6種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法適用性試驗研究

陳 靜，嚴(yán) 佳，鐘桂香，宋洪濤

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院，福建 福州350025)

微生物限度檢查是保證藥品安全性的重要環(huán)節(jié)，采用通過方法適用性試驗的檢查方法是獲得可靠結(jié)果的基本保證[1]。復(fù)方氯霉素搽劑、復(fù)方苯甲酸搽劑、水楊酸搽劑、復(fù)方呋喃西林滴鼻液、苯酚甘油滴耳液和硼酸滴耳液均是醫(yī)院制劑中常見的外用給藥制劑，6種制劑均有不同程度的抑菌性[3]。中國藥典2015年版規(guī)定，應(yīng)先消除供試品的抑菌活性，再依法進(jìn)行檢查。為了避免消除抑菌成分的方法損傷藥品中污染的微生物，中國藥典規(guī)定在微生物計數(shù)法中，應(yīng)首先在供試液環(huán)節(jié)加入試驗菌株，如果供試品抑菌作用仍無法消除，再考慮經(jīng)處理后加入菌懸液進(jìn)行試驗[2]。因此本文依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107具體規(guī)則作為檢測依據(jù)，對加菌順序、沖洗量體積和供試液稀釋級別進(jìn)行摸索，對6個品種的微生物限度檢查方法進(jìn)行適用性試驗研究，消除制劑的抑菌性，建立準(zhǔn)確可靠的微生物限度檢查方法，以用于日常藥品質(zhì)量控制檢驗工作[2]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AE240精密電子天平(瑞士METTLER公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)； YP3001ND電子天平(上海精科有限公司)；MJPS-150型霉菌培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)； WJ-6無菌檢查儀(天津市羅根科技有限公司)；SW-CJ-1B凈化工作臺(蘇州太倉凈化設(shè)備廠)；LDZX-40KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 試藥

復(fù)方氯霉素搽劑(批號：180528、180727、181114)、復(fù)方苯甲酸搽劑(批號：180314、180615、180925)、水楊酸搽劑(批號：180524、180706、180821)、復(fù)方呋喃西林滴鼻液(批號：180320、180718、180905)、苯酚甘油滴耳液(批號：180509、180711、181105)和硼酸滴耳液(批號：180622、180726、181213)，均由聯(lián)勤保障部隊900醫(yī)院制備。

1.3 培養(yǎng)基、稀釋液和沖洗液

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：1612071)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1610252)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1609214)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：1611162)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：1703202)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基(批號：160309)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：170320)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：160826)；稀釋液及沖洗液：pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：1709062)。均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)，大腸埃希菌(Escherichiacoli)以上菌株均為第3代，均購自福建省藥檢所。

1.5 微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

復(fù)方氯霉素搽劑、復(fù)方苯甲酸搽劑和水楊酸搽劑為皮膚給藥制劑；酚甘油滴耳液和硼酸滴耳液為耳用制劑；復(fù)方呋喃西林滴鼻液為鼻用制劑。皮膚給藥制劑和耳用制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下：需氧菌總數(shù)不超過100 cfu/ml(1 ml或1 g 可接受的最大菌數(shù)為200)，霉菌和酵母菌總數(shù)不超過10 cfu/ml(1 ml或1 g可接受的最大菌數(shù)為20)，不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(1 ml)[2]。鼻用制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下：需氧菌總數(shù)不超過100 cfu/ml(1 ml或1 g 可接受的最大菌數(shù)為200)，霉菌和酵母菌總數(shù)不超過10 cfu/ml(1 ml或1 g可接受的最大菌數(shù)為20)，不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(1 ml)[2]。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

取經(jīng)(30～35)℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物和經(jīng)(20～25)℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物1 ml，加9 ml pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液，10倍遞增稀釋，制成適宜濃度的菌懸液。

取經(jīng)(20～25)℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，并將孢子過濾至無菌試管內(nèi)，取孢子液1 ml用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋，制成適宜濃度的菌懸液。

2.2 供試液制備

從兩支供試品中各取5 ml，共10 ml，加pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，攪拌混勻，作為1:10供試液。從1∶10供試液中取50 ml，加入pH 7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，充分混勻，作為1∶20供試液。

2.3 回收比值的計算

試驗組的回收比值=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液對照組平均菌落數(shù)

2.4 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.4.1試驗組(供試液經(jīng)過處理后加菌)

