基于微透析技術(shù)的苦參堿凝膠經(jīng)皮給藥的藥動(dòng)學(xué)研究

顧 清，周劍斌，徐劍良，朱國(guó)花，舒 薇

(上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院藥劑科,上海 200070)

苦參堿(matrine)為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.、苦豆子S.alopecuroides.L、 廣豆根S.subprostrata chun et T.chen等中藥的活性成分，具有抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗心率失常、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗病毒及免疫抑制等藥理活性[1-3]?？鄥A單用或與其他藥物配伍外敷，對(duì)于濕疹、神經(jīng)性皮炎、銀屑病等疾病具有良好的治療效果[4]。

微透析(MD)是一種新的生物取樣技術(shù)[5]。在經(jīng)皮微透析技術(shù)中，微透析探針具有“人造血管”的特點(diǎn)，探針植入皮下并與體內(nèi)的藥物達(dá)到平衡后可直接反映皮膚中的藥物濃度。與傳統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)分析方法相比，經(jīng)探針透析膜過濾的透析液“信號(hào)分子”可以更加客觀地反映組織中的藥物代謝情況；且對(duì)皮膚幾乎無(wú)損傷。該技術(shù)具有在體(in vivo)、原位(in situ)取樣和能夠在線(on line)、實(shí)時(shí)(real time)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，使其特別適用于藥物經(jīng)皮吸收研究[6-7]。

本研究利用增量法(Gain法)和減量法(Loss法)校正皮膚線性探針和血液同心圓探針的體內(nèi)回收率，建立可同步反映皮膚和血液中藥物濃度的微透析系統(tǒng)，并結(jié)合LC/MS分析技術(shù)，研究苦參堿凝膠經(jīng)皮給藥制劑在皮膚和血液中的藥動(dòng)學(xué)過程。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；磁力攪拌器(予華儀器有限責(zé)任公司，鄭州)。

微透析設(shè)備 (BAS公司，USA)，包括：灌注器推進(jìn)泵(Baby Bee Syringe Drive，MD1001)、灌注器(1 ml Bee Stinger Gastight Syringer，MD0100)、灌注器架(Bracket for Baby Bee，MD1002)、流速控制器(Work Bee Controller，MD1000，MD-1020)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)含 Na2HPO43.191 g/L、 NaH2PO40.775 g/L、 NaCl 5.58 g/L；線性探針(膜長(zhǎng)20 mm，膜截留相對(duì)分子質(zhì)量：5000 000)、同心圓探針(自制，膜長(zhǎng)10 mm，膜截留相對(duì)分子質(zhì)量：5000 000)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保溫墊(自制)。

1.2 試劑

苦參堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110805-201709)；苦參堿原料藥(西安華萃生物技術(shù)有限公司，純度98%，批號(hào)：SH20170120)；磷酸可待因?qū)φ掌?中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：171203-201706)；苦參凝膠(貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司)； NaH2PO4·2H2O (廣東金砂化工廠，分析純)；Na2HPO4·12H2O(廣東金砂化工廠，分析純)； H3PO4(蘇州振亞化工廠，分析純)；甲酸胺(美國(guó)Sigma公司，色譜純)；乙腈(德國(guó)Merck公司,色譜純)；水為三蒸水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重：180～220 g(海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(滬)2017-0002)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent SB C18柱(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-25 mmol/L甲酸胺 (75∶25,V/V)；流速：0.3 ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：5 μl；運(yùn)行時(shí)間：2 min；

質(zhì)譜條件：離子源：ESI源；輔助霧化氣(N2)壓力：40 psi；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣(N2)溫度：350℃；流量：10 L/min；正離子模式檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；碰撞誘導(dǎo)解離電壓 (CID)：35 eV(苦參堿)、28 eV(內(nèi)標(biāo)可待因)；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為：m/z249→148 (苦參堿)和m/z300→215(可待因)；碰撞能量：20 eV。

圖1 苦參堿LC-MS離子掃描質(zhì)譜圖

圖2 可待因LC-MS離子掃描質(zhì)譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密稱取苦參堿、可待因?qū)φ掌?內(nèi)標(biāo))適量，置于容量瓶中并定容，配制成濃度分別為3、1 μg/ml的母液，于4℃冰箱冷藏。精密吸取適量的苦參堿和可待因母液，并用PBS將苦參堿稀釋至1、5、10、50、100、500、1000 ng/ml的系列濃度(每個(gè)樣品中可待因含量均為20 ng/ml，按上述LC/MS條件依次進(jìn)樣。以面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.0 897C-2.344，r=0.9999。結(jié)果表明，苦參堿濃度在1～1 000 ng/ml范圍內(nèi)，吸收峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn)

取低、中、高濃度分別為10、100、500 ng/ml的苦參堿對(duì)照品溶液，分別于日內(nèi)0、4、8、12、24 h和日間1、2、3 d按照“2.1”項(xiàng)下LC/MS條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄苦參堿的吸收峰面積。日內(nèi)精密度RSD分別為2.70%、1.79%、0.75%(n=6)，日間精密度RSD分別為3.55%、2.46%、1.45%(n=6),結(jié)果表明本方法精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性考察

