發(fā)酵時間（65～80 h），便于生產(chǎn)控制。在篩選菌種時，我們對紅曲菌進行了特殊處理（如耐高溫、耐酸及耐高壓、嗜乙醇等），使篩選獲得的菌種具有性能穩(wěn)定和培養(yǎng)粗放的特點；相對升高紅曲菌發(fā)酵生長溫度(35～37℃)，不但可以節(jié)能降耗，而且還能提高發(fā)酵水平（即菌絲體收得率）、降低桔霉素產(chǎn)生[3]。

2.5.3 通風(fēng)比

紅曲菌屬于耗氧型微生物，在發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要一定的通風(fēng)量，通風(fēng)量大小直接影響紅曲菌生產(chǎn)過程中速度的快慢，對紅曲菌發(fā)酵繁殖代謝產(chǎn)生大量菌絲體，從而提高紅曲多糖和紅曲蛋白；通過發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的控制，可以不產(chǎn)洛伐他汀和桔霉素。如何保證紅曲菌生長旺盛期代謝力強、需氧量較大而不產(chǎn)桔霉素[6]，我們采取了降低發(fā)酵液的濃度比，使液體流動性增大，從而相對增加通風(fēng)量的同時可以降低溶解氧，因此而降低桔霉素的產(chǎn)量，通風(fēng)比值在1∶0.5～0.8較好。由于控制深層發(fā)酵過程中通風(fēng)量在不同時期有不同要求，應(yīng)根據(jù)具體發(fā)酵罐體積、濃度比等條件而定。

經(jīng)過多批次生產(chǎn)驗證，將所得多糖紅曲菌絲體分別抽樣送華南理工大學(xué)、廣東省微生物所等國內(nèi)權(quán)威檢測機構(gòu)分析檢測，其檢測結(jié)果基本一致。

2.5.4 多糖紅曲樣品中桔霉素含量的測定結(jié)果

從表1中檢測結(jié)果可以看出，紅曲菌絲體中的紅曲多糖和紅曲蛋白含量高，桔霉素和洛伐他汀含量未檢測出來，符合日韓最低限量標(biāo)準(zhǔn)。說明通過對紅曲菌的改造選育，在一定的工藝條件下，完全可以控制多糖紅曲產(chǎn)品中的桔霉素含量從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。

3 結(jié)論

液態(tài)發(fā)酵多糖紅曲菌絲體含有非常豐富的營養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)占36%，多糖5%～7%，脂肪3%左右，其中不飽和脂肪酸含量占總脂肪的70%，必需的脂肪酸占30%以上，并且富含多種微量元素，安全無毒，具有一定的降血脂、降糖功效，可以開發(fā)其紅曲菌絲體為保健功能食品[4]。

隨著大健康事業(yè)的發(fā)展，食療勝過醫(yī)療的理念會越來越被人們接受，藥食同源的多糖紅曲的應(yīng)用會越來越廣泛。我們將繼續(xù)進行更加細致、深入的研究，使液體深層發(fā)酵多糖紅曲菌絲體工藝不斷完善和改進，有效地控制桔霉素和洛伐他汀的產(chǎn)生，把多糖紅曲產(chǎn)品質(zhì)量進一步穩(wěn)定和提高，使中國千年瑰寶多糖紅曲真正走向世界、造福人類。