(1)需氧菌總數(shù)計數(shù)：取供試液10 ml(每膜)，經(jīng)薄膜過濾后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次沖洗100 ml，沖洗次數(shù)不大于10次，在最后一次沖洗液中分別加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液1 ml(含菌不大于100 cfu/ml)，混勻，過濾。將濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃倒置培養(yǎng)3 d，計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基平行制備兩張濾膜。

(2)霉菌、酵母菌總數(shù)計數(shù)：取供試液10 ml(每膜)，經(jīng)薄膜過濾后，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次沖洗100 ml，沖洗次數(shù)不大于10次，在最后一次沖洗液中分別加入白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液1 ml(含菌不大于100 cfu/ml)，混勻，過濾。將濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，25 ℃倒置培養(yǎng)5 d，計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基平行制備兩張濾膜。

2.4.2試驗組(供試液制備時加菌)

(1)需氧菌總數(shù)計數(shù)：分別取1∶10供試液100 ml于5個滅菌錐形瓶中，分別加入上述稀釋至10-6的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液1 ml，使其最終濃度為每膜不大于100 cfu菌液，混勻后取10 ml經(jīng)薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗數(shù)次(不大于10次)，每次沖洗量為100 ml，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，置35 ℃倒置培養(yǎng)3 d，計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基平行制備兩張濾膜。

(2)霉菌、酵母菌總數(shù)計數(shù)：分別取1:10供試液100 ml于2個滅菌錐形瓶中，分別加入上述稀釋至10-6的白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液1 ml，使其最終濃度為每膜不大于100 cfu菌液，混勻后取10 ml經(jīng)薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗數(shù)次(不大于10次)，每次沖洗量為100 ml，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，置25 ℃倒置培養(yǎng)5 d，計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基平行制備兩張濾膜。

2.4.3菌液對照組

取稀釋液代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌液進(jìn)行微生物回收試驗。

2.4.4供試品對照組

取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，其他操作同試驗組。

2.4.5驗證結(jié)果

6種樣品分別在供試液制備環(huán)節(jié)和供試液經(jīng)過處理后(薄膜過濾法最后一次沖洗液中)加菌，進(jìn)行回收比值的測定，結(jié)果見表1。加菌方式欄中A代表在供試液制備環(huán)節(jié)加菌可使各試驗菌種的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，B代表在供試液經(jīng)過處理后加菌可使各試驗菌種的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)。除了復(fù)方苯甲酸搽劑，其余5種樣品運(yùn)用同一種方法在兩種加菌環(huán)節(jié)進(jìn)行測定，試驗菌種的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，加菌順序?qū)Y(jié)果不會產(chǎn)生影響。復(fù)方苯甲酸搽劑經(jīng)薄膜過濾法處理后，在最后一次沖洗液中加菌，微生物計數(shù)方法為1∶10供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜700 ml，將加菌順序前移至供試液制備環(huán)節(jié)，需增加供試液的稀釋倍數(shù)，微生物計數(shù)方法為1∶20供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜300 ml。結(jié)果表明，雖然6種樣品都有一定的抑菌作用，但是加菌順序?qū)?種樣品的影響不大，最終均選擇更為科學(xué)合理的加菌方式——供試液制備環(huán)節(jié)加菌。

在供試液制備環(huán)節(jié)加菌，6種樣品的回收比值結(jié)果見表2，復(fù)方氯霉素搽劑需氧菌總數(shù)、真菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)方法為1:10供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜500 ml；復(fù)方苯甲酸搽劑需氧菌總數(shù)、真菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)方法為1∶20供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜300 ml；水楊酸搽劑需氧菌總數(shù)、真菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)方法為1∶10供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜400 ml；復(fù)方呋喃西林滴鼻液1∶10供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜600 ml；苯酚甘油滴耳液1∶10供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜500 ml和硼酸滴耳液1∶10供試液(每膜10 ml)，沖洗量每膜300 ml。5種試驗菌種的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，符合中國藥典2015版四部通則1105微生物計數(shù)法的要求，方法科學(xué)有效。

表1 6種樣品微生物計數(shù)法適用性試驗薄膜過濾法條件及加菌方式

注：A.供試液制備環(huán)節(jié)加菌；B.供試液經(jīng)過處理后(薄膜過濾法最后一次沖洗液中)加菌

表2 6種樣品需氧菌總數(shù)、真菌和酵母菌總數(shù)回收比值(n=3)