取濃度為100 ng/ml的苦參堿參比溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)行LC/MS檢測(cè)，各時(shí)間點(diǎn)的吸收峰面積結(jié)果依次為661、662、660、657、659，不同時(shí)間點(diǎn)的吸收峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.29%(n=6)，表明樣品溶液在配制后8 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取濃度為10、100、500 ng/ml的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并將以上3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入到已知濃度的苦參堿樣品溶液中，測(cè)定混合溶液中苦參堿的總濃度，并計(jì)算樣品的加樣回收率。平均回收率分別為97.23%、98.76%、101.25%,RSD值分別為2.88%、2.24%、1.29%。結(jié)果表明苦參堿回收率良好，樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求。

2.3 線性和同心圓探針的體外回收率

分別采用增量法和減量法探究藥物濃度對(duì)兩種探針的體外回收率影響。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，將灌流液的灌注速度設(shè)為2 μl/min。

2.3.1皮膚線性探針體外回收率

增量法測(cè)定回收率：將皮膚線性探針的半透膜完全浸入到溫度為(37±0.5)℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的苦參堿磷酸緩沖鹽(PBS)溶液(Cin=10、20、50 ng/ml)中。以PBS平衡探針1 h后開始收集探針透析液，每次收集體積為40 μl，連續(xù)收集5次。根據(jù)“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定透析液中藥物濃度Cout。線性探針體外增量法回收率(RG%)的計(jì)算公式(1)如下：

RG%=Cout/Cin×100%

(1)

減量法測(cè)定回收率：將皮膚線性探針的半透膜完全浸入到溫度為(37±0.5)℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的PBS溶液中。分別以灌流速度為2 μl/min苦參堿PBS溶液(Cin=10、20、50 ng/ml)為灌流液，探針經(jīng)灌流液平衡1 h后，每20 min收集一次透析液，并連續(xù)收集5次。根據(jù)“2.1項(xiàng)”LC/MS條件測(cè)定透析液中的藥物濃度Cout。線性探針體外減量法回收率(RL%)按照公式(2)計(jì)算：

RL%=(Cin-Cout)/Cin×100%

(2)

線性和同心圓探針的RG和RL的體外回收率結(jié)果如表1所示。

表1 皮膚線性探針體外回收率(n=5)

2.3.2血管同心圓探針體外回收率

增量法測(cè)定回收率：將血液同心圓探針的半透膜完全浸入苦參堿PBS溶液(Cin=50、100、200 ng/ml)中。其余測(cè)定同“2.3.1”項(xiàng)下增量法測(cè)定回收率操作。

減量法測(cè)定回收率：將血液同心圓探針的半透膜完全浸入PBS溶液中。分別以灌流速度為2 μl/min苦參堿PBS溶液(Cin=50、100、200 ng/ml)為灌流液。其余測(cè)定同“2.3.1”項(xiàng)下減量法測(cè)定回收率操作。同心圓探針的體外回收率結(jié)果如表2所示。

表2 血管同心圓探針體外回收率(n=5)

表1、表2的體外回收率結(jié)果顯示，以不同濃度的藥物作為灌流液或探針?biāo)幉煌幬餄舛戎?，采用增量和減量?jī)煞N方法測(cè)定的線性和同心圓探針體外回收率基本一致，表明苦參堿的濃度對(duì)以上兩種探針的體外回收率無(wú)顯著性影響。

2.4 線性和同心圓探針的體內(nèi)回收率

2.4.1手術(shù)方法

在實(shí)驗(yàn)前24 h先將大鼠的腹部脫毛處理，用25%烏拉坦麻醉大鼠，麻醉給予量為：0.4 ml/100 g(ip)，大鼠麻醉后，將其固定于保溫墊上(37.5℃左右)。線性探針植入皮下的方法：在18G穿刺針引導(dǎo)下將線性探針半透膜埋入皮下。同心圓探針埋入頸靜脈方法：在大鼠頸部剪開1 cm左右的小口，用鑷子將頸靜脈鈍性分離，并將靜脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，將同心圓探針插入血液充盈的血管，并用手術(shù)線將探針和靜脈固定，最后縫合傷口，消毒。

2.4.2皮膚探針的體內(nèi)回收率校正

在穿刺針的引導(dǎo)下將線性探針的半透膜埋入皮下，用10、20、50 ng/ml(Cin)苦參堿的PBS溶液以2 μl/min的速度進(jìn)行灌注。灌注平衡1 h后開始收集皮膚組織透析液，單次收集量為40 μl，并連續(xù)收集5次并測(cè)定組織透析液中的藥物濃度。皮膚探針的RL%結(jié)果如表3所示。

表3 皮膚線性探針體內(nèi)回收率(n=5)

2.4.3同心圓探針體內(nèi)回收率的校正

按照“2.4.1”項(xiàng)下手術(shù)方法將同心圓探針置于頸靜脈，按照“2.3.2”項(xiàng)下體外回收率的測(cè)定方法，分析灌注液濃度對(duì)同心圓探針體內(nèi)回收率的影響，利用公式(2)計(jì)算同心圓探針的體內(nèi)回收率(RL%)。結(jié)果如表4所示。

表4 血管同心圓探針體內(nèi)回收率(n=5)

體內(nèi)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3、4)顯示，線性探針、同心圓探針在以不同濃度的苦參堿進(jìn)行灌注得到的體內(nèi)回收率(RL%)之間無(wú)顯著性差異，表明藥物濃度對(duì)回收率影響較小，經(jīng)不同灌注濃度處理的探針回收率之間無(wú)顯著性差異。

皮膚線性探針和血液同心圓探針的體內(nèi)平均RL%分別為(42.7±2.4)%和(25.0±1.9)%；同種探針的體外回收率(RG%和RL%)結(jié)果基本一致，因此可以采用體外增量回收率(RG%)和減量回收率(RL%)的校正系數(shù)以及體內(nèi)減量回收率(RL%)計(jì)算兩種探針的體內(nèi)增量回收率(RG%)，并利用校正的體內(nèi)回收率(Rin vivo)和測(cè)得的皮膚組織和血液透析液濃度(Cdialysis)換算體內(nèi)藥物的真實(shí)濃度(C)，計(jì)算公式如公式(3)所示。

C=Cdialysis/Rin vivo

(3)

2.5 苦參堿凝膠在皮膚、血液中的藥動(dòng)學(xué) [8-10]

將SD大鼠腹部脫毛，待皮膚恢復(fù)24 h后，根據(jù)“2.4.1”的手術(shù)方法將線性探針植入皮下、將同心圓探針植入頸靜脈中，建立可同時(shí)分析藥物在皮膚和血液中藥動(dòng)學(xué)過程的皮膚-血液雙位點(diǎn)同步微透析系統(tǒng)。以速度為2 μl/min的PBS平衡探針1 h，于大鼠腹部給予3% 苦參堿凝膠，并用聚乙烯薄膜覆蓋，給藥劑量：4.5 mg/cm2，給藥面積：3×4 cm2。在給藥后收集透析液，以收集40 μl為一個(gè)樣品收集間隔，并進(jìn)行定量，并連續(xù)收集12 h。根據(jù)公式(3)換算成其在皮膚組織液和血液中的實(shí)際藥物濃度?？鄥A在皮膚和血液中的藥物濃度-時(shí)間曲線如圖3、4所示。使用Kinetica5.0軟件分析在給藥部位(皮膚)和全身(血液)中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表6所示。

圖3 皮膚中苦參堿濃度-時(shí)間曲線圖

圖4 血液中苦參堿濃度-時(shí)間曲線圖

表6 經(jīng)皮給藥后苦參堿在皮膚和血液中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，皮膚給予苦參堿凝膠后，皮膚中的藥物濃度顯著高于血液中的濃度，且皮膚中的藥物濃度變化更加平穩(wěn)，間接反映出苦參堿凝膠制劑良好的透皮能力和局部治療效果。

3 討論

微透析技術(shù)可直接對(duì)細(xì)胞外液進(jìn)行采樣，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人體藥動(dòng)學(xué)研究。可以同步檢測(cè)藥物在不同身體部位的代謝過程，具有傳統(tǒng)藥動(dòng)學(xué)分析方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)。然而，其在中藥透皮遞藥系統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)研究中應(yīng)用并不廣泛。課題組建立皮膚-血液雙位點(diǎn)同步微透析系統(tǒng)，并用于研究苦參堿在皮膚組織和血液中的吸收和代謝情況。通過體外和體內(nèi)評(píng)價(jià)，探討了微透析系統(tǒng)結(jié)合LC/MS技術(shù)分析苦參堿藥動(dòng)學(xué)的可行性。

微透析探針的體內(nèi)和體外回收率是該方法真實(shí)反映體內(nèi)藥物濃度的關(guān)鍵。灌注液的灌流速度、組織溫度、取樣部位、待測(cè)藥物理化性質(zhì)、透析膜以及藥物與透析膜的化學(xué)交互作用等均可影響微透析探針的回收率。微透析探針的體外相對(duì)回收率受到透析膜內(nèi)外濃度差形成的擴(kuò)散、清除等影響；而影響體內(nèi)回收率的因素更多，包括動(dòng)物間的個(gè)體差異、血管探針插入頸靜脈的深度，探針半透膜與血液的接觸面積等[11]。本研究建立的皮膚-血液雙位點(diǎn)同步微透析技術(shù)可以較好地解決這一問題，獲得滿意的回收率，可用于苦參堿凝膠的藥動(dòng)學(xué)研究。