2.5 控制菌檢查方法的驗證

2.5.1銅綠假單胞菌檢查方法的驗證

(1)試驗組：取1∶10供試液10 ml，經(jīng)薄膜過濾后，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 ml，沖洗數(shù)次(不大于10次)，在最后一次沖洗液中加入銅綠假單胞菌的菌懸液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混勻，過濾。取出濾膜，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，(30～35)℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物劃線接種至溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中，(30～35)℃培養(yǎng)72 h。

(2)陰性對照組：取稀釋液10 ml代替供試液，不加菌液，其他操作同試驗組。

(3)陽性對照組：取稀釋液10 ml代替供試液，其他操作同試驗組。

(4)供試品對照組：取稀釋液1 ml代替菌液，其他操作同試驗組。

2.5.2金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證

(1)試驗組：取1:10供試液10 ml，經(jīng)薄膜過濾后，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 ml，沖洗數(shù)次(不大于10次)，在最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌的菌懸液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混勻，過濾。取出濾膜，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，(30～35)℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中，(30～35)℃培養(yǎng)72 h。

(2)陰性對照組：取稀釋液10 ml代替供試液，不加菌液，其他操作同試驗組。

(3)陽性對照組：取稀釋液10 ml代替供試液，其他操作同試驗組。

(4)供試品對照組：取稀釋液1 ml代替菌液，其他操作同試驗組。

2.5.3大腸埃希菌檢查方法的驗證

(1)試驗組：取1:10供試液10 ml，經(jīng)薄膜過濾后，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 ml，沖洗數(shù)次(不大于10次)，在最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌的菌懸液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混勻，過濾。取出濾膜，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，(30～35)℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物1 ml接種至含100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)48 h；取麥康凱液體培養(yǎng)基劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)72 h。

(2)陰性對照組：取稀釋液10 ml代替供試液，不加菌液，其他操作同試驗組。

(3)陽性對照組：取稀釋液10 ml代替供試液，其他操作同試驗組。

(4)供試品對照組：取稀釋液1 ml代替菌液，其他操作同試驗組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

2.5.4驗證結(jié)果

由表3和表4可知，6種樣品的控制菌檢查法都是薄膜過濾法，培養(yǎng)基稀釋體積均為100 ml，試驗組和陽性對照組正常檢出，陰性對照阻和供試品對照組未檢出，符合中國藥典2015版四部通則1106控制菌檢查的要求。

表3 6種樣品控制菌檢查方法適用性試驗薄膜過濾法條件

表4 6種樣品控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果(n=3)

注：表中“-”代表無菌落生長；“+”表示典型菌落生長；“/”表示無需進(jìn)行實驗

3 討論

醫(yī)院制劑是醫(yī)院臨床用藥不可或缺的部分，由于醫(yī)院制劑主要在本院臨床中使用，生產(chǎn)規(guī)模一般不大，設(shè)備相對簡單，制劑質(zhì)量易存在不穩(wěn)定的風(fēng)險，因此需嚴(yán)格按照2015版《中國藥典》的規(guī)定，進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗，保證制劑質(zhì)量的安全可控[4-5]。2015版《中國藥典》微生物限度檢查方法適用性試驗與USP等國際方案趨向一致，更為科學(xué)有效[6-7]。

本文按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107具體規(guī)則作為檢測依據(jù)，確立了6種外用醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法。6種制劑均有一定的抑菌性，且易溶于水，采用薄膜過濾法可快速、有效地去除藥品中所含有的抑菌性，提高檢驗的效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-9]。《中國藥典》2015版四部將加菌提前至供試液制備環(huán)節(jié)，不僅考慮樣品因素對檢驗的影響，同時考慮了檢驗過程特別是供試液制備過程的影響，更貼近藥品在生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸過程中微生物污染的實際情況，提高試驗的科學(xué)性[10]。本研究中6種醫(yī)院制劑均將加菌順序前移至供試液制備環(huán)節(jié)，復(fù)方氯霉素搽劑、水楊酸搽劑、苯酚甘油滴耳液、硼酸滴耳液和復(fù)方呋喃西林滴鼻液均可達(dá)到規(guī)定的回收比值，復(fù)方苯甲酸搽劑采用更高的供試液稀釋級后，回收比值可達(dá)到規(guī)定。本研究建立的方法可為含抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法適用性試驗的研究提供思